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Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

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DOI:

10.3791/55841

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7. August 2017

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1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine neue klinische Grade Isolation und Kultur Methode zur Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen (kPSCs) anhand der gesamten Organ Perfusion mit Verdauungsenzymen und NG2-Zelle Bereicherung. Mit dieser Methode ist es möglich, ausreichende Zellzahlen für Zelltherapie erwerben.

Zusammenfassung

Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind homöostatische und Immunsystem modulierende Gewebezellen, die wohltuende Wirkung bei Nierenerkrankungen und Transplantation gezeigt haben. Perivaskuläre Stromazellen Zellen (EAP) teilen Eigenschaften mit Knochenmark MSCs (BmMSCs). Jedoch besitzen sie auch, wahrscheinlich aufgrund lokaler Prägung, Gewebe-spezifische Eigenschaften und spielen eine Rolle bei der lokalen Gewebe Homöostase. Diese Gewebespezifität führen bestimmte Gewebereparatur, auch innerhalb der menschlichen Niere. Wir zeigten bisher, dass menschliche Niere EAP (kPSCs) Niere epitheliale Wundheilung während BmMSCs nicht dieses Potenzial hatte verbessert haben. Darüber hinaus können kPSCs Niere Verletzungen in Vivolindern. Daher bilden kPSCs eine interessante Quelle für Zelltherapie, insbesondere für Nierenerkrankungen und Nierentransplantation. Hier zeigen wir die detaillierte Isolation und Kultur-Methode für kPSCs von Transplantation-Grade menschliche Nieren basierend auf ganze Organ Perfusion von Verdauungs-Enzymen über die Nierenarterie und Bereicherung für die perivaskuläre Marker NG2. Auf diese Weise großzellige Mengen erhalten, die für die zelluläre Therapie eignen.

Einleitung

Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind modulierende Immunzellen, die ursprünglich aus dem Knochenmark isoliert wurden. Sie zeichnen sich durch ihre Spindel förmigen Morphologie, Fähigkeit, in Fett, Knochen und Knorpel und Kunststoff Termintreue zu unterscheiden. MSCs express die stromale Marker CD73, CD90, CD105 und negativ für die Marker CD31 und CD451,2,3. MSCs sind ein viel versprechender Kandidat für die Zelltherapie aufgrund ihrer Gewebe homöostatische und immunmodulatorische Kapazitäten. BmMSCs werden derzeit in klinischen Studien für verschiedene Krankheiten, einschließlich Nierenerkrankungen und Nierentransplantation wie an anderer Stelle überprüft4geprüft.

Bisher zeigte sich, dass perivaskuläre Zellen aus mehreren verschiedenen solide Organe, einschließlich Fettgewebe, Plazenta und Skelettmuskulatur mit MSCs9Merkmale teilen. Allerdings zeigen diese Zellen auch Gewebe-spezifische Funktionen die organotypischen Reparatur10führen kann. Menschlichen myokardialen perivaskuläre Zellen, z. B. angeregt angiogenen Antworten nach Hypoxie und differenziert in Kardiomyozyten, während perivaskuläre Zellen isoliert von anderen Geweben nicht diese Potenziale11zeigte.

Perivaskuläre Stromazellen Zellen können auch von der Maus12,13,14 und menschliche Niere15,16isoliert werden. Wir haben ausgiebig gekennzeichnet kPSCs und verglich diese mit BmMSCs. Wir festgestellt, dass kPSCs, ähnlich wie BmMSCs, immunsuppressive Kapazitäten und vaskulären Plexus Bildung unterstützen können. Allerdings gibt es Unterschiede zwischen der Zelltypen als kPSCs zeigte eine organotypischen transkriptionelle Ausdruck Signatur, einschließlich der nephrogenen Transkriptionsfaktoren, HoxD10 und HoxD11 Gewebe. kPSCs, im Gegensatz zu BmMSCs, nicht unterziehen, Myofibroblast Transformation nach Stimulation mit TGF-β und waren nicht in der Lage, sich in Adipozyten differenzieren. Darüber hinaus beschleunigt kPSCs epitheliale Integrität in einem Nieren röhrenförmige epithelialen Wunde kratzen Assay, ein Phänomen, das nicht mit BmMSCs beobachtet wurde. Diese erweiterten Wunde Reparatur wurde durch Hepatozyten-Wachstumsfaktor Freisetzung vermittelt. Darüber hinaus verbessert kPSCs Niere Verletzungen in einem Mausmodell der akuten Nierenversagens Verletzungen15. Daher kPSCs überlegene renal Reparatur Kapazitäten zu haben scheinen und sind eine interessante neue Quelle für die Zelltherapie bei Nierenerkrankungen.

Um kPSCs Zelle Therapie Zwecken nutzen zu können, sollte kPSCs in gewissem Sinne klinische Grade mit klinischen Grade Enzyme und Protokollen isoliert werden. Um mehrere Patienten mit kPSCs von 1 Spender behandeln zu können, sollte darüber hinaus ausreichend Zellzahlen erzielt werden. Hier zeigen wir im Detail, das klinische Grade isoliert Verfahren der kPSCs von ganzen Transplantation Grade Nieren, nachgiebig ausreichende Zahl von Zellen für Klinische Zelltherapie verwendet werden.

Protokoll

Das lokale medizinische Ethikkomitee und der ethische Beirat des europäischen Konsortiums (STELLAR) genehmigten die Erforschung und Entnahme von menschlichen Transplantatnieren, die hauptsächlich aus chirurgischen Gründen verworfen wurden. Die Forschungserlaubnis wurde für alle Nieren erteilt.

1. Vorbereitungen für die Zellkultur

  1. Bereiten Sie einen Pool mit Thrombozytenlysaten vor.
    1. Lagern Sie die Thrombozyten, die weniger als 2 Tage abgelaufen sind, bei -80 °C bis zur Verwendung (maximal 1 Jahr).
      HINWEIS: Die Blutplättchen wurden ursprünglich von einem kommerziellen Anbieter bezogen. Überschüssiges Material aus dem Krankenhaus, das von der örtlichen Blutbank verteilt wurde, wurde beschafft.
    2. Tauen Sie die Blutplättchen von mindestens 5 Donatoren (vorzugsweise 10) O/N bei 4 °C auf.
    3. Die Blutplättchen in einer großen sterilen Flasche poolen, in konische Zentrifugenröhrchen umfüllen und 10 min bei 1.960 x g bei 4 °C abschleudern.
      HINWEIS: Das Volumen der Blutplättchen hängt von der Anzahl der Spender und der Menge an überschüssigem Material aus dem Krankenhaus pro Spender ab.
    4. Pipettieren Sie den Überstand an Blutbeuteln (50 ml/Beutel) durch den Zylinder einer 50-ml-Spritze. Bei -80 °C lagern.
  2. Vorbereitung des Zellkulturmediums.
    1. Tauen Sie einen Beutel mit Thrombozytenlysaten in einem Wasserbad bei 37 °C auf.
    2. Geben Sie 1 l (d. h. 2 Flaschen) Minimum Essential Medium - alpha modification (alphaMEM), 5 ml 200 mM Glutamin und 20 ml Penicillin (5.000 U/ml)/Streptomycin (5.000 μg/ml) (Pen/Streptokokken) in den Beutel.
    3. 3 h bei 37 °C inkubieren.
    4. Schütteln Sie den Beutel zum Entgelchen, indem Sie vorsichtig auf den Beutel klopfen, wenn der Beutel auf einer ebenen Fläche aufliegt.
    5. Filtern Sie das 5%ige Thrombozytenlysatmedium, indem Sie die Lysate mit einer sterilen 50-ml-Spritze durch den Filter des Transfusionssystems ziehen.
    6. Das Medium wird in 50-ml-Röhrchen aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
      HINWEIS: Jede neue Charge von Thrombozytenlysaten wird in Zellkultur getestet und mit der vorherigen Charge verglichen, indem Cells of Interest (bmMSCs oder kPSCs) in beiden Chargen konfluenziert werden. In Bezug auf Zellzahl und Lebensfähigkeit sollten sich die in der neuen Charge gezüchteten kPSCs oder bmMCs nicht um mehr als 10 % unterscheiden, und die Markerexpression von CD73, CD90, CD105 und CD31, CD34 und CD45, wie sie durch Durchflusszytometrie analysiert wurde, sollte sich nicht unterscheiden. Die Methoden der Zellkultur sind in Abschnitt 6 des Protokolls (Kultur von kPSC) beschrieben.

2. Vorbereitungen für die Zellernte

  1. Vorbereitung von Lösungen.
    1. Bereiten Sie das reine Medium vor, indem Sie 10 mL Pen/Strep zu 500 mL (1 Flasche) Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12 hinzufügen.
    2. Bereiten Sie das Waschmedium vor, indem Sie 50 ml normales Humanserum (NHS) und 10 ml Pen/Streptokokken zu 1 Flasche DMEM-F12 hinzufügen.
    3. Bereiten Sie den Enzymstammpuffer vor, indem Sie 2,9 mL 1 M 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES), 1,2 mL NaHCO3 2,5 % [w/v] und 160 μl CaCl2 (1 M) zu 160 mL Lösung der University of Wisconsin hinzufügen.
    4. Bereiten Sie die Kollagenaselösung vor, indem Sie langsam 20 ml Enzymstammpuffer in die Flasche mit Kollagenase in GMP-Qualität geben, die >2.000 U/Flasche Kollagenase enthält. Bei 4 °C ca. 40 Min. auflösen. Während der Auflösungszeit mehrmals vorsichtig schütteln.
    5. Bereiten Sie das Gefriermedium vor, indem Sie 5 mL Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 45 mL NHS hinzufügen.
  2. Vorbereitung des Perfusionstabletts (Abbildung 1A).
    1. Reinigen Sie die Strömungskabine und die Abdeckung mit OP-Abdeckungen. Erhitzen Sie ein Wasserbad auf ca. 40 - 45 °C, um die Perfusionsschale auf 37 °C zu erhitzen. Ziehen Sie OP-Kittel und OP-Handschuhe an.
    2. Schließen Sie eine sterilisierte Perfusionsschale an das Wasserbad an, um die Perfusionsschale mit warmem Wasser vorzuwärmen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luft in der Perfusionsschale befindet, indem Sie mit der Perfusionsschale in vertikaler Position beginnen. Geben Sie bei Bedarf mehr Wasser in das Wasserbad, um einen Lufteinfluss in die Perfusionsschale zu verhindern.
    3. Setzen Sie den LS25-Schlauch in die Pumpe ein. Lassen Sie beide sterilen Enden des Schlauchs im Durchflussschrank. Legen Sie eine Kocher-Pinzette auf ein Ende des Röhrchens und lassen Sie sie auf dem Boden der Perfusionsschale ruhen. Legen Sie eine sterile Gaze auf die Tube, um eine Verstopfung zu vermeiden. Befestigen Sie einen Luer-Anschluss am anderen Schlauchende.
    4. Geben Sie ca. 100 mL reines Medium in die Perfusionsschale und beginnen Sie mit der Spülung des Schlauchs mit einer Pumpgeschwindigkeit von 100 mL/min.

3. Isolierung von Nierenzellen

  1. Vorbereitung der Niere.
    1. Nehmen Sie die Niere aus den doppelten sterilen Beuteln und legen Sie sie auf das sterile Perfusionstablett (Abbildung 1B). Entfernen Sie das perirenale Fettgewebe und die Nierenkapsel mit einer Schere und leichtem Reißen (Abbildung 1C) und identifizieren Sie die Nierenarterie am Aortenpflaster, wie in Abbildung 1D gezeigt.
    2. Kanülieren Sie die Nierenarterie mit dem akzessorischen Dorn, fixieren Sie sie mit einem sterilisierten Kabelbinder und befestigen Sie sie mit dem Luer-Anschluss am Pumpenrohrende, während die Pumpe eingeschaltet ist. Wenn die Schläuche nicht vollständig gefüllt sind, geben Sie zuerst mehr Medium in die Wanne und spülen Sie die Rohre, indem Sie die Pumpe starten (Abbildung 1E - F). Spülen Sie die Niere über die Pumpe mit reinem Medium mit einem Durchfluss von 100 mL/min.
  2. Kollagenase-Behandlung und Isolierung von Nierenzellen.
    1. Fügen Sie Kollagenase (20 ml, >2.000 μg) und DNase (2,5 ml, 1 mg/ml) in die Perfusionsschale hinzu (Abbildung 1G). Drehen Sie die Niere von Zeit zu Zeit sanft mit der Hand. Warten Sie, bis die Niere weich wird und die Perfusionsflüssigkeit weniger transparent wird (ca. 30 - 40 min).
    2. Massieren Sie die Niere sanft (Abbildung 1H), bis eine Zellsuspension erhalten wird (Abbildung 1I). Entfernen Sie unverdautes Material und den Dorn in der Nierenarterie.
  3. Waschen und Entnahme von Nierenzellen.
    1. Geben Sie 50 ml NHS in die Zellsuspension. Entleeren Sie die Zellsuspension aus der Perfusionsschale, indem Sie die Pumpe auf niedrigen Durchfluss stellen und den zuerst mit der Niere verbundenen Schlauch über den 50-ml-Röhrchen platzieren (Abbildung 1J).
    2. Bei 300 x g für 7 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Waschen Sie die Pellets mit einem Waschmedium mit 10 % NHS und zentrifugieren Sie erneut bei 300 x g für 7 min. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal. Messen Sie das Volumen der Zellpellets und fügen Sie das gleiche Volumen Zellkulturmedium hinzu.
    3. Entweder die Zellen von hier aus durch Zugabe von Gefriermedium 1:1 zur Zellsuspension kryokonservieren und in kryogenen Fläschchen nach Standardprotokollen lagern, oder die Zellen weiter kultivieren (Abschnitt 4).
      HINWEIS: Die Zellsuspension enthält Zellklumpen und erfordert zusätzliche Schritte, um einzelne Zellen zu gewinnen, was zu einer Zunahme des Zelltods führt. Daher werden die Zellen in Suspension gehalten und zu diesem Zeitpunkt nicht gezählt.

4. Zellkultur von rohen Nierenzellen

  1. Etwa 1 ml der Zellsuspension zu 24 ml alphaMEM 5 % Thrombozytenlysaten (Zellkulturmedium) in einem T175-Zellkulturkolben (Abbildung 1K) geben und bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren. Entfernen Sie das Medium und die Zelltrümmer nach 2 Tagen von den adhärenten Zellen und frischen Sie das Medium mit 25 ml Zellkulturmedium auf.
  2. Frischen Sie das Nährmedium zweimal pro Woche auf, indem Sie die Hälfte des Mediums (12,5 ml) entfernen und frisches Medium (12,5 mL) mit aseptischen Techniken hinzufügen.
  3. Kultur bis zum Zusammenfluss (normalerweise 5 - 7 Tage) (Abbildung 1L). Das Medium entfernen, zweimal mit PBS waschen und die Zellen trypsinisieren, indem 5 ml Trypsin in jeden T175-Kolben für 5 min bei 37 °C gegeben werden. In Kulturmedium waschen und 5 min bei 490 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.

5. Zellanreicherung für NG2 durch magnetische Zelltrennung (Abbildung 1M)

  1. Bereiten Sie den Zelltrennpuffer gemäß dem Protokoll des Herstellers vor.
  2. Resuspendieren Sie die trypsinisierten kPSCs in 10 ml Zelltrennungspuffer. 5 min bei 490 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen in 300 μl Zelltrennpuffer resuspendieren.
  3. 100 μl FcR-Blockierungsreagen/5 x 107 Zellen, 100 μl Anti-Melanom (NG2)-Kügelchen pro 5 x 107 Zellen zugeben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Die NG2-positive Fraktion wird gemäß dem Herstellerprotokoll getrennt. Geben Sie 10 mL Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 490 x g.
  4. Zählen Sie die Zellen mit einer Bürker Zählkammer nach dem Protokoll des Herstellers. Die Zellen werden in einen Kulturkolben (ca. 4 x 10,3 Zellen/cm2) gesät und inkubiert.
    HINWEIS: Die Zellen werden in den folgenden Konzentrationen ausgesät: <250.000 in einem T25-Kolben, 250.000 - 500.000 in einem T75-Kolben und 700.000 - 800.000 in einem T175-Kolben. Nach der magnetischen Zellanreicherung wird ein positiver Anteil von ca. 1 - 2% isoliert. Da es sich bei diesem Schritt jedoch um die Zellanreicherung und nicht um die Zellsortierung handelt, sind andere Zelltypen in der Kultur vorhanden (Abbildung 1N). Nach mehreren Passagen (in der Regel um die 4 - 5) ist nur eine homogene kPSC-Population vorhanden (Abbildung 1P).

6. Kultur der kPSCs

  1. Frischen Sie das Medium zweimal pro Woche auf, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und durch frisch aufgetautes Kulturmedium ersetzen (Abbildung 1N).
    HINWEIS: Die kPSCs sind tendenziell lebensfähiger und proliferativer, wenn nur die Hälfte des Mediums aktualisiert wird.
  2. Passierung von kPSCs.
    HINWEIS: Durchlaufen Sie die kPSCs entweder bei einer Konfluenz von 90 - 100 % oder wenn 3D-Strukturen auftreten (siehe Abbildung 1O) oder wenn seit mehr als einer Woche kein Zellwachstum stattgefunden hat. Die beiden letztgenannten könnten insbesondere in frühen Passagen nach der Zellanreicherung auftreten. In diesem Fall beginnen die Zellen nach der Passage in der Regel wieder in Monolayer-Kultur zu wachsen (Abbildung 1P).
    1. Entfernen Sie das Medium aus den 90 - 100% konfluenten Zellen (bewahren Sie das Medium für die spätere Verwendung auf). Waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Trypsin (0,5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) zugeben und 5 Minuten bei 37 °C inkubieren. Das alte Medium wird in den Kolben gegeben und vorsichtig wieder suspendiert.
    2. In ein 15- oder 50-ml-Röhrchen (je nach Volumen) umfüllen und 5 Minuten lang bei 490 x g zentrifugieren. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen und die Platte <250.000 in einem T25, 250.000 - 500.000 in einem T75 oder 700.000 - 800.000 in einem T175 (ca. 4 x 103 Zellen/cm2).
  3. Die kPSCs sind an Passage 5 oder 6 zu testen (z. B. Scratch-Assay, Abschnitt 7).
    HINWEIS: Charakterisieren Sie die vermehrten Zellen durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Standardprotokollen. Die Markerexpression von NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105 und HLA-ABC sollte alle positiv und CD31, CD34, CD45 und HLA-DR negativ sein. Test auf Mykoplasmen, Bakterien und Pilze im Nährmedium gemäß den Standardprotokollen des klinischen mikrobiologischen Labors. Testen Sie die kPSCs funktionell in einem Nierenepithel-Wundkratztest. Die Experimente werden in der Regel mit sterilen, durchflusszytometrisch bestätigten homogenen kPS-Populationen mit einer Wundheilungskapazität zwischen Passage 6 und 8 durchgeführt.
  4. Kryokonservierung der kPSCs durch Zugabe von 0,5 ml Kryokonservierungsmedium zu 0,5 ml Zellsuspension (2 Millionen Zellen pro ml Kulturmedium) unter Verwendung von Standardprotokollen.
    HINWEIS: Nach dem Auftauen die kPSCs mit einer höheren Dichte (106 Zellen in einem T175) aussäen.

7. Funktionstest von kPSCs: Nierenepithel-Wundkratztest

  1. Die kPS-Zellen werden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 200.000 Zellen/Well in 2 mL Kulturmedium kultiviert. Nach 48 h Kultur bei 37 °C, 5 % CO2, den Überstand auffangen. Dies ist das konditionierte Medium.
  2. Aussaat des HK-2 (proximale tubuläre Epithelzellen)17 in 2 ml proximaler tubulärer Epithelzelle (PTEC) Medium, bestehend aus einem 1:1-Verhältnis von DMEM-F12, ergänzt mit Insulin (5 mg/ml), Transferrin (5 mg/ml), Selen (5 ng/ml), Hydrocortison (36 ng/ml), Trijodthyrinin (40 pg/ml), epidermalem Wachstumsfaktor (10 ng/ml) und Pen/Streptokokken, in einer Dichte von 500.000 Zellen pro Well in einer 6-Well-Zellkulturplatte.
  3. 48 h bei 37 °C, 5 % CO2 kultivieren. Entfernen Sie das Zellkulturmedium des HK-2s und erzeugen Sie eine Kratzwunde in der Monoschicht des HK-2s, indem Sie mit der Spitze einer gelben Pipettenspitze einen Kratzer von oben nach unten in der Vertiefung machen. Waschen Sie die HK-2s mit PBS und fügen Sie das konditionierte Medium der kPSCs oder das Kontrollmedium hinzu. Markieren Sie auf der Unterseite der Platte den Bereich, der abgebildet werden soll.
    HINWEIS: Die HK-2s sollten konfluent sein. Stellen Sie sich zwei Bereiche pro Vertiefung vor.
  4. Den Kratzer bei 4, 8, 12 und 24 h an der gleichen markierten Stelle mit einem inversen Hellfeldmikroskop abbilden.
  5. Messen Sie den Kratzbereich in Bild J mit dem Polygonauswahlwerkzeug, um den Prozentsatz der Schließung zu bestimmen.

Ergebnisse

Die klinische Grade kPSCs Isolationsmethode ist in Abbildung 1zusammengefasst. Grobe Nierenzellen sind von menschlichen Transplantation Grade Nieren von Kollagenase Perfusion isoliert. Die daraus resultierende Zellsuspension ist bis zum Zusammenfluss in 5 % Thrombozyten Lysates kultiviert. Dann ist die perivaskuläre Stromazellen Zelle Bruchteil isoliert basierend auf NG2 Ausdruck.

kPSCs sind aus Kunststoff anhaftende spindelförmige Zellen (Abb. 2A) und positiv für die stromale Marker CD73, CD90, CD105 und perivaskuläre Marker NG2, PDGFR-B und CD146, während negativ für CD31, CD34, CD45 und HLA-DR (Abbildung 2B). In der Regel eine homogene Bevölkerung von kPSCs erreichen Sie in der Passage 4 und kPSCs erreichen Seneszenz um Durchgang 9-10 (Abbildung 2C). Wir empfehlen daher Experimente zwischen 5-8 Durchgang durchführen.

Um die Funktionsfähigkeit der isolierten kPSCs zu bewerten, führen wir einen in-vitro- Niere epithelialen Wunde kratzen Assay auf jede neue Charge von kPSCs, wie zuvor gezeigt, dass die konditionierte Medium der kPSCs beschleunigen kann epitheliale Wundheilung in dieser Kratzer Assay-15. Das kPSC konditionierten Medium erfolgt durch Kultivierung kPSCs für 48 h in AlphaMEM 5 % Thrombozyten Lysates und den Überstand zu sammeln. Als nächstes verewigt menschliche Niere proximale Röhrchen Epithelzellen (HK-2)17 sind bis zum Zusammenfluss kultiviert und dann Kratzen Wunde gemacht. Dann entweder die konditionierte Medium der kPSCs oder Kontrolle Medium wird hinzugefügt, um die Brunnen und die Geschwindigkeit der Wundheilung wird gemessen. Wenn die konditionierte Medium der kPSCs hinzugefügt wird, schließt die Wunde deutlich schneller (Abbildung 2D).

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Abbildung 1 : Klinische Grade Isolation Methode des menschlichen kPSCs. Transplantation Grade Nieren sind kanülierte durchströmt mit Kollagenase über die Nierenarterie (A - G) und die daraus resultierende Zellsuspension wird gewaschen und entweder kryokonserviert oder in Kultur (H - K). Nachdem die Zellen Konfluenz (L) erreicht haben, durchgeführt NG2 Zelle Bereicherung ist (M). Zellen sind trypsiniert wenn sie entweder konfluierende, sind nicht mehr vermehren oder wenn 3D-Strukturen (N - P) angezeigt. Die Freigabekriterien für kPSCs sind Sterilität, Marker Ausdruck und die Fähigkeit, röhrenförmigen epitheliale Wundheilung (Q) zu verbessern. Pfeil: Nierenarterie. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2: Charakterisierung des menschlichen kPSCs. Ein) kPSCs sind spindelförmig, Kunststoff adhärente Zellen. ( B) kPSCs sind positiv für mesenchymalen Marker CD73, CD90, CD105, perivaskuläre Marker NG2, PDGFR-β und CD146, während negativ für CD31, CD34 und CD45. kPSCs express MHC-Klasse ich (HLA-ABC) jedoch keine Klasse II (HLA-DR). ( C) Wuchsmerkmalen von drei verschiedenen kPSC Spender aus Durchflusszytometrie bestätigt homogene NG2 positive Populationen (Abschnitt 4). kPSCs erreichen Seneszenz um Durchgang 9-10. D) kPSCs sind in der Lage, Niere epithelialen Reparatur in einer Wunde kratzen Assay zu verbessern. Repräsentative Bilder von Kontrolle und kPSC bedingt Medium bei t = 0, 4, 8 und 12 h gezeigt. Maßstabsleiste a) = 200 µm, in D) = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Perivaskuläre Zellen wurden von vielen verschiedenen menschlichen solide Organe, einschließlich Fett, Knorpel, Bauchspeicheldrüse und Niere9,15,16isoliert. Die meisten Methoden basieren jedoch auf kleine Proben von Gewebe, die seziert und danach mit Verdauungsenzymen behandelt. Darüber hinaus erfolgt dies in der Regel nicht mit klinischen Grade Produkte. Dies macht diese Strategien weniger geeignet für direkte klinische Übersetzung befinden sich große Mengen an klinischen Grade Zellen notwendig.

Hier zeigen wir eine neuartige Isolationsmethode des menschlichen kPSCs für ganze Organe anhand der Perfusion mit klinischen Grade Enzyme und Materialien. Das Protokoll ist vom klinischen Langerhans-Inseln Isolierung Protokoll derzeit im Einsatz für die klinische Anwendung in unserem Zentrum18angepasst.

Dies ist die erste klinische Grade-Methode, wo große Mengen von kPSCs erreicht werden können. Die Variabilität der Zellausbeute ist weitgehend Geber angewiesen. Wenn die Zellausbeute erhalten wir derzeit von einem Bruchteil der rohen Zellsuspension von drei verschiedenen Gebern, in der Theorie extrapoliert ist konnte eine durchschnittliche Rendite von 2,7 x 1012 kPSCs pro Spender erreicht werden. MSC-Therapie besteht in der Regel aus 2 Zelle Infusionen mit 1-2 x 106 Zellen/kg Körper Gewicht4, genügen diese Zellzahlen allogene Behandlung von mehreren Patienten.

Ein entscheidender Schritt in der Isolierung-Prozedur ist die Dauer der Kollagenase Verdauung. Wenn die Verdauung Periode zu kurz ist, bleiben große Klumpen des Gewebes, die schwerer zu Kultur werden. Wenn die Perfusion Periode zu lang ist, kann erhöhte Zelltod beobachtet werden. Daher, sobald die Niere weich und die Flüssigkeiten weniger transparent zu werden beginnt, die Niere sollte sanft massiert und die Kollagenase-Behandlung abgebrochen werden sollte.

Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Kultur der Zellen nach der NG2 Zelle Bereicherung. Manchmal nach der NG2 Zelle Bereicherung starten die perivaskuläre Zellen nicht zu vermehren oder in 3D Strukturen zu wachsen beginnen. In diesem Fall wenn die Zellen trypsiniert und eingesät, startet die Zellen in der Regel in Monolayer Kultur wachsen.

Als Ausgangsmaterial, dienten menschliche Transplantation Grade Nieren hauptsächlich aus chirurgischen Gründen verworfen. Dies sind funktionelle Organe ohne großen Fibrose. Wir anerkennen, dass dies möglicherweise eine Einschränkung, da dies eine relativ seltene und schwer zu Orgel Quelle zu erhalten. Explantierten Nieren möglicherweise eine andere Quelle; jedoch, je nach dem Grund der Niere Explantation diese Nieren enthalten mehr Fibrose und somit Myofibroblasts, und daher vorsichtig vorzugehen, da Myofibroblasts könnten isoliert und statt perivaskuläre Zellen kultiviert.

Wie die kPSCs isoliert mit diesem Protokoll Show Organo-typisches Eigenschaften mit Niere epithelialen Wunde heilende Fähigkeiten15, Zell-Therapie mit kPSCs bei Nierenerkrankungen und Transplantation wäre eine interessante zukünftige Anwendung. Zu diesem Zweck gibt es mehrere Strategien der Zelle/Zelle Produktlieferung. Die erste Strategie ist IV-Infusion von kPSCs, wie derzeit in klinischen Studien BmMSC verwendet. Eine weitere interessante Anwendung ist die Verwendung von kPSCs oder kPSC ausgeschieden Faktoren bei der Perfusion der Maschine vor der Transplantation. Auf diese Weise könnte die Qualität der explantierten Niere verbessern die nach der Transplantation zu verbesserten Nierenfunktion führen könnten. Für beide Strategien sind kPSCs eine interessante neue Zelle Quelle für klinische Zwecke weiter zu erkunden.

Offenlegungen

D.G.L., M.A.E., und T.J.R. mit einer Patentanmeldung bezüglich dieser Forschung verbunden sind. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Forschung wird finanziell von der Europäischen Gemeinschaft siebten Rahmenprogramm (RP7/2007-2013) unter Grant Vertragsnummer 305436 STELLAR.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Baxter-BeutelFenwalR4R-7004
Menschliche BlutplättchenSanquinKrankenhausüberschüssiges Material, das für weniger als 2 Tage abgelaufen ist, wird
verwendet Blutplättchenlysatnach Maß Sterile
EinwegflaschenCorning09-761-11
500 mL PP-ZentrifugenröhrchenCorning431123
a-MEM mittelLonzaBE12-169F
GlutamaxThermo Fisher35050038
Stift/StreptokokkenInvitrogen15070063
TransfusionssystemCodan455609
DMEM-F12life technologies11320-074
Normales Humanserum (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7,5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWBrücke zum Leben32911
HeparinLeo Pharma
Kollagenase NB1 GMP-QualitätSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
OP-Abdeckungen3M NederlandDH999969404
PerfusionspumpeMetrohmX007528300
PumpenkopfMetrohmX077202600
Perfusionstablettnach Maß
LS25 Masterflex SchläucheMasterflexHV-96410-25
ZubehörSpike Gambro DASCO6038020
PulmozymeRoche
Kulturflaschen 25 cm2greiner690175
Kulturflasche 75 cm2greiner658170
Kulturflasche 175 cm2greiner661160
Trypsinsigmat4174
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR blockierendes ReagenzMiltenyi130-059-901
Anti-Melanom-Kügelchen (NG2)Miltenyi130-090-452
Zellsieb 70 & Mikro; mCorning352350
LS SäulenMiltenyi130-042-401
MACS MagnetMiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r Forschung & Forschung Dmab 1263
Maus IgG1 FITCBD 
Maus IgG1 PEBD 
Maus IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
Anti-Maus für Ziegen PEDakoR0480
NatriumazidMerck822335
DMEM Schinken' s F12Gibco31331-028
ITS (Insulin, Transferrin, Selen)SigmaI1884
HydrocortisonSigmaH0135
TrijodthyrininSigmaT5516
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)sigmaE9644
Immortalisiertes humanes Nieren-PTEC (HK2)mit freundlicher Genehmigung von M. Ryan, Universitätscollege Dublin
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Referenzen

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