Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Skalierung der Anzahl der messbaren Parameter, die eine multidimensionale Datenanalyse und damit höhere statistische Konsequenzen ermöglicht, war der Haupttrend in der fortgeschrittenen Entwicklung der Durchflusszytometrie. Besonders das Hinzufügen hochauflösender Imaging-Fähigkeiten ermöglicht die komplexe morphologische Analyse von zellulären / subzellulären Strukturen. Dies ist bei Standard-Durchflusszytometern nicht möglich. Allerdings ist es wertvoll, unser Wissen über zelluläre Funktionen voranzubringen und kann der Life Science Forschung, der klinischen Diagnostik und der Umweltüberwachung zugute kommen. Die Einbindung von bildgebenden Fähigkeiten in die Durchflusszytometrie beeinträchtigt den Assay-Durchsatz, vor allem aufgrund der Einschränkungen der Geschwindigkeit und der Empfindlichkeit in den Kameratechnologien. Um diese Geschwindigkeits- oder Durchsatz-Herausforderung zu überwinden, die der bildgebenden Durchflusszytometrie unter Beibehaltung der Bildqualität entgegensteht, wurde die asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) gezeigt, um ein kontrastreiches, einzelliges Individuum zu ermöglichenMit subzellulärer Auflösung, bei einem Bilddurchsatz bis zu 100.000 Zellen / s. Basierend auf dem bildgebenden Konzept der konventionellen Zeitstreck-Bildgebung, das durch die Verwendung von ultraschnellen Breitband-Laserpulsen auf die gesamte optische Bildcodierung und -abfrage beruht, führt ATOM die Bildgebungsleistung weiter, indem der Bildkontrast von unmarkierten / ungefärbten Zellen verbessert wird. Dies geschieht durch den Zugriff auf die Phasengradienteninformation der Zellen, die spektral in Einzelschuss-Breitbandimpulse codiert wird. Daher ist ATOM besonders vorteilhaft bei Hochdurchsatzmessungen von Einzelzellmorphologie und Textur - Information, die auf Zelltypen, Zustände und sogar Funktionen hindeutet. Letztendlich könnte dies zu einer leistungsfähigen bildgebenden Durchflusszytometrieplattform für die biophysikalische Phänotypisierung von Zellen werden, die den derzeitigen, auf dem Stand der Technik basierenden zellulären Test auf biochemischem Marker ergänzt. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erstellung der Schlüsselmodule eines ATOM-Systems (vom optischen Frontend bis hin zu Daten pRüstungs- und Visualisierungs-Backend) sowie der Workflow der bildgebenden Durchflusszytometrie auf Basis von ATOM unter Verwendung menschlicher Zellen und Mikroalgen als Beispiele.
Einleitung
Die optische Bildgebung stellt ein leistungsstarkes Werkzeug und zellbasiertes Assay dar, um die detaillierte räumliche Verteilung vieler zellulärer / subzellulärer Komponenten (fast) nicht-invasiv zu visualisieren und so eine Vielzahl von morphologischen, biophysikalischen und biomolekularen Signaturen von Zellen aufzudecken. Allerdings wurde diese Fähigkeit, hochinhaltswerte Informationen aus einzelnen Zellen zu extrahieren, im Allgemeinen beeinträchtigt, als eine enorme und heterogene Population von Zellen untersucht werden musste. Dies markiert einen gemeinsamen Kompromiss in zellbasierten Assays zwischen Messdurchsatz und Inhalt. Ein bemerkenswertes Beispiel ist....
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Protokoll
1. Probenvorbereitung
- Probenvorbereitung (adhärente Zellen, MCF-7-Zellen)
- Nehmen Sie die Zellkulturschale aus dem Inkubator heraus und entleeren Sie das Kulturmedium.
- Spülen Sie die Zellen auf einer Schale mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um überschüssiges Kulturmedium zu entfernen.
- Füge 3 ml einer Lösung von 0,25% Trypsin zur Kulturschale (Durchmesser von 100 mm) hinzu und lege sie in einen 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für 4 min.
HINWEIS: Das Trypsin löst das adhäsive Protein der Zellen auf, so dass sie sich von der Kulturschale lösen. - Überprüfen Sie, ob sich alle Zell....
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Ergebnisse
Diese Arbeit veranschaulicht zwei Einzelzell-Imaging-Demonstrationen von ATOM: eine mit Säugetierzellen (menschliche periphere Blutmononukleäre Zellen s (PBMC) und Brustkrebszellen (MCF-7)) und eine andere mit Phytoplankton s (Scenedesmus und Chlamydomonas). Das erste Experiment wurde durch das wachsende Interesse an der Flüssigbiopsie für die Detektion, Aufzählung und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) im Blut motiviert. Die F.......
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Diskussion
Es gibt mehrere technische Details, die während des ATOM-Systemaufbaus besondere Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst ist zu beachten, dass asymmetrische / schräge spektral-kodierte Beleuchtungen im Absorptionskontrast Restphasen-Gradienten-Komponenten ( dh die Shadowing-Wirkung) einführen und die Verstärkung des Phasenkontrastes in ATOM beeinflussen können. Daher sollte dieser Effekt der Schrägbeleuchtung minimiert werden. Zweitens sollte betont werden, dass das Zeitmultiplex- oder Zeitverschachtelungsschema, da.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Herrn P. Yeung für die Vorbereitung der MCF-7 für uns. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Forschungsstipendienrats der Sonderverwaltungsregion Hongkong, China (Projekt Nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 und HKU 720112E), dem Programm für Innovation und Technologie (ITS / 090/14 ) Und dem Universitätsentwicklungsfonds der HKU.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nikon Plan Fluorit Physiologie Objektive 40X | Nikon | MRF07420 | Objektiv (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorit Objektiv, 0,75 NA, 0,51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objektiv (Obj1) |
| N-BK7 Plankonvexe Objektive | Thorlabs | LA1145-C | Zum Weiterleiten von Spektralduschen |
| FC/APC Faserkollimationspaket | Thorlabs | F220APC-1064 | Zum Ausgeben und Sammeln von Laserpulsen |
| Pellicle Strahlteiler | Thorlabs | BP145B3 | Zur Herstellung von Strahlrepliken |
| Geschützter Silberspiegel | Thorlabs | PF10-03-P01 | Zur Reflexion von Licht |
| 800-1650nm 12GHz Singlemode DC-gekoppelter NIR-Fotoempfänger | Newport | 1544-B | Zur Umwandlung von Licht in elektrisches |
| Signal Infiniium Hochleistungsoszilloskop | Agilent | DSOX91604A | Zur Speicherung der lichtkonvertierten elektrischen Signale |
| HI1060 Glasfaser | Corning | HI1060 | Glasfaser für Time-Stretch |
| YTTERBIUM DOTIERTER FASERVERSTÄRKER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optischer Inline-Verstärker |
| Holographisches Gitter | Wasatch Photonics | 020305-6 | Gitter |
| Infusions-/Entnahmespritze Pumpen | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Spritzenpumpe für die Probenbeladung in mikrofluidischen Kanälen |
Referenzen
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic ph....
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Nachdrucke und Genehmigungen
