Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Das dauerhafte auftreten der bakteriellen Kontamination in beiden kommerziell produzierte Lebensmittel und Wasser-Quellen müssen zunehmend schnellen und spezifischen diagnostischen Plattformen geschaffen hat. ^{1 , 2} einige der häufigeren bakterielle Verunreinigungen für Nahrung und Wasser Kontamination verantwortlich sind aus den Salmonellen, Staphylokokken, Listerien, Vibrio, Shigella, Bacillus und Escherichia Gattungen. ^{3 , 4} bakterielle Kontamination durch diese Erreger häufig führt zu Symptomen wie Durchfall, Fieber, Cholera und Gastroenteritis. ⁴ Kontamination von Wasser-Quellen oft hat drastische und nachteilige Auswirkungen auf die Gemeinden ohne Zugang zu ausreichend gefiltertes Wasser und Kontamination von Lebensmitteln führte zu zahlreichen Erkrankungen und Produkt-Rückruf-Bemühungen. ^{5 , 6}

Um das Auftreten von Erkrankungen durch bakterielle Kontamination zu reduzieren, wurden eine Reihe von Maßnahmen, Methoden zu entwickeln, mit denen Wasser und Nahrung effizient vor Verkauf oder Verbrauch gescannt werden können. ³ Techniken wie PCR,^1,7,8,9,10 ELISA,^11,12 Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung) Lampe),^13,14 u. a.^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24} haben vor kurzem für die Erkennung von verschiedenen Krankheitserregern verwendet worden. Im Vergleich zu traditionellen bakterielle Kultivierung Methoden, sind diese Techniken wesentlich effizienter im Hinblick auf Spezifität und Zeit. Diese Techniken kämpfen noch mit falsch positive und negative, komplexe Verfahren und Kosten. ^{1 , 3 , 25} es ist aus diesem Grund, dass multiparametric Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS) als eine alternative Methode für bakterielle Erkennung vorgeschlagen werden.

Diese Nanosensoren Paaren eindeutig zusammen magnetische Entspannung und fluoreszierende Modalitäten, so dass für eine Dual-Erkennung-Plattform, die eine schnelle und genaue. Mit E. Coli O157: H7 als eine Verunreinigung der Probe, zeigt die Fähigkeit des MFnS, so wenig wie 1 KBE innerhalb von Minuten erkennen. Erreger-spezifischen Antikörper werden verwendet, um die Spezifität zu erhöhen, und die Kombination von magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten ermöglicht die Erkennung und Quantifizierung von bakteriellen Verunreinigungen in beiden Bereichen Low - und High-Kontamination. ¹⁶ bei bakteriellen Kontamination werden die Nanosensoren um die Bakterien durch die gezielten Fähigkeiten der Erreger-spezifischen Antikörper schwärmen. Die Bindung zwischen der magnetische Nanosensoren und Bakterien schränkt die Interaktion zwischen der magnetischen Eisenkern und die umliegenden Wasser Protonen. Dies bewirkt eine Erhöhung der T2-Relaxationszeiten von magnetischen Relaxometer aufgenommen. Da die Konzentration von Bakterien in Lösung steigt zu zerstreuen die Nanosensoren mit der erhöhten Anzahl von Bakterien, was zu niedrigeren T2-Werten. Im Gegensatz dazu erhöht Fluoreszenzemission proportional mit der Konzentration von Bakterien durch die gestiegene Zahl der Nanosensoren direkt pathogen gebunden. Zentrifugation der Proben und Isolation des bakteriellen Pellets werden nur die Nanopartikel direkt angeschlossen, die Bakterien, entfernen alle schwebenden Nanosensoren und direkt korrelieren die Fluoreszenz-Emission mit der Anzahl der sparen Bakterien in Lösung. Eine schematische Darstellung dieses Mechanismus ist in Abbildung 1dargestellt.

Diese MFnS-Plattform wurde mit Point-of-Care-Screening im Auge, was zu Low-Cost und tragbaren Eigenschaften entwickelt. MFnS sind bei Raumtemperatur stabil und müssen dann nur in sehr geringen Konzentrationen für präzise Erkennung von bakteriellen Verunreinigungen. Darüber hinaus nach der Synthese, Einsatz von der MFnS ist einfach und erfordert nicht die Verwendung von ausgebildeten Fachleuten auf dem Gebiet. Schließlich ermöglicht dieses Diagnoseplattform für hochgradig anpassbare targeting, ein Mittel, durch welche diese eine Plattform verwendet werden, um Krankheitserreger aller Art in vielen verschiedenen Einstellungen zu erkennen.

1. Synthese und Funktionalisierung von multiparametrischen Magneto-fluoreszierende Nanosensoren (MFnS).

1. Synthese von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs)
   1. zur Vorbereitung der IONP Synthese, bereiten die folgenden 3 Lösungen: Lösung 1: FeCl ₃ (0,70 g) und FeCl ₂ H ₂ O (2 mL), Lösung 2: NH ₄ OH (2,0 mL, 13,4 M) H ₂ O (15 mL) und Lösung 3: Polyacryl Säure (0,855 g) H ₂ O (5 mL).
   2. Lösung 1 90 µL 2 M Salzsäure (HCl) hinzu und dann mischen Sie mit Lösung 2 sofort beim Aufschütteln bei 875 UPM. Dann fügen Sie Lösung 3. Bereich für 60 min. weiter
   3. Zentrifuge für 20 min bei 1.620 x g. Zentrifugieren den Überstand für 20 min bei 2.880 x g.
   4. Reinigen den endgültigen Überstand über Dialyse. Hinzufügen den Überstand auf eine Dialyse-Tasche (MWCO 6 − 8 K) und legen Sie sie in einen Becher mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH = 7,4) und Spin-Bar. Lassen Sie es für 12 h, ersetzen mit frischen Puffer alle 2-3 h einweichen
2. Konjugation von Target-spezifische Antikörper auf der Oberfläche des IONPs
   1. bereiten die folgenden vier Lösungen: Lösung A: 5 mg 1-Ethyl - 3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) in 250 µL MES [2-(N- Morpholino) Ethanesulfonic Säure] Puffer (0,1 M, pH = 6,8), Lösung B: 3 mg des N-Hydroxysuccinimide (NHS) in 250 µL MES Puffer (0,1 M, pH = 6,8), Lösung C: 5 µg von IgG1, die E. Coli-mAb in 225 µL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) , und Lösung D: 4 mL IONP (5.0 Mmol) in 1 mL PBS (pH 7,4).
   2. Fügen Sie 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer-Lösung A, dann sofort hinzufügen Lösung A Solution D in kleinen Schritten innerhalb von 15 s, invertieren die Lösung nach jeder Zugabe zum Mischen von.
   3. Beginnen sofort, Lösung B Lösung D in kleinen Schritten über einen Zeitraum von drei Minuten hinzufügen. Mischung durch invertieren die Lösung nach jeder Zugabe.
   4. Lösung in Schritten von 5 µL Lösung C hinzufügen die Lösung nach jeder Zugabe zum Mischen von invertierenden.
   5. Reaktion auf weiter für 3 h bei Raumtemperatur und dann weiter die Inkubation über Nacht bei 4 ° C zu ermöglichen.
   6. Reinigen die resultierende Ab konjugiert IONPs über magnetische Spalte mit PBS (pH = 7,4, Finale [Fe] = 3,5 Mmol), unconjugated Antikörper zu entfernen.
      1. Der magnetischen Spalte Waschen mit PBS (1 mL). Legen Sie die Spalte auf der Magnetplatte und IONP Lösung hinzufügen.
      2. Waschen die magnetischen Spalte mit PBS (1 mL) wieder. Entfernen Sie die magnetische Spalte aus magnetischen Platte. Hinzufügen der Spalte PBS und sammeln Sie die Lösung. Shop bei 4 ° C
3. Kapselung von fluoreszierenden 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) Farbstoff in die Polyacryl-Säure (PAA)-Beschichtung von der Antikörper konjugiert IONPs mit einem Lösungsmittel-Diffusion-Methode.
   1. Hinzufügen 4 mL der IONPs, tropfenweise 2.0 µL DiI Farbstoff (2 Mmol) in 100 µL von DMSO mit kontinuierlichen Vermischung bei 1100 u/min.
   2. Dialyse die resultierende Lösung (MWCO 6-8 KDa, 12 h) gegen PBS, erstellen eine endgültige Lösung der MFnS mit einer endgültigen Eisenkonzentration von [Fe] = 2 Mmol.
4. Charakterisierung von MFnS
   1. für photometrische Analyse, benutzen Sie einen Platte Reader gekapselte DiI Farbstoff mit Fluoreszenz-Emission bei 595 erkennen nM.
   2. Dynamische Lichtstreuung
      1. legen Sie eine Probe der MFnS Lösung in einem Zetasizer zur Bestimmung der durchschnittlichen Größe und Oberflächenladung der MFnS.
         Hinweis: Hier die Durchschnittsgröße und Oberflächenladung der funktionalen MFnS erwiesen sich 77.09 nm und-22.3 mV, bzw..

2. Bakterielle Culturing und Vorbereitung der Lager-Lösung

1. bakterielle Kultivierung
   1. Hydrat einen gefriergetrockneten Pellet (E. Coli O157: H7) in 1 mL der Nährbouillon und fügen Sie dann eine zusätzliche 5 mL Brühe.
   2. Gelten 100 µL dieser Lösung zu einer Nährbodenplatte und Streifen mit Hilfe einer sterilen Impfschlinge, gefolgt von Inkubation bei 37 ° C für 24 h.
   3. Nach 24 h, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Agarplatte und eine 15 mL Kultur Brühe hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C für ca. 4-6 h, während der Überwachung des optischen Dichte-Wert (Extinktion bei 600 nm).
   4. Das gewonnene ein optische Dichte-Wert von 0,1 ist Kultivierung zu stoppen, und führen Sie Verdünnungsreihen.
2. Verdünnungsreihen
   1. Hinzufügen 900 µL Nährbouillon, acht sterile Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Hinzufügen 100 µL Bakteriensuspension auf das erste Rohr (Verdünnung 10 ^-1).
   3. Nehmen 100 µL vom ersten Rohr und fügen Sie es in die zweite, eine Verdünnung von 10 ^-2 zu erhalten. Dieses Muster für die restlichen Rohre, endend mit einer Endverdünnung von 10 ^-8 weiter.
   4. Transfer 100 µL aus jeder Tube Agarplatten zu trennen, und inkubieren Sie für 24 h bei 37 ° c
   5. Am nächsten Tag zählen die Koloniebildenden Einheiten (KBE) auf jeder Platte. Wählen Sie die Platte mit ~ 100 KBE. Verwenden Sie die entsprechende Verdünnungen für weitere Experimente (100 µL = ~ 100 KBE).
      Hinweis: Hier war es die 10 ^-6 Verdünnung, die ~ 100 KBE führten.

3. Schnelle Erkennung von E. coli O157: H7 mit MFnS

1. Spike verschiedenen PBS-Lösungen (1 X, pH 7,4, 300 µL) mit steigenden Mengen der 10 ^-6 bakterielle Lager, wodurch KBE reicht von 1-100. Fügen Sie eine konsistente Menge von MFnS (100 µL) zu diesen Lösungen.
2. Schaffen eine Basislösung, die enthält nur PBS (1 X, pH 7,4, 300 µL) und MFnS (100 µL).
3. Lösungen für 30 min bei 37 ° C inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
4. Transfer individueller Lösungen für die magnetische Relaxometer (0,47 Tesla) und Datensatzänderungen in Relaxationszeiten (T2) im Verhältnis zu der KBE in jeder Lösung.
   1. Änderungen in T2 Werte erfassen, beginnen durch die Messung des T2-Wertes der Basislösung, die nur PBS und MFnS enthält.
      1. Ort die Lösung in der magnetischen Relaxometer. Öffnen Sie die jeweilige Software, wählen Sie die " T2 Entspannung " Einstellung, und drücken Sie " Maßnahme. "
   2. nach der Auflistung der Baseline T2, T2-Werte der zusätzliche Lösungen, die mit verschiedenen gespickt waren messen Konzentrationen von Bakterien.
      Hinweis: Die Veränderung der T2 ist äquivalent zum Ausgangswert subtrahiert die Spikes T2 T2.
5. Proben aus der magnetischen Relaxometer entfernen und Zentrifugieren der Rohre bei 2880 X g für 10 min.
6. Den Überstand abgießen und Aufschwemmen bakterielle Pellets in 100 µL PBS (1 X, pH 7,4).
7. Hinzufügen 80 µL jeder Wiederfreisetzung einer 96-Well-Platte und Rekord Fluoreszenz-Intensitäten bei 595 nM.
   Hinweis: Prüfung wiederholt werden kann mit verschiedenen Lösungsmitteln, einschließlich Seewasser, Milch und andere, wie beschrieben im Abschnitt "Ergebnisse"

Der Wirkmechanismus von MFnS wird in Abbildung 1dargestellt. Die Wechselwirkungen zwischen den Magnetic cores der MFnS und die umliegenden Wasserstoffkerne stört das clustering von MFnS um die Oberfläche der bakteriellen Verunreinigungen. Diese Cluster, magnetische Entspannung erhöht die Werte. Mit zunehmender Konzentration der bakteriellen Verunreinigungen clustering verringert, und T2 Wertewandel senkt. Daher ist die Zugabe von einem fluoreszierenden Modalität entscheidend. Mit zunehmender die Bakterienkonzentration erhöht die Festigkeit des das Fluoreszenzsignal von MFnS produziert, so dass für den empfindlichen Nachweis von bakteriellen Verunreinigungen in beiden Konzentrationsbereichen niedriger und hoher.

Nach dem Protokoll wurden16 MFnS synthetisiert und zuerst in Lösungen von PBS (1 X, pH 7,4) getestet. Die erste Modalität verwendet für die Erkennung von magnetischen Entspannung, wurde verwendet, um Änderungen im T2 Werte aufgezeichnet werden. Gemäß dem Protokoll die Proben wurden dann zentrifugiert, Pellets wurden Nukleinsäuretablette und Fluoreszenz-Daten wurden gesammelt. Die entsprechenden ΔT2 und Fluoreszenz-Emissionswerte sind in Abbildung 2dargestellt. Wie gezeigt, der ΔT2 Wert war größte bei niedrigeren Konzentrationen von bakterieller Verunreinigung, und Sättigung auf ca. 20 KBE erreicht. Fluoreszenz-Emission wurde auf der anderen Seite, genauer am > 20 KBE, zeigt wie wichtig es ist, diese zwei Modalitäten zu kombinieren. Im Anschluss an diese primäre Assays wurden ähnliche Tests in komplexen Medien, einschließlich Seewasser und Milch durchgeführt. Dies wurde getan, um sicherzustellen, dass die Nanosensoren in komplexer Medien noch wirksam sind. Die Daten aus diesen Tests sind in Abbildung 3 dargestellten und sind ähnlich wie die Assays in PBS durchgeführt. Dadurch wird sichergestellt, dass diese Nanosensoren in komplexen Medien wirksam.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass MFnS das Vorhandensein von bakteriellen Verunreinigungen in einfache und komplexe Medien erkennen konnte, wurden eine Reihe von Tests dann durchgeführt, um den Grad der Spezifität, verwaltet von der Nanosensoren bestimmen. Zu diesem Zweck wurden MFnS in Lösungen mit Ziel Bakterien, Hitze getötet Ziel Bakterien, Nichtziel-Bakterien (nicht-pathogenen E. Coli und S. Typhimurium) und eine Mischung inkubiert. Da dies nur eine Spezifität-Assay, die Datenerhebung magnetische Entspannung allein genügte, und die entsprechenden Daten werden in Abbildung 4dargestellt. Wie man sehen kann, die MFnS verpflichtet nur um E. Coli O157: H7, zu leben und nicht auf die andere Hitze getötet oder Nichtziel-Bakterien. Diese Spezifität ist zurückzuführen auf die konjugierte targeting Antikörper, und weiter bestätigt, dass MFnS bei der Erkennung von spezifischen Erreger Verunreinigungen, auch bei nicht-pathogenen Bakterienarten wirksam wird.

Abbildung 1 : Magneto-fluoreszierende Erkennungsmechanismus. Schematische Darstellung des MFnS Synthese und der Dual-Modal-Mechanismus der bakteriellen Erkennung. Nach einer kurzen Inkubationszeit (30 min) sind MFnS sensibel die Ziel-Bakterien über eine Kombination von Magnetresonanz und Fluoreszenzemission erkennen. Clustering von MFnS um die Oberfläche der bakteriellen Verunreinigungen verursacht Änderungen im magnetischen Entspannung Werte, die durch eine magnetische Relaxometer nachweisbar sind. Darüber hinaus können fluoreszierende Signale aus dem MFnS direkt verpflichtet, bakterielle Verunreinigungen erfasst werden. Dies bietet eine Dual-Modal-Erkennung-Plattform Erkennung bakterieller Verunreinigungen in beiden Konzentrationsbereichen niedriger und hoher fähig. 16 diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16

Abbildung 2 : Proof of Concept. (A) magnetische Entspannung Daten (ΔT2) wurden zuerst von Verdünnungen von E. Coli O157: H7 (1-100 KBE) in PBS Lösungsmittel (1 X, pH = 7,4). Herr Nachweis von Bakterien wurde hochsensiblen am unteren KBE zählt (Einschub: von 1-20 KBE). Jedoch wurde die ΔT2 Lesungen bei höheren Bakterienkonzentration gesättigt (> 20 KBE), darauf hinweist, dass Herr wertvoller für die Erkennung und Quantifizierung von Frühphasen-bakterielle Kontamination. (B) Fluoreszenz Emissionsdaten aus dem gleichen versetzt PBS Lösungen (Einschub: Linearität Plot). Die Ergebnisse zeigten, dass die Fluoreszenz-Nachweismethode empfindlicher auf höhere KBE zählt, während es in der Empfindlichkeit für niedrige KBE Proben fehlt. Diese Daten zeigen zusammen, die Fähigkeit der magnetischen und fluoreszierenden Modalitäten zu erkennen und zu quantifizieren, bakterielle Kontamination im früh - und -Spätstadien der bakteriellen Kontamination. 16 Durchschnittswerte von drei Messungen sind abgebildeten ± Standardfehler. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16

Abbildung 3 : Bakterielle Erkennung in komplexen Medien. Magnetische Entspannung ΔT2 Daten aus komplexen Medien, einschließlich A) See Wasser und (B) Vollmilch. Ähnlich wie bei den Daten aus der bisherigen PBS-Lösungen, wurde es festgestellt, dass Nachweis von bakteriellen Verunreinigungen empfindlicher im Bereich von 1-20 KBE (Einsätze). Entsprechenden Fluoreszenz Emissionsdaten wurden für die C) Seewasser und D) Milch Proben (Einsätze: Linearität Grundstücke), die zeigten höheren Empfindlichkeit mit zunehmendem KBE zählt. Noch einmal diese Daten belegen die Wirksamkeit, mit der jeder Modalität das andere ergänzt, und überprüfen Sie ihre Fähigkeit, in komplexen Medien funktionsfähig bleibt. 16 Durchschnittswerte von drei Messungen sind abgebildeten ± Standardfehler. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16

Abbildung 4 : MFnS Spezifität. Die Besonderheit des MFnS wurde getestet mit Herrn Analyse in Nährbouillon Lösungen (A) eine Reihe von bakteriellen Kreuz-Kontaminationen und eine Mischung und (B) Hitze-Inaktivierung enthält E. Coli O157: H7. Wie gezeigt, ist es klar, dass die Nanosensoren wenig bis gar keine Bindung mit ungezielte Bakterien und sind noch in der Lage die Ziel-Bakterien in Gegenwart von anderen Verunreinigungen haben, um sicherzustellen, dass diese Form der Vorführung über wäreBle für den Einsatz in komplexen Medien, die eine Reihe von nicht-pathogenen Bakterienarten enthalten. (C) weitere Besonderheit Tests wurden durchgeführt durch Synthese MFnS mit einem Antikörper Isotype (rote Kreise: Anti - VirusEHEC O111), führte dazu, dass wenig bis keine Bindung im Vergleich zu den O157: H7 Antikörper konjugiert MFnS (schwarze Quadrate). Diese Daten zeigen, dass MFnS nur mit brauchbares Ziel Bakterien reagieren ihre Wirksamkeit als Point-of-Care Diagnostik Plattform weiter zu überprüfen. 16 Durchschnittswerte von drei Messungen sind abgebildeten ± Standardfehler. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von geändert. 16

Die nachweisliche Anwendung der dieser Nanotechnologie ist noch nicht von der FDA zugelassen.