Methodenartikel

Ein einheitlicher methodischer Rahmen für die vestibuläre Schwannomforschung

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DOI:

10.3791/55827

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20. Juni 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, die Erfassung und Verarbeitung von humanen chirurgischen Proben für mehrere nachgeschaltete Anwendungen im vestibulären Schwannom und Schwann Zellforschung zu skizzieren.

Zusammenfassung

Vestibuläre Schwannome sind die häufigsten Neubildungen des Cerebellopontinwinkels, was 6-8% Prozent aller intrakraniellen Wucherungen ausmacht. Obwohl diese Tumore einen sensorineuralen Hörverlust bei bis zu 95% der betroffenen Personen verursachen, bleiben die molekularen Mechanismen, die diesem Hörverlust zugrunde liegen, unklar. Dieser Artikel beschreibt die Schritte in unserem Labor, um die Sammlung und Verarbeitung von verschiedenen primären menschlichen Gewebe Proben für nachgeschaltete Forschungs-Anwendungen integral in die Studie der vestibulären Schwannome zu erleichtern. Speziell beschreibt diese Arbeit einen einheitlichen methodischen Rahmen für die Sammlung, Verarbeitung und Kultur von Schwann und Schwannomzellen aus chirurgischen Proben. Hierbei handelt es sich um parallele Verarbeitungsschritte, die für die aktuelle Forschung als wesentlich erachtet werden: die Sammlung von Tumor- und Nervensekreten, die Erhaltung der RNA und die Extraktion von Protein aus gesammelten Geweben, die Fixierung von Gewebe zur Vorbereitung von Abschnitten,D die Exposition von primären menschlichen Zellen zu Adeno-assoziierten Viren für die Anwendung auf Gentherapie. Darüber hinaus hebt diese Arbeit den translabyrinthischen chirurgischen Ansatz hervor, um diesen Tumor als eine einmalige Gelegenheit zu erhalten, menschliches sensorisches Epithel aus dem Innenohr und der Perilymph zu erhalten. Tipps zur Verbesserung der experimentellen Qualität werden zur Verfügung gestellt und häufige Fallstricke hervorgehoben.

Einleitung

Vestibuläre Schwannome (VSs) sind die häufigsten Neubildungen des Cerebellopontin-Winkels, diagnostiziert in 1 bei jedem 100.000 Individuen. Obwohl nicht-metastatisch, diese Tumoren stark beeinflussen die Lebensqualität eines Patienten 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Betroffene Personen leben gewöhnlich mit Hörverlust, Tinnitus und einem Gefühl der akustischen Fülle. Die Symptome werden zunehmend schwächenden, wenn der Tumor wächst, was Balanceprobleme, Gesichtslähmung und Beeinträchtigung anderer Hirnnervenfunktionen verursacht. Lebensbedrohliche Komplikationen durch Hirnstammkompression können ebenfalls auftreten 7 .

Management-Optionen für VS sind im Wesentlichen auf wachsames Warten auf statische Tumoren und stereotaktische Strahlentherapie oder chirurgische Resektion für wachsende Tumoren beschränkt 8. Die chirurgische Entfernung dieser Tumore in forschungsbezogenen Krankenhäusern bietet die Möglichkeit, frisches Tumorgewebe zu erwerben und zu analysieren, das während der Patientenchirurgie gesammelt wurde. Ein spezifischer chirurgischer Ansatz für VS, die translabyrinthische Resektion, kann sogar den Zugang zu wertvollem menschlichem sensorischen Epithel aus dem Innenohr und der Perilymph

Weil VSs aus einem peripheren Sinnesnerv ( dh dem Vestibularis) entstehen, ist es wichtig, VS-assoziierte Beobachtungen mit denen zu vergleichen, die von einem geeigneten Kontrollnerv abgeleitet sind, wie dem menschlichen Nervenvenen (GAN). Gesunde GANs werden regelmäßig bei Parotidektomien oder Halsdissektionen geopfert und können als robuste Modelle für eine gesunde Schwann-Zellphysiologie verwendet werden 9 .

Da es keine FDA-zugelassenen Medikamente für die Behandlung oder Prävention von sporadischen VS gibt, ist es zwingend erforderlich, dass Forscher die zugrunde liegenden molekularen Mecha aufklärenNismen der Krankheit, um therapeutische Ziele zu identifizieren. Proteine, die gezeigt haben, dass sie eine Rolle bei der VS-Pathogenese spielen, umfassen Merlin, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Cyclooxygenase 2 (COX-2), Kernfaktor Kappa B (NF- & kgr; B), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) , Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und verwandte Signalmoleküle 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Jüngste Fortschritte haben erweitert und verbesserte Protokolle für die Sammlung, Verarbeitung, Kultur und nachgelagerte Untersuchung von primären menschlichen vestibulären Schwannomen und gesunden Nervengeweben 18 , 19 . Allerdings sind die meisten bestehenden Protokolle entworfen, um die Vorbereitung unterzubringenVon solchen Geweben für eine einzige nachgeschaltete Forschungsapplikation ( dh Zellkultur allein). Dieser Artikel stellt einen einheitlichen methodischen Rahmen für die gleichzeitige Verarbeitung einer einzelnen primären menschlichen VS- oder GAN-Probe für mehrere nachgeschaltete Anwendungen dar: Zelltypspezifische Kultur, Proteinextraktion, RNA-Konservierung, Tumorsekretionsansammlung und Gewebefixierung. Diese Arbeit beschreibt auch die chirurgische Sammlung und Verarbeitung von menschlicher Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und Perilymph während der translabyrinthischen VS-Resektion, da diese eng verwandten Gewebe als wichtige Quellen für Biomarker für VS dienen können. Schließlich stellt dieses Protokoll Schritte für die virale Transduktion von primären menschlichen VS-Zellen in Kultur als eine neuartige Anwendung dieses Gewebes für die Verwendung in der Gentherapie vor.

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Protokoll

Eine schriftliche Einverständniserklärung für die Erhebung aller Proben wurde vor der Operation erhalten und die Versuche wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association (Erklärung von Helsinki) durchgeführt. Alle Abschnitte des Studienprotokolls wurden von der Institutional Review Board von Massachusetts Eye und Ear und Massachusetts General Hospital genehmigt.

HINWEIS: Die nachstehenden Abschnitte 1-7 sind so konzipiert, dass sie nach dem Erhalt einer primären menschlichen VS- oder GAN-Probe aus dem Operationssaal nacheinander durchgeführt werden. Die Verarbeitung sollte immer mit Abschnitt 1 beginnen. Dann sollte in der Regel RNA zuerst konserviert werden (Abschnitt 2), gefolgt von der Herstellung von Gewebe für die Sammlung von Sekreten (Abschnitt 3) und Proteinextraktion (Abschnitt 4). Das zu kultivierende Gewebe (Abschnitt 5 für VS, Abschnitt 6 für GAN) kann in einem ergänzten Kulturmedium sitzen, während die Abschnitte 2, 3 und 4 durchgeführt werden. Die Fixierung des Gewebes zum Schneiden (Abschnitt 7) ist sehr kurz und cBei jedem Zentrifugationsschritt durchgeführt werden. Abschnitt 8 (Perilymphverarbeitung) und Abschnitt 9 (CSF-Verarbeitung) können bei Empfang von Perilymph oder CSF aus dem Operationssaal während einer translabyrinthischen VS-Resektion durchgeführt werden. Abschnitt 10 (virale Transduktion) kann an wachsenden VS- oder Schwann-Zellen in Kultur durchgeführt werden.

1. Vorbereitung und Erhalt einer chirurgischen Stichprobe

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind in einer sterilen Umgebung durchzuführen, wie zB eine Gewebekulturhaube oder eine laminare Strömungshaube. Vertrautheit mit der grundlegenden sterilen Technik wird erwartet.

  1. Vorbereitung des Mediums für primäre menschliche VS- oder Schwann-Zellkultur
    1. Tauen Sie ein 50 ml Aliquot von gefrorenem fötalem Rinderserum (FBS) in ein 37 ° C Wasserbad.
    2. Füge 5 ml Penicillin / Streptomycin-Mischung zu einer 500 ml Flasche DMEM / F-12 hinzu, was zu einer Endverdünnung von 1: 100 führt.
    3. Füge die 50 ml Tau-FBS der 500 ml Flasche DMEM / F-12 hinzu,Was zu einer Endverdünnung von 1:10 führt.
    4. Schreiben Sie das Datum, die Initialen des Forschers und ergänzende Informationen ( zB 1% P / S, 10% FBS) auf der Flasche.
    5. Legen Sie das neue Kulturmedium in den Kühlschrank (4 ° C).
  2. Empfang und Reinigung von VS oder GAN Probe
    1. Im Operationssaal die frisch geerntete VS- oder GAN-Probe in sterile Kochsalzlösung in einen Probenbehälter geben. Transportieren Sie die Probe auf Eis vom Operationssaal zu einer laminaren Strömungshaube im Labor.
      HINWEIS: Probengrößen und -gewichte variieren signifikant zwischen Patienten, die auf der Größe des relevanten Tumors oder der Menge des angeregten Nervs basieren.
    2. Aus dem Gefriergerät werden Stammlösungsaliquots von Hyaluronidase (25.000 U / ml) und Collagenase (3.200 U / ml) entfernt und die Enzyme bei Raumtemperatur auftauen lassen (je nach dem, was die Probe ist, für Schritt 5.1.4 oder 6.1.6 erforderlich) Ein VS oder ein GAN).
      HINWEIS: Die Resuspension von lyophilisierten Enzymen iS ausführlich auf den Produktinformationsblättern beschrieben. Die Collagenase kann in jeder Calcium-freien ausgeglichenen Salzlösung und Hyaluronidase in einer Lösung von 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), 77 mM NaCl und 0,01% 1 mg / ml Rinderserumalbumin resuspendiert werden. Die spezifische Aktivität für jedes lyophilisierte Enzym variiert mit dem Los und sollte vor der Resuspension überprüft werden.
    3. Mit einer Reihe von drei 1,5 ml Röhrchen, gefüllt mit 1,4 ml 1x sterilem PBS, waschen Sie die VS- oder GAN-Probe dreimal. Sorgfältig die Probe von Rohr zu Rohr mit steriler Pinzette übertragen. Schließen Sie jedes Rohr, sobald es das Exemplar enthält, und schütteln Sie sanft zum Waschen.
      HINWEIS: Um eine Überschwemmung der 1,5-ml-Röhrchen zu vermeiden, können pro Röhrchen weniger als 1,4 ml PBS verwendet werden, wenn das Tumorstück groß ist.
    4. Setzen Sie die Probe in eine trockene 60 mm Petrischale und verwenden Sie Pinzette, um alle toten Gewebe zu entfernen ( dh kauterisierte Portionen, die gewöhnlich weiß oder opak in der Farbe sind) und Bereiche mit prominenten Blutgefäßen.
    5. Verwenden Sie fOrceps oder eine Skalpellklinge, um die Probe in separate Stücke für die RNA-Konservierung, Proteinextraktion, Sekretionsansammlung, Fixierung und Zellkultur aufzuteilen (siehe Abschnitte 2 - 6, unten).
    6. Übertragen Sie das für die Zellkultur (Abschnitt 5/6) bezeichnete Stück der Probe auf eine neue 60 mm Kulturschale mit 5-8 ml kaltem, ergänztem DMEM / F-12-Medium (alternativ kann der Deckel der ersten Kulturschale sein Für diesen Schritt verwendet).
      HINWEIS: Die benötigte Menge an DMEM / F-12 Medium (ab Schritt 1.1) hängt von der Größe des Tumors oder Nervs ab, sollte aber zwischen 5 und 8 ml liegen. Dieses Stück kann in Kulturmedium sitzen, während die nachfolgenden Schritte durchgeführt werden.

2. RNA-Konservierung von VS und GAN-Gewebe (auch für das menschliche sensorische Epithel gültig)

  1. Unter der laminaren Strömungshaube überführen Sie 1-1,2 ml RNA-Stabilisierungslösung in ein neues 1,5 mL Röhrchen.
  2. Nach dem Waschen der Probe mit PBS (Schritt 1.2.3) kurz die kleine Torte eintauchenDer für die RNA-Konservierung (ca. 3 mm 3 VS oder 5 mm Länge GAN) in die RNA-Stabilisierungslösung bestimmt ist. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht ist.
  3. Vorbereiten und Etikettieren eines neuen 1,5 mL Röhrchens. Die Probe aus der RNA-Stabilisierungslösung abholen, in das neue Röhrchen überführen und in einem Gefrierschrank von -80 ° C aufbewahren.

3. Sammlung der VS- und GAN-Sekrete

  1. Tag 1
    1. Nach dem Waschen der Probe mit PBS (Schritt 1.2.3) legen Sie das VS- oder GAN-Stück für die Sammlung von Sekreten in ein leeres 1,5 mL Röhrchen.
    2. Zwei weitere 1,5 ml Röhrchen vorbereiten und 500 μl DMEM (nicht ergänzt mit FBS) in jedes Röhrchen pipettieren.
      HINWEIS: Die erste Röhre von DMEM wird verwendet, um die Tumorsekrete zu sammeln, und das zweite Röhrchen von DMEM dient als abgestimmte Kontrolle. Sekrete können in DMEM gesammelt werden, jedes andere typische Kulturmedium nichtErgänzt mit Serum oder PBS.
    3. Stellen Sie eines der DMEM-haltigen Röhrchen auf eine kalibrierte Digitalwaage. Tara die Waage, so dass, wenn das Rohr auf der Skala sitzt, liest es 0 mg.
    4. Entfernen Sie die Röhre von DMEM aus der Waage, legen Sie das Stück der Probe für die Sammlung von Sekreten in die Tube, und wiegen sie. Beachten Sie das Ergebnis, das das Gewicht des Gewebes allein darstellt.
    5. Unter einer laminaren Strömungshaube das Volumen des DMEM im Röhrchen auf 100 μl pro 10 mg Probe einstellen.
    6. Legen Sie die Röhrchen, die die Gewebeprobe und ihre übereinstimmende Kontrolle (DMEM alleine) enthalten, in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) für einen Zeitraum ein, der mit den Plänen für dieses Experiment übereinstimmt. Inkubieren Sie das Gewebe für mindestens 72 h, um biologisch nützliche Mengen von Tumor- oder Nervensekreten zu sammeln 15 .
  2. Tag 4
    1. Nach der Inkubation für 72 h, entfernen Sie das sekretionshaltige Medium aus demProbe ( dh gewebe-konditioniertes Medium) unter Verwendung einer 1 ml-Pipette. Um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, aliquotieren Sie das Medium in die neuen Röhrchen gemäß den geplanten nachgeschalteten Analysen ( z. B. um einen ELISA mit 4 Vertiefungen mit je 50 & mgr; l zu führen, können Aliquote von 210 & mgr; l hergestellt werden).
    2. Falls erforderlich, gefrieren Sie das im Originalrohr (bereits am Tag 1) bereits markierte Gewebestück bei -80 ° C für zusätzliche Analysen, wie zB DNA-Extraktion, zu einem späteren Zeitpunkt.
    3. Bewahren Sie das Gewebe, die Sekretion und kontrollieren Sie DMEM in einem Gefrierschrank von -80 ° C, bis die nachgeschalteten Anwendungen eingeleitet werden ( zB ELISAs, LC-MS / MS, Zytokin-Arrays usw. ).

4. Proteinextraktion aus VS oder GAN Gewebe

  1. Vorbereitung des angereicherten RIPA-Puffers
    1. Füge eine Tablette Phosphatase-Inhibitor und eine Tablette Protease-Inhibitor zu 10 ml RIPA-Puffer in einem 15-ml-Röhrchen hinzu; Das ist angereichertRIPA-Puffer
      HINWEIS: Speichern Sie den RIPA-Puffer bei 4 ° C und fügen Sie die Tabletten kurz vor Gebrauch hinzu.
  2. Proteinextraktion
    1. Übertragen Sie 210 μl angereicherter RIPA-Puffer (Schritt 4.1.1) auf ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
    2. Nach dem Waschen des Exemplars mit PBS (Schritt 1.2.3) das für die Proteinextraktion (ca. 3 mm 3 VS oder eine 5 mm Länge GAN) bezeichnete Stück für das RIPA-Puffer enthaltende Röhrchen übergeben und auf Eis legen Für mindestens 10 min. Bei der Untersuchung phosphorylierter Proteinformen ergänzen Sie den RIPA-Puffer mit Protease- und Phosphataseinhibitoren 14 . Mittlerweile können Schritte für andere Komponenten der Gewebeverarbeitung, wie Fixierung (Abschnitt 7), durchgeführt werden.
    3. Die Zentrifuge auf 4 ° C vorkühlen lassen.
    4. Mit einem Plastikstößel homogenisieren das Gewebe im RIPA-Puffer enthaltenden Rohr. Sonate das Gewebe für 10-15 s bei 20% Amplitude. Stellen Sie sicher, dass die ProbeBleibt auf Eis, auch während der Beschallung.
    5. 10 min bei 15.000 xg und 4 ° C zentrifugieren.
    6. Aliquotieren Sie den Überstand in 50 μL-Schritten in neue 0,5-ml-Röhrchen (abhängig von den beabsichtigten nachgeschalteten Anwendungen, wobei jede Inkrementgröße gewählt werden kann).
    7. Lagern Sie die Aliquots von Proteinlysat in einem Gefrierschrank von -80 ° C, bis die nachgeschalteten Anwendungen eingeleitet werden ( zB ELISAs oder Western Blots) 20 , 21 .

5. Primäre menschliche VS-Kultur

  1. Tag 1
    1. Trennen Sie das VS-Gewebe, das für die Zellkultur (die in Kulturmedium sitzt, wie in Schritt 1.2.6 beschrieben) in etwa 1 mm 3 Stücke mit einer Pinzette in jeder Hand.
    2. Das Tumorstück enthaltende Medium mit einer 10 mL serologischen Pipette aufnehmen und alle Inhalte auf ein 15 ml konisches Röhrchen übertragen.
    3. Zentrifuge für 3 min bei1.000 xg und 25 ° C.
    4. Bereiten Sie das Zerfallsmedium in einer neuen 60 mm Kulturschale vor, indem Sie 4,7 ml ergänztes DMEM / F-12-Medium mit 250 μl Kollagenase (Endkonzentration: 160 U / ml) und 50 μl Hyaluronidase (Endkonzentration: 250 U / ml) , Für ein Endvolumen von 5 ml.
      HINWEIS: Beide Enzyme sollten in einem Gefrierschrank von -20 ° C gelagert werden, aber vor der Vorbereitung dieses Mediums aufgetaut werden (Schritt 1.2.2).
    5. Nach der Zentrifugation bilden die Tumorstücke ein Pellet am Boden des Kegelrohres. Sorgfältig pipettieren und den Überstand verwerfen.
    6. Füge 2 ml des frisch hergestellten Enzym-haltigen Desintegrationsmediums (Schritt 5.1.4) zum Tumorpellet hinzu. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um das Gewebe zu mobilisieren und übertragen Sie das Tumorstück mit Medium auf die 60 mm Kulturschale.
    7. Legen Sie die Kulturschale 18 h in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 ).
  2. Tag 2
    1. Warm DMEM / F-12-Medium, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin (hergestellt in Schritt 1.1) in einem 37 ° C Wasserbad.
    2. Entfernen Sie die Petrischale, die die VS-Kultur enthält, aus dem Inkubator (Schritt 5.1.7). Unter Verwendung einer 22 G-Nadel, die an einer 6-ml-Spritze befestigt ist, saugt das kulturhaltige Medium ein und transferiert es auf ein neues 15 ml konisches Röhrchen.
    3. 5 min bei 1000 xg und 37 ° C zentrifugieren.
    4. Verwenden Sie in der Zwischenzeit sterile Pinzette, um die erforderliche Anzahl von Poly-D-Lysin- und Laminin-beschichteten Glasdeckgläschen in eine 24-Well-Kulturplatte zu legen.
      ANMERKUNG: Die Anzahl der zu kultivierenden Brunnen hängt von der Größe des Exemplars ab; Ca. 24-32 Wells können aus einem 1 cm 3 Tumor kultiviert werden, so dass für die meisten kleineren Tumoren die Planung für 8-16 Wells von kultivierten Zellen geeignet ist.
    5. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen ( dh enzymangereichertes Medium) und das restliche Zellpellet in frischem, ergänztem DMEM / F-12-Medium aufwärmen, vorwärmenEd in Schritt 5.2.1.
      HINWEIS: Das Volumen, in dem das Pellet resuspendiert wird, wird durch die Anzahl der in Schritt 5.2.4 geplanten Brunnen bestimmt und schätzt 1 ml Medium pro geplanten Brunnen.
    6. Aspirieren Sie 2 ml des resuspendierten Zellmediums (Schritt 5.2.5) unter Verwendung einer 5 ml serologischen Pipette. Setzen Sie 1 ml des Tumorzell-haltigen Mediums in jede vorbereitete Vertiefung der 24-Well-Platte ein.
    7. Setzen Sie das Absaugen und Abscheiden von Tumorzellen-haltigem Medium fort (Absaugung in Schritten von 2 ml, von denen 1 ml in jede geplante Bohrung abgelagert wird), bis die Tumorzellsuspension gleichmäßig zwischen allen vorbereiteten Vertiefungen aufgeteilt ist.
    8. Legen Sie die 24-Well-Platte in den 37 ° C-Inkubator über Nacht.
  3. Tag 3
    1. Wenn auf dem Boden der Vertiefungen signifikante Ablagerungen festgestellt werden, ändern Sie das Medium in jeder Vertiefung sorgfältig auf ein neues ergänztes DMEM / F-12-Kulturmedium, wobei darauf zu achten ist, dass keine adhärenten Zellen entfernt werden. Wenn nicht, bringen Sie die Platte in den Inkubator und ändern Sie thE Medium zum ersten Mal am Tag 5.
  4. Tage 5-7 und danach
    1. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.
      ANMERKUNG: Primäre menschliche VS- und GAN-Zellen werden in der Regel bis zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen, bei oder um 14 Tage alt, in Kultur gehalten. Die Kulturreinheit sinkt nach diesem 19 .

6. Primäre menschliche GAN-Kultur

  1. Tag 1
    1. Unter einem Seziermikroskop isolieren Sie Faszikel aus dem für die GAN-Kultur bezeichneten Gewebe (das in Kulturmedium sitzt, wie in Schritt 1.2.6 skizziert).
      1. Isoliere die Faszikel aus dem Epineurium und der Faserhülle, indem du das Perineurium nutzst. 5 Pinzette beim Verschließen des Epineuriums ohne Nr. 3 zangen
    2. Sobald die Faszikel aus dem umgebenden Epineurium ausreichend isoliert sind, überführen sie sie in eine neue Kulturschale mit 2 ml frischem SuppGefaltetes Medium.
    3. Schneiden Sie die Faszikel in 1 bis 2 mm Segmente mit dem Skalpellblatt.
    4. Die kleinen Faszikelstücke und das umgebende Medium in ein 15-ml-Röhrchen pipettieren, das 3 ml frisches, ergänztes Kulturmedium enthält, so dass das Gesamtvolumen im 15-ml-Röhrchen 5 ml beträgt.
    5. Die Probe für 3 min bei 1000 xg und 25 ° C zentrifugieren.
    6. Mittlerweile ein Schwann-Zellkulturmedium in einer neuen 60-mm-Petrischale herstellen, indem man 4,7 ml ergänztes DMEM / F-12-Medium, 250 μl Collagenase und 50 μl Hyaluronidase für ein Endvolumen von 5 ml kombiniert.
      HINWEIS: Beide Enzyme bei -20 ° C aufbewahren; Auftauen sie bei Raumtemperatur vor der Vorbereitung dieses Mediums (Schritt 1.2.2).
    7. Nach der Zentrifugation der Probe werden die Faszikel zu einem kleinen Pellet im konischen Röhrchen kondensieren. Den Überstand verwerfen.
    8. Füge 2 ml des frisch hergestellten enzymhaltigen Desintegrationsmediums (Schritt 6.1.6) zum Nervenpellet hinzu. Pipette auf und dMehrmals zu besitzen, um das Gewebe zu mobilisieren und es auf eine neue 60 mm Kulturschale zu übertragen.
    9. Legen Sie die Schale in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 ) für 20-22 h.
      HINWEIS: Dies ist eine längere Inkubation, die für VS-Proben benötigt wird (Schritt 5.1.7).
  2. Tag 2
    1. Warmes ergänztes DMEM / F-12 Medium in einem 37 ° C Wasserbad.
    2. Unter Verwendung einer 22 G-Nadel, die an einer 6-ml-Spritze befestigt ist, saugt das Zellkultur-haltige Medium ein und überträgt es auf ein neues 15 ml konisches Röhrchen.
    3. 5 min bei 1000 xg und 37 ° C zentrifugieren.
    4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Probe in neuem, vorgewärmtem, ergänztem DMEM / F-12 Kulturmedium.
    5. Verwenden Sie sterile Pinzette, um die erforderliche Anzahl von beschichteten Deckgläschen in die Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte zu legen.
      HINWEIS: Die Berechnung von zwei Vertiefungen von kultivierten Zellen pro 1-cm-Nervenprobe fördert ein robustes Kulturwachstum.
    6. Füge 1 ml des kulturhaltigen Mediums zu jedem hinzuGut benannt in der 24-Well-Platte.
    7. Legen Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 .
  3. Tag 3
    1. Wenn in den Brunnen signifikante Ablagerungen festgestellt werden, ersetzen Sie sorgfältig das Medium mit neuem ergänztem DMEM / F-12-Kulturmedium, wobei darauf zu achten ist, dass keine adhärenten Zellen entfernt werden. Wenn nicht, bringen Sie die Platte zum Inkubator zurück und wechseln Sie das Medium zum ersten Mal am Tag 5.
  4. Tage 5-7 und danach
    1. Ändern Sie das Medium alle 3 Tage.

7. VS & GAN Tissue Fixierung

  1. Pipette 1-1,2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA, VORSICHT) in ein neues 1,5 mL Röhrchen pipettieren.
  2. Nach dem Waschen des Tumors oder Nervs mit PBS (Schritt 1.2.3) ein kleines Stück Gewebe (ca. 3 mm 3 VS oder 5 mm Länge GAN) in 4% PFA überführen und das Röhrchen bei 4 ° auf einen Schüttler stellen C. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in t eingetaucht istEr lösung
  3. Nach mindestens 2 h Fixierung das Röhrchen aus dem Schüttler abholen und weiterverarbeiten ( zB Einbettung in Paraffin oder optimale Schneidtemperaturverbindung (OCT) für nachfolgende Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz) 22 , 23 , 24 . Alternativ kann das Gewebe, wie zuvor beschrieben, 25 , 26 eingefroren werden.

8. Sammlung und Lagerung von menschlicher Perilymph während der Translabyrinthischen VS-Resektion

  1. Lege drei sterile 1,5 mL Röhrchen auf Eis.
    ANMERKUNG: Ein Röhrchen wird im Falle einer Kontamination als Sicherung aufbewahrt.
  2. Füllen Sie ein 1,5 mL Röhrchen mit ca. 1,2 mL PBS-Lösung, die zweimal mit einem 0,22 μm Filter filtriert wurde.
    ANMERKUNG: Um Perilymph während einer translabyrinthischen VS-Resektion zu sammeln, muss der Chirurg zuerst sicherstellen, dass die surgiCal Feld ist frei von Knochenstaub, Blut oder Kochsalzlösung. Der Chirurg kann hierfür ein Schuknecht 21 oder 24 G Saugrohr in der nicht dominanten Hand verwenden.
    Ein typischer Ort, um die Perilymph zu extrahieren, ist der seitliche halbkreisförmige Kanal (jedoch kann auch der hintere halbkreisförmige Kanal oder die runde Fenstermembran je nach Vorliebe des Chirurgen zugegriffen werden). Der Chirurg sollte den labyrinthischen Knochen vorsichtig mit einem Diamantbohrer (unter Verwendung einer kontinuierlichen Saugbewässerung) entfernen, um die blaue Linie ( dh das membranöse Labyrinth) des halbkreisförmigen Kanals zu identifizieren. Der halbkreisförmige Kanal wird durch die blaue Linie mit einer langen 27 G-Nadel, die an einer 1 ml Tuberkulinspritze befestigt ist, durchdrungen.
  3. Bitten Sie den Chirurgen, vorsichtig eine kleine Menge an Perilymph zu saugen und dann die Spritze und die Nadel an die chirurgische Krankenschwester zu leiten.
    HINWEIS: In der Regel wird ein Tropfen Perilymph oder weniger gesammelt. Wenn das beobachtete Volumen größer ist, ist die Probe wahrscheinlich mit anderen f verschmutztLuid
  4. Öffnen Sie das vorbereitete, leere 1,5 mL Röhrchen und das mit PBS gefüllte Tube direkt vor Gebrauch. Achten Sie darauf, dass Sie das Innere der Schlauchdeckel nicht berühren.
  5. Erhalten Sie die Spritze und befestigte Nadel von der chirurgischen Krankenschwester und spülen Sie die Flüssigkeit vollständig in die leere Röhre, wobei darauf achten, das Rohr nicht mit der Nadel zu berühren.
  6. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig von der Spritze ab. Verunreinigen Sie die Nadelspitze nicht und halten Sie sie in einer Hand fest.
    HINWEIS: Ein sehr kleines Volumen von Perilymph wurde gesammelt, so dass etwas Flüssigkeit in der langen Spitze der Nadel bleiben kann.
  7. Verwenden Sie mit der anderen Hand die Spritze selbst (ohne die Nadel), um 0,2 ml gefilterte PBS-Lösung aus dem vorbereiteten Rohr in den Körper der Spritze zu saugen.
  8. Bringen Sie die Nadel wieder an die Spritze an. Völlig evakuieren Sie die Spritze in die Röhre mit Perilymph, mit dem sterilen PBS, um die Nadelspitze zu spülen.
  9. Schließen Sie die Perilymph- und PBS-haltigen Röhre und legen Sie sie auf Es auf Eis.
  10. Entsorgen Sie die Nadel in einem Splitterbehälter.
  11. Legen Sie das Röhrchen so schnell wie möglich in den Gefrierschrank von -80 ° C.

9. Sammlung und Lagerung von menschlichem CSF

  1. Legen Sie drei (oder mehr) sterile 1,5 ml Röhrchen auf Eis.
    HINWEIS: Ein Röhrchen ist ein Backup im Falle einer Kontamination oder eines Probenvolumens, das größer als erwartet ist.
  2. Nach dem Öffnen der Dura mater, fragen Sie den Chirurgen, um CSF mit einer 3 ml Spritze (ohne angehängte Nadel) zu sammeln.
    HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, sollte die CSF-Sammlung unmittelbar nach der Eröffnung der Dura mater erfolgen.
  3. Bitten Sie den Chirurgen, die Spritze der chirurgischen Krankenschwester zu übergeben.
  4. Erhalten Sie die Spritze von der chirurgischen Krankenschwester und evakuieren Sie das erforderliche Volumen an CSF in die Röhre (n).
  5. Schließen Sie die Röhre und legen Sie sie auf Eis.
  6. Legen Sie die Röhrchen so schnell wie möglich in die Gefrierschrank -80 ° C.
E "> 10. Virale Transduktionsexperimente für primäre VS-Zellen

  1. Unter Verwendung der viralen Stammkonzentration als Referenz berechnen Sie die gewünschte Genomzahl (gc) Zahl und die Multiplizität der Infektion (MOI), die für das vorgeschlagene Transduktionsexperiment erforderlich ist; Virus-Stamm kann direkt in ergänztes Kulturmedium verdünnt werden.
    HINWEIS: Jeder für die Primärzelltransduktion geeignete Virusvektor kann verwendet werden; Siehe Landegger et al. (2017) für einen detaillierten Vergleich von sechs verschiedenen Adeno-assoziierten Virus-Serotypen 27 . Zusätzlich werden bei der Kultivierung von primären menschlichen Zellen die Zellzahlen nicht typischerweise bestimmt, bevor sie auf Deckgläschen aufgebracht werden. Primäre VS-Zellen reagieren nicht gut auf Trypsinisierung und Passage, so dass für eine zuverlässige MOI-Berechnung die Anzahl der adhärenten Zellen pro gut mit einem Phasenkontrastmikroskop abgeschätzt werden kann. Alternativ, wenn Zellen nahe an Konfluenz sind, können ihre Zahlen zuverlässig unter Verwendung von Standardzelldichtewerten für geschätzt werdenEine Platte mit 24 Vertiefungen ( z. B. 5 x 10 & sup4; Zellen pro Vertiefung).
  2. Unter einer laminaren Strömungshaube wird ein ergänztes Medium, das die gewünschte Menge an Virus enthält, in einem 15 ml konischen Laborröhrchen hergestellt, so dass 1 ml virushaltiges Medium für jede zu transduzierende Quelle von Zellen hergestellt wird. Pipettieren Sie das Virus-haltige Medium nach oben und unten, um vorsichtig, aber gründlich zu mischen.
  3. Mit sterilen Pinzetten die Deckgläser, die primäre VS-Zellen enthalten (Schritt 5.2.8), von der ursprünglichen 24-Well-Platte auf eine neue 24-Well-Platte übertragen. Nach der Übertragung jedes einzelnen Deckglases wird 1 ml virushaltiges Medium zugesetzt. Stoßen Sie die Platte jedes Mal, wenn Medium hinzugefügt wird, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig mit dem Virus beschichtet werden.
  4. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für die Dauer des geplanten Experiments.
    HINWEIS: Inkubationen von 48-120 h haben alle vielversprechende Transduktionsergebnisse gezeigt 27 .

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Ergebnisse

Primäre menschliche VS-Zellen in Kultur, wie in Abschnitt 5 beschrieben, können als informative Modelle für krankheitsassoziierte Prozesse in vielen nachgeschalteten Forschungsanwendungen behandelt werden ( Abbildung 1 ). Gesunde Schwann-Zellen, die in Abschnitt 6 kultiviert wurden, liefern einen direkten und lehrreichen Vergleichspunkt. Wie im Folgenden beschrieben, sind umfangreiche Daten von VSs und GANs, die nach diesem einheitlichen methodischen Rahmen ...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt einen einheitlichen methodischen Rahmen für die VS-Forschung und skizziert die gleichzeitige Verarbeitung von menschlichen VS- und GAN-Proben für nachgeschaltete Forschungsanwendungen. Da die VS-Forschung das Alter der Präzisionsmedizin betritt, wird die Vorbereitung der gleichen Probe in Formen, die in der Lage sind, zahlreiche Forschungsfragen zu beantworten, die Entdeckung molekularer, zellularer, genetischer und proteomischer Erkenntnisse, die für einzelne Patienten spezifisch sind, ermö...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und andere Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (unterstützt JES und SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-14-1-0091 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS) , Die Nancy Sayles Day Foundation (KMS), das Lauer Tinnitus Research Center (KMS) und die Barnes Foundation (KMS).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BioCoat Poly-D-Lysin/Laminin 12 mm #1 Deutsches GlasdeckglasCorning354087Oder bereiten Sie Deckgläser mit Corning Laminin (CB-40232) und Cultrex Poly-L-Lysin (3438-100-01) vor...
CELLSTAR 15 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, sterilGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, Graduierung, sterilGreiner Bio-One227261
CELLSTAR Zellkulturschale, 60 mmGreiner Bio-One628160
Kollagenase aus Clostridium histolyticum, steril gefiltertSigma-AldrichC1639
Costar 24 Well Clear TC-treated Multiple Well Platten, sterilCorning3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein Glutamin, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 Pinzette, DumoxelFine Science Tools11231-30Autoklav vor dem Gebrauch
Dumont #5 Pinzette, Standardspitze, InoxFine Science Tools11251-20Autoklav vor dem Gebrauch
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028Aliquot in 50 mL Röhrchen und Lagerung in -20°; C Gefrierschrank
Hyaluronidase aus Rinderhoden, Typ I-S, lyophilisiertes PulverSigma-AldrichH3506
Millex-GP Spritzenfiltereinheit, 0,22 &Mikro; m, Polyethersulfon, 33 mm, sterilEMD-MilliporeSLGP033RS
Paraformaldehyd, Reagenzqualität, kristallinesSigma-AldrichP6148Vor der Verwendung: Festlegung von Standardarbeitsanweisungen auf der Grundlage der online verfügbaren Protokolle
PBS, pH 7,4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023Autoklav vor der Verwendung
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml), 100 mLThermo Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP Phosphatase-Inhibitor-TablettenRoche04906845001
Pierce Protease-Inhibitor-TablettenThermo Fisher Scientific88666
Pipetten und Pipettenspitzen, 5/10/25 mLVariabler
variabler Homogenisierungsstößel aus Kunststoff für 1,5/2,0 mL MikroröhrchenE& K ScientificEK-10539
PrecisionGlide Nadeln, 27 G x 1 1/2 ZollBD301629
RIPA PufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (RNA-Stabilisierungslösung)Thermo Fisher ScientificAM7021
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 0,5 mLEppendorf022363719Autoklav vor Gebrauch
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Polypropylen, 1,5 mLEppendorf022363204Autoklav vor Gebrauch
Kochsalzlösung - 0,9% Natriumchlorid-Injektion, bakteriostatisch, 20 mLHospira0409-1966-05
Skalpellklingen - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht Saugrohr 24 GaugeBausch + LombN1698 42Nützlich für den chirurgischen Zugang (zusätzlich zu den üblichen otologischen chirurgischen Instrumenten) und z. B. ein blauer chirurgischer Marker
Probenbehälter, ODER steril, 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C StereomikroskopZeiss000000-1106-133
Spritze/Nadel-Kombination, Luer-Lok-Spitze, 5 mL, 22 g x 1 in.BD309630
Nur Tuberkulin-Spritze, Slip-Spitze, 1 mLBD309659
nur Tuberkulin-Spritze, Slip-Tip, 3 mLBD309656
Ultraschall-Homogenisator, Serie 4710, CV18-SondeCole-ParmerCP25013

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