Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in Drosophila

Summary

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Abstract

Die Etablierung funktioneller neuromuskulärer Schaltkreise beruht auf präzisen Verbindungen zwischen der Entwicklung von Motoraxonen und Zielmuskeln. Motorneuronen erweitern die Wachstumskegel, um auf bestimmten Wegen zu navigieren, indem sie auf eine große Anzahl von Axon-Guidance-Cues reagieren, die von der umgebenden extrazellulären Umgebung ausgehen. Die Wachstumskegel-Ziel-Erkennung spielt auch eine entscheidende Rolle bei der neuromuskulären Spezifität. Diese Arbeit stellt ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll dar, um motorische Neuronprojektionen von späten Stadium-16 Drosophila melanogaster Embryonen zu visualisieren . Dieses Protokoll enthält einige wichtige Schritte, einschließlich eines Genotypisierungsverfahrens, um die gewünschten mutanten Embryonen zu sortieren; Ein Immunfärbeverfahren, um Embryonen mit Fasciclin II (FasII) Antikörper zu markieren; Und ein Dissektionsverfahren, um gefilterte Präparate aus festen Embryonen zu erzeugen. Motor-Axon-Projektionen und Muskelmuster in der Peripherie sind viel besser in flachen Präparationen von filtrierten Embryonen sichtbar als in whOle-Mount Embryonen Daher bietet die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt sind, ein mächtiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pfadfindung und die Zielerkennung erforderlich sind, und sie können auch sowohl auf die Funktionsstörungen als auch auf die Funktionsgenauigkeits-Gattungsbildschirme angewendet werden .

Introduction

Präzise und selektive Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der embryonalen Entwicklung sind für die normale Fortbewegung in Drosophila- Larven essentiell . Die embryonale Strukturierung von 30 Muskelfasern in jedem der Bauchhöhenselemente A2-A7 wird nach Stufe 16 ¹ hergestellt. Die 36 motorischen Neuronen, die im ventralen Nervenkabel erzeugt werden, verlängern ihre Axone in die Peripherie, um spezifische Zielmuskeln zu innervieren ² . Die motorische Axonpfadfindung und die Zielerkennung können durch Immunhistochemie mit einem Antikörper (Mausmonoklonaler Antikörper 1D4)

Protocol

1. Vorbereitung

1. Vorbereitung von 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) -Lösung durch Zugabe von 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 ml t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Tabelle der Materialien) auf 500 ml 1X PBS Und Rühren für mindestens 30 min. Bei 4 ° C aufbewahren. Verwenden Sie, wenn relativ frisch und speichern Sie die Lösung in einer sauberen Flasche.
2. Mischen Sie 10 ml 4% Paraformaldehyd durch Zugabe von 2,5 ml einer 16% igen Stamm-Paraformaldehydlösung und 1 ml 10x PBS zu 6,5 ml entionisiertem Wasser. Bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb einer Woche verwenden.
   ACHTUNG: Hautk....

Results

Präzise Verbindungen zwischen motorischen Axonen und Zielmuskeln während der neuronalen Entwicklung hängen von der selektiven Axonaxonabstoßung und der Zielerkennung an bestimmten Wahlpunkten ab ⁴ . In Drosophila wird die selektive Abstoßung zwischen motorischen Axonen teilweise durch die kombinierte Wirkung von Klasse 1 und 2 Semaphorinen (Semas), einschließlich Sema-1a, Sema-2a und Sema-2b ^{8 , 14}

Discussion

Die Details der Motor-Axon-Führungsdefekte werden durch die gefilterte Vorbereitung von DAB-gefärbten Embryonen schneller und mit besserer Genauigkeit erzielt als durch eine konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Laserscanning. Daher eignet sich die filtrierte Präparation von fixierten und 1D4-gefärbten Embryonen am besten für die funktionelle Charakterisierung von Guidance Cue Molekülen. Vier Hauptklassen von Leitlinien, darunter Netrine, Schlitze, Semaphorine (Semas) und Ephrine, und ihre verwandten Rezeptore.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehydlösung	Ted Pella	18505
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S5886
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P5405
Natriumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	30435
Natriumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrat	US Biological	X1000	X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galaktosid, Galactopyranosid)
Dimethylsulfxid	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat	Sigma-Aldrich	P9387
Kaliumhexacyanoferrat(III)	Sigma-Aldrich	244023
Wasserstoffperoxid	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoat)	Sigma-Aldrich	H5501
Kulturschale (60 mm)	Corning	430166
Tricon Becher	Simport	B700-100	Dies wird verwendet, um einen Kunststoffbecherkäfig für die Embryonenentnahme herzustellen.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptan	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normales Ziegenserum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII	Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	1D4 Anti-Fasciclin II
Ziege Anti-Maus-HRP Antikörper	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Maus IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Objektträger Glas	Duran Group	235501403
Deckglas	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Spritze	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Wolframnadel	Ted Pella	#27-11	Wolframdraht, ø 0.13mm/6.1m (ø. 005"/20 ft.)
Nutator (Mini Twister)	Koreanische Wissenschaft	KO. VS-96TWS	Alternativ auch BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)