Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Summary

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.

Abstract

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157: H7 wurde für beide wasserbasierte verbunden und lebensmittelbedingten Erkrankungen, und bleibt eine Bedrohung trotz der Nahrung und Wasser-Screening-Methoden verwendet derzeit. Während konventionelle bakterielle Nachweisverfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (ELISA) speziell Pathogene Verunreinigungen erkennen können, benötigen sie umfangreiche Probenvorbereitung und lange Wartezeiten. Darüber hinaus sind diese Praktiken fordern anspruchsvolle Laborgeräte und Einstellungen, und müssen von ausgebildeten Fachleuten ausgeführt werden. Hierin wird ein Protokoll für eine einfachere diagnostische Technik vorgeschlagen, die die einzigartige Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Parameter in ein Nanopartikel-basierte Plattform bietet. Die vorgeschlagenen multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) erkennt E. Coli O157: H7 Kontamination mit so wenig wie 1 koloniebildenden Einheit in Lösung innerhalb von weniger als 1 h vorhanden. Darüber hinaus die Fähigkeit der MFnS hochfunktionelle in komplexen Medien bleiben wie Milch und Wasser des Sees verifiziert wurde. Weitere Besonderheit Assays dienten auch die Fähigkeit des MFnS, nur zu erkennen, die gezielt Bakterien, auch in Gegenwart von ähnlichen Bakterienarten nachweisen. Die Kopplung der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von Pathogenkontamination in einer Vielzahl von Zusammenschlüssen, seine hohe Leistung in beiden frühen und späten Stadium Fremdkörpererkennung ausstellen. Wirksamkeit, Erschwinglichkeit und Übertragbarkeit von der MFnS machen sie einen idealen Kandidat für Point-of-Care-Screening für bakterielle Verunreinigungen in einer Vielzahl von Einstellungen, von aquatischen Stauseen zu kommerziell verpackten Lebensmitteln.

Introduction

Das dauerhafte auftreten der bakteriellen Kontamination in beiden kommerziell produzierte Lebensmittel und Wasser-Quellen müssen zunehmend schnellen und spezifischen diagnostischen Plattformen geschaffen hat. ^{1 , 2} einige der häufigeren bakterielle Verunreinigungen für Nahrung und Wasser Kontamination verantwortlich sind aus den Salmonellen, Staphylokokken, Listerien, Vibrio, Shigella, Bacillus und Escherichia Gattungen. ^{3 , 4} bakterielle Kontamination durch diese Erreger häufig führt zu Symptomen wie Durchfall, Fieber, Cholera und Gastroenteritis. ⁴ Kontamination von Wasser-Quellen oft hat drastische und nachteilige Auswirkungen auf die Gemeinden ohne Zugang zu ausreichend gefiltertes Wasser und Kontamination von Lebensmitteln führte zu zahlreichen Erkrankungen und Produkt-Rückruf-Bemühungen. ^{5 , 6}

Um das Auftreten von Erkrankungen durch bakterielle Kontamination zu reduzieren, wurden eine Reihe von Maßnahmen, Methoden zu entwickeln, mit denen Wasser und Nahrung effizient vor Verkauf oder Verbrauch gescannt werden können. ³ Techniken wie PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,12 Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung) Lampe),^13,14 u. a.^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} haben vor kurzem für die Erkennung von verschiedenen Krankheitserregern verwendet worden. Im Vergleich zu traditionellen bakterielle Kultivierung Methoden, sind diese Techniken wesentlich effizienter im Hinblick auf Spezifität und Zeit. Diese Techniken kämpfen noch mit falsch positive und negative, komplexe Verfahren und Kosten. ^{1 , 3 , 25} es ist aus diesem Grund, dass multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) als eine alternative Methode für bakterielle Erkennung vorgeschlagen werden.

Diese Nanosensoren Paaren eindeutig zusammen magnetische Entspannung und fluoreszierende Modalitäten, so dass für eine Dual-Erkennung-Plattform, die eine schnelle und genaue. Mit E. Coli O157: H7 als eine Verunreinigung der Probe, zeigt die Fähigkeit des MFnS, so wenig wie 1 KBE innerhalb von Minuten erkennen. Erreger-spezifischen Antikörper werden verwendet, um die Spezifität zu erhöhen, und die Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von bakteriellen Verunreinigungen in beiden Bereichen Low - und High-Kontamination. ¹⁶ bei bakteriellen Kontamination werden die Nanosensoren um die Bakterien durch die gezielten Fähigkeiten der Erreger-spezifischen Antikörper schwärmen. Die Bindung zwischen der magnetische Nanosensoren und Bakterien schränkt die Interaktion zwischen der magnetischen Eisenkern und die umliegenden Wasser Protonen. Dies bewirkt eine Erhöhung der T2-Relaxationszeiten von magnetischen Relaxometer aufgenommen. Da die Konzentration von Bakterien in Lösung steigt zu zerstreuen die Nanosensoren mit der erhöhten Anzahl von Bakterien, was zu niedrigeren T2-Werten. Im Gegensatz dazu erhöht Fluoreszenzemission proportional mit der Konzentration von Bakterien durch die gestiegene Zahl der Nanosensoren direkt pathogen gebunden. Zentrifugation der Proben und Isolation des bakteriellen Pellets werden nur die Nanopartikel direkt angeschlossen, die Bakterien, entfernen alle schwebenden Nanosensoren und direkt korrelieren die Fluoreszenz-Emission mit der Anzahl der sparen Bakterien in Lösung. Eine schematische Darstellung dieses Mechanismus ist in Abbildung 1dargestellt.

Diese MFnS-Plattform wurde mit Point-of-Care-Screening im Auge, was zu Low-Cost und tragbaren Eigenschaften entwickelt. MFnS sind bei Raumtemperatur stabil und müssen dann nur in sehr geringen Konzentrationen für präzise Erkennung von bakteriellen Verunreinigungen. Darüber hinaus nach der Synthese, Einsatz von der MFnS ist einfach und erfordert nicht die Verwendung von ausgebildeten Fachleuten auf dem Gebiet. Schließlich ermöglicht dieses Diagnoseplattform für hochgradig anpassbare targeting, ein Mittel, durch welche diese eine Plattform verwendet werden, um Krankheitserreger aller Art in vielen verschiedenen Einstellungen zu erkennen.

Protocol

1. Synthese und Funktionalisierung von multiparametrischen Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS).

1. Synthese von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs)
   1. zur Vorbereitung der IONP Synthese, bereiten die folgenden 3 Lösungen: Lösung 1: FeCl ₃ (0,70 g) und FeCl ₂ H ₂ O (2 mL), Lösung 2: NH ₄ OH (2,0 mL, 13,4 M) H ₂ O (15 mL) und Lösung 3: Polyacryl Säure (0,855 g) H ₂ O (5 mL).
   2. Lösung 1 90 µL 2 M Salzsäure (HCl) hinzu und dann mischen Sie mit Lösung 2 sofort beim Aufschütteln bei 875 UPM. Dann fügen Sie Lösung 3. Bereich für 60 min. weiter
   3. Zentrifuge für 20 min bei 1.620 x g. Zentrifugieren den Überstand für 20 min bei 2.880 x g.
   4. Reinigen den endgültigen Überstand über Dialyse. Hinzufügen den Überstand auf eine Dialyse-Tasche (MWCO 6 − 8 K) und legen Sie sie in einen Becher mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4) und Spin-Bar. Lassen Sie es für 12 h, ersetzen mit frischen Puffer alle 2-3 h einweichen
2. Konjugation von Target-spezifische Antikörper auf der Oberfläche des IONPs
   1. bereiten die folgenden vier Lösungen: Lösung A: 5 mg 1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) in 250 µL MES [2-(N- Morpholino) Ethanesulfonic Säure] Puffer (0,1 M, pH = 6,8), Lösung B: 3 mg des N-Hydroxysuccinimide (NHS) in 250 µL MES Puffer (0,1 M, pH = 6,8), Lösung C: 5 µg von IgG1, die E. Coli-mAb in 225 µL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) , und Lösung D: 4 mL IONP (5.0 Mmol) in 1 mL PBS (pH 7,4).
   2. Fügen Sie 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer-Lösung A, dann sofort hinzufügen Lösung A Solution D in kleinen Schritten innerhalb von 15 s, invertieren die Lösung nach jeder Zugabe zum Mischen von.
   3. Beginnen sofort, Lösung B Lösung D in kleinen Schritten über einen Zeitraum von drei Minuten hinzufügen. Mischung durch invertieren die Lösung nach jeder Zugabe.
   4. Lösung in Schritten von 5 µL Lösung C hinzufügen die Lösung nach jeder Zugabe zum Mischen von invertierenden.
   5. Reaktion auf weiter für 3 h bei Raumtemperatur und dann weiter die Inkubation über Nacht bei 4 ° C zu ermöglichen.
   6. Reinigen die resultierende Ab konjugiert IONPs über magnetische Spalte mit PBS (pH = 7,4, Finale [Fe] = 3,5 Mmol), unconjugated Antikörper zu entfernen.
      1. Der magnetischen Spalte Waschen mit PBS (1 mL). Legen Sie die Spalte auf der Magnetplatte und IONP Lösung hinzufügen.
      2. Waschen die magnetischen Spalte mit PBS (1 mL) wieder. Entfernen Sie die magnetische Spalte aus magnetischen Platte. Hinzufügen der Spalte PBS und sammeln Sie die Lösung. Shop bei 4 ° C
3. Kapselung von fluoreszierenden 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) Farbstoff in die Polyacryl-Säure (PAA)-Beschichtung von der Antikörper konjugiert IONPs mit einem Lösungsmittel-Diffusion-Methode.
   1. Hinzufügen 4 mL der IONPs, tropfenweise 2.0 µL DiI Farbstoff (2 Mmol) in 100 µL von DMSO mit kontinuierlichen Vermischung bei 1100 u/min.
   2. Dialyse die resultierende Lösung (MWCO 6-8 KDa, 12 h) gegen PBS, erstellen eine endgültige Lösung der MFnS mit einer endgültigen Eisenkonzentration von [Fe] = 2 Mmol.
4. Charakterisierung von MFnS
   1. für photometrische Analyse, benutzen Sie einen Platte Reader gekapselte DiI Farbstoff mit Fluoreszenz-Emission bei 595 erkennen nM.
   2. Dynamische Lichtstreuung
      1. legen Sie eine Probe der MFnS Lösung in einem Zetasizer zur Bestimmung der durchschnittlichen Größe und Oberflächenladung der MFnS.
         Hinweis: Hier die Durchschnittsgröße und Oberflächenladung der funktionalen MFnS erwiesen sich 77.09 nm und-22.3 mV, bzw..

2. Bakterielle Culturing und Vorbereitung der Lager-Lösung

1. bakterielle Kultivierung
   1. Hydrat einen gefriergetrockneten Pellet (E. Coli O157: H7) in 1 mL der Nährbouillon und fügen Sie dann eine zusätzliche 5 mL Brühe.
   2. Gelten 100 µL dieser Lösung zu einer Nährbodenplatte und Streifen mit Hilfe einer sterilen Impfschlinge, gefolgt von Inkubation bei 37 ° C für 24 h.
   3. Nach 24 h, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Agarplatte und eine 15 mL Kultur Brühe hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C für ca. 4-6 h, während der Überwachung des optischen Dichte-Wert (Extinktion bei 600 nm).
   4. Das gewonnene ein optische Dichte-Wert von 0,1 ist Kultivierung zu stoppen, und führen Sie Verdünnungsreihen.
2. Verdünnungsreihen
   1. Hinzufügen 900 µL Nährbouillon, acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Hinzufügen 100 µL Bakteriensuspension auf das erste Rohr (Verdünnung 10 ^-1).
   3. Nehmen 100 µL vom ersten Rohr und fügen Sie es in die zweite, eine Verdünnung von 10 ^-2 zu erhalten. Dieses Muster für die restlichen Rohre, endend mit einer Endverdünnung von 10 ^-8 weiter.
   4. Transfer 100 µL aus jeder Tube Agarplatten zu trennen, und inkubieren Sie für 24 h bei 37 ° c
   5. Am nächsten Tag zählen die Koloniebildenden Einheiten (KBE) auf jeder Platte. Wählen Sie die Platte mit ~ 100 KBE. Verwenden Sie die entsprechende Verdünnungen für weitere Experimente (100 µL = ~ 100 KBE).
      Hinweis: Hier war es die 10 ^-6 Verdünnung, die ~ 100 KBE führten.

3. Schnelle Erkennung von E. coli O157: H7 mit MFnS

1. Spike verschiedenen PBS-Lösungen (1 X, pH 7,4, 300 µL) mit steigenden Mengen der 10 ^-6 bakterielle Lager, wodurch KBE reicht von 1-100. Fügen Sie eine konsistente Menge von MFnS (100 µL) zu diesen Lösungen.
2. Schaffen eine Basislösung, die enthält nur PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) und MFnS (100 µL).
3. Lösungen für 30 min bei 37 ° C inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
4. Transfer individueller Lösungen für die magnetische Relaxometer (0,47 Tesla) und Datensatzänderungen in Relaxationszeiten (T2) im Verhältnis zu der KBE in jeder Lösung.
   1. Änderungen in T2 Werte erfassen, beginnen durch die Messung des T2-Wertes der Basislösung, die nur PBS und MFnS enthält.
      1. Ort die Lösung in der magnetischen Relaxometer. Öffnen Sie die jeweilige Software, wählen Sie die " T2 Entspannung " Einstellung, und drücken Sie " Maßnahme. "
   2. nach der Auflistung der Baseline T2, T2-Werte der zusätzliche Lösungen, die mit verschiedenen gespickt waren messen Konzentrationen von Bakterien.
      Hinweis: Die Veränderung der T2 ist äquivalent zum Ausgangswert subtrahiert die Spikes T2 T2.
5. Proben aus der magnetischen Relaxometer entfernen und Zentrifugieren der Rohre bei 2880 X g für 10 min.
6. Den Überstand abgießen und Aufschwemmen bakterielle Pellets in 100 µL PBS (1 X, pH 7,4).
7. Hinzufügen 80 µL jeder Wiederfreisetzung einer 96-Well-Platte und Rekord Fluoreszenz-Intensitäten bei 595 nM.
   Hinweis: Prüfung wiederholt werden kann mit verschiedenen Lösungsmitteln, einschließlich Seewasser, Milch und andere, wie beschrieben im Abschnitt "Ergebnisse"

Results

Der Wirkmechanismus von MFnS wird in Abbildung 1dargestellt. Die Wechselwirkungen zwischen den Magnetic cores der MFnS und die umliegenden Wasserstoffkerne stört das clustering von MFnS um die Oberfläche der bakteriellen Verunreinigungen. Diese Cluster, magnetische Entspannung erhöht die Werte. Mit zunehmender Konzentration der bakteriellen Verunreinigungen clustering verringert, und T2 Wertewandel senkt. Daher ist die Zugabe von einem fluoreszierenden Modalität entscheidend. Mit zunehmender...

Discussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um voll funktionsfähige MFnS produzieren so einfach wie möglich. Allerdings gibt es viele wichtige Punkte, die bei denen Änderung des Protokolls möglicherweise nützlich, je nach Ziel des Benutzers. Beispielsweise würde die Verwendung von verschiedenen Antikörpern für die Ausrichtung von vielen anderen Krankheitserregern ermöglichen. Darüber hinaus ist dieses Protokoll nicht beschränkt auf die Verwendung von Antikörpern als targeting Moleküle. Jedes Molek...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eisenchlorid-Tetrahydrat	Fisher Scientific	I90-500
Eisenchlorid-Hexahydrat	Fisher Scientific	I88-500
Ammoniumhydroxid	Fisher Scientific	A669S-500
Salzsäure	Fisher Scientific	A144S-500
Polyacryllsäure	Sigma-Aldrich	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific	AC157270250
Anti-E. coli O111 Antikörper	sera care	5310-0352
Anti-E. coli O157:H7 Antikörper [P3C6]	Abcam	ab75244
DiI Stain	Fisher Scientific	D282
Nährstoffbrühe	Difco	233000
Gefriergetrocknete E. coli O157:H7 Pellet	ATCC	700728
Magnetischer Relaxomteter	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
Plattenleser	Tecan	Infinite M200 PRO
Magnetische Säule	QuadroMACS	130-090-976
Zentrifuge	Eppendorf	5804 Serie
Zentrifuge (accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
Schüttelinkubator für Bodenmodelle	SHEL LAB	SSI5
Analysenwaage	Metler Toledo	ME104E
Digitaler Vortex-Mischer	Fisher Scientific	02-215-370
Schaukelschüttler für den Außenbereich	Fisher Scientific	02-217-765