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Methodenartikel

Echokardiographische und histologische Untersuchung der kardiale Morphologie in der Maus

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DOI:

10.3791/55843

⸱

26. Oktober 2017

 ,  ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, CNRS, INSERM, iBV, 2Department of Pathology, CHU Nice, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Echokardiographische Untersuchung wird häufig bei Mäusen verwendet. Teure hochauflösende Ultraschall-Geräte wurden für diesen Zweck entwickelt. Dieses Protokoll beschreibt eine erschwingliche echokardiographische Verfahren kombiniert mit histologischen morphometrische Analysen kardiale Morphologie zu bestimmen.

Zusammenfassung

Eine wachsende Zahl von genetisch veränderten Mäusen ist verfügbar in den letzten Jahren geworden. Darüber hinaus ist die Anzahl der pharmakologischen Studien an Mäusen hoch. Phänotypischen Charakterisierung dieser Maus-Modelle erfordert auch die Untersuchung der Herzfunktion und Morphologie. Echokardiographie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) sind häufig verwendete Ansätze Herzfunktion und Morphologie bei Mäusen zu charakterisieren. Echokardiographische und MRT-Geräte spezialisiert für den Gebrauch in kleinen Nagetieren ist teuer und erfordert einen eigenen Platz. Dieses Protokoll beschreibt kardiale Messungen bei Mäusen mit einem klinischen echokardiographische System mit einer menschlichen Kreislauf 15 MHz-Sonde. Messungen werden an narkotisierten erwachsenen Mäusen durchgeführt. Mindestens drei Bildsequenzen werden aufgezeichnet und analysiert für jedes Tier im M-Modus in der Parasternal kurze Achse Ansicht. Danach kardiologische histologische Untersuchung wird durchgeführt, und Cardiomyocyte Durchmesser richten sich auf Hämatoxylin-Eosin oder Weizenkeime Agglutinin (WGA)-gebeizt Paraffin Abschnitte. Schiff-Dichte ist bestimmt Morphometrically nach Pecam-1 Immunostaining. Das Protokoll wurde erfolgreich auf pharmakologische Studien angewendet und verschiedene genetische Tiermodellen unter geplanten Bedingungen sowie nach experimentellen Myokardinfarkt durch die dauerhafte Unterbindung des linken vorderen absteigenden Koronararterie ( (LAD). Nach unserer Erfahrung echokardiographische Untersuchung beschränkt sich auf narkotisierten Tiere und ist machbar in erwachsener Mäuse mit einem Gewicht von mindestens 25 g.

Einleitung

Gibt es eine Vielzahl von genetisch veränderten Mäusen, und die Anzahl der pharmakologischen Studien an Mäusen ist hoch1,2. Echokardiographie und MRT sind häufig verwendete Ansätze zur phänotypischen Charakterisierung der Herzfunktion und Morphologie in diese Maus-Modelle-3. Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist, Herzfunktion und Morphologie bei Erwachsenen Mäusen zu analysieren. Es verbindet echokardiographische, histologischen, und immunhistochemische Messungen. Echokardiographische Untersuchung ist in Mäusen4,5,6,7,8,9,10,11verbreitet, 12. Pachon Et al. 11 identifiziert 205 Studien veröffentlicht in Umlauf, Zirkulation Forschung, American Journal of Physiology - Herz und Herz-Kreislauf Physiologieund Herz-Kreislauf-Forschung zwischen 2012 und 2015 echokardiographische Untersuchung bei Tieren verwendet.

Die Echokardiographie dient zur Identifizierung kardiale Phänotypen in genetisch veränderte Mäuse,5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, sowie der Herzfunktion in chronische Überlastung-induzierte Hypertrophie, Myokardischämie und Kardiomyopathie Modelle bei Mäusen (rezensiert in12) zu analysieren. Verbesserte Echokardiographie Ausrüstung ermöglicht es, für die das Standardmaß von links-ventrikuläre (LV) systolischen und diastolischen Dimensionen, Gewebe-Doppler-Bildgebung, myokardiale Kontrast Sonografie und die Beurteilung der LV Regionalfunktion und koronare Reserve 12. im Idealfall echokardiographische Untersuchung durchgeführt werden sollte, im bewussten Mäuse, die negativen Auswirkungen der Narkose auf kontraktile Funktion, autonome reflex Kontrolle zu vermeiden und Herzfrequenz11. Dennoch wird dieser Ansatz durch das Erfordernis, die Tiere zu trainieren begrenzt; Schwierigkeiten die Körpertemperatur stabil zu halten; Bewegungsartefakte; Stress; sehr hohe Herz Frequenzen; und die Forderung für mindestens zwei Ermittler das Experiment durchführen, vor allem, wenn eine große Anzahl von Tieren untersucht werden. Eine aktuelle Studie berichtet Interessanterweise keine Unterschiede in der echokardiographische Parameter in trainierten und untrainierten Tiere19. Wir führen echokardiographische Messungen bei narkotisierten Mäusen. Verschiedenen Anästhesie Protokolle werden unten besprochen.

Obwohl Standardauflösung Echokardiographie (> 10 MHz) ist ausreichend, um Maßnahme LV systolischen und diastolischen Dimensionen und Herzfunktion bei Erwachsenen Mäusen, die Methode ist in seiner Beschreibung der zugrunde liegende strukturelle Phänomene begrenzt. So verbinden wir die in-Vivo -Messungen mit histologischen und Immunohistologische Analysen, z. B. Cardiomyocyte Durchmesser und Schiff Dichte zu messen. Andere histologischen und Immunohistologische Untersuchungen, wie z. B. die Bestimmung der Proliferation, Prüfung der Apoptose, Infarkt Größenmessungen, Bestimmung der Fibrose und spezifische Marker Ausdruck können auch auf die gleiche Art von erfolgen Gewebe verarbeitet, aber sind nicht Gegenstand dieses Protokolls. Die Kombination von in Vivo echokardiographische Untersuchung mit histologischen Analysen bietet weitere Einblicke in die zugrunde liegende strukturelle Veränderungen. In einem weiteren Schritt können wir diese Messungen mit molekularen und Ultra-strukturelle Untersuchungen durchführen. Histologische Analysen nicht nur die echokardiographische Untersuchung sondern auch unverzichtbar geworden, wenn die Auflösung der Echokardiographie nicht ausreichend ist. Dies gilt vor allem für Modelle von genetisch veränderten Mäusen, die embryonale tödliche23,24.

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Protokoll

die hier beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den relevanten institutionellen und französischen Tierschutz Gesetze, Richtlinien und Richtlinien durchgeführt. Sie wurden von der französischen Ethikkommission genehmigt worden (Comité Institutionnel d ' Ethique Pour l ' Tier de Laboratoire; Nummer NCE/2012-106).

1. Echokardiographie

  1. bestimmen das Körpergewicht der Maus mit einer standard-Laborwaage halten Sie es leicht am Schwanz auf um die richtige Positionierung zu gewährleisten.
  2. Betäuben das Tier durch die intraperitoneale (i.p.) Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital 25 , 26.
    Hinweis: Jede andere Art von Narkose kann verwendet werden, wenn das gleiche Protokoll während der gesamten Studie verwendet wird. Vor- und Nachteile weiter unten besprochen werden.
  3. Die Maus wieder im eigenen Käfig und warten, bis es nicht mehr reagiert ist, es zeigt stetige Atmung und Hinterfuss Reflexe sind nicht vorhanden. Um dies zu testen, drücken Sie einen Fuß leicht und beobachten, ob das Bein noch fährt.
  4. Die linke Seite des Thorax und die linke Achselhöhle mit einem kommerziellen Nagetier Rasierer rasieren.
    Hinweis: Die Verwendung eines dedizierten Nagetier Rasierers ermöglicht die komplette Haarentfernung feine Maus zur Vermeidung von Interferenzen in der echokardiographischen Messung. Kommerzielle Haarentfernung Cremes oder Lösungen sollten vermieden werden, da sie in der Regel parfümiert sind, die das Tier stören wird, nachdem es weckt. Vermeiden Sie übermäßige rasieren, wie Wärmeverlust erhöht.
  5. Setzen die schlafende Tier auf einem warmen Pad set 40-42 ° c in einer flachen linksseitige Position mit dem Kopf um 12 o ' Uhr und die Rute auf 6 o ' Uhr. Fixieren Sie den linken Arm, linkes Bein und Endstück mit Klebeband.
  6. Anwenden vorgewärmt Echokardiographie-Gel auf die rasierte Brust und Kopf des Aufnehmers.
  7. Legen Sie den Schallkopf Parasternal-links auf der rechten Seite des Halses eine zweidimensionale (2D) Parasternal lange Achse Ansicht auf der Ebene des papillären Muskels erhalten Regie. Drehen der Wandlers 90° im Uhrzeigersinn eine kurze Achse auf Papilary Muskel Ebene zu erhalten. Verwenden Sie eine minimale Tiefeneinstellung und ein Zoom Bild Qualität und Frame-Rate zu maximieren. Einstellen der Laufgeschwindigkeit bis zum Maximum.
    1. , Diese Einstellungen, verschiedene Zoom und Tiefe Einstellmöglichkeiten zu erhalten kann verwendet werden, je nach Maschine und Software. 2D-geführte M-Modus Aufnahmen in kurze Achse anzeigen 27. Siehe Abb. 1A und B 27.
      Hinweis: Achten Sie darauf, übermäßigen Druck auf der Brust, da dies Bradykardie führen kann.
  8. Datensatz mindestens 3 Reihe 3 Herzen schlagen Cine Schleifen für jedes Tier.
    Hinweis: Für die in dieser Studie verwendete Echokardiograph-Software drücken Sie die " erwerben/Save " Taste nur einmal. Diese Methode ist speziell für die Echokardiograph mit dieser speziellen Software. Andere Software-Pakete mit verschiedenen Maschinen verwendet werden.
  9. Nach erfolgreichen Aufnahmen, wischen Sie die Echokardiographie von Maus Thorax, Heizkissen und Wandler gel. Entfernen Sie das Klebeband von der Gliedmaßen und Rute.
  10. Lassen Sie die Maus unter Beobachtung auf das Heizkissen, bedeckt mit einem Tuch zu vermeiden unnötige Exposition und Wärme Lichtverlust, bis es sich aufwacht
  11. Das Tier wieder in seinen Käfig.
  12. Analysieren aufgenommenen M-Modus Bilder aus Parasternal kurze Achse links ventrikulären (LV) Abmessungen und Funktion bestimmen. Messen Sie die Dicke von der vorderen Wand der LV in Systole und Diastole (LVAWs und LVAWd), die LV Ende systolischen und End-diastolischen Innendurchmesser (LVIDs und LVIDd) und die LV posterior Wandstärke (LVPW) in Systole und Diastole (LVPWs und LVPWd) mit der Identifikation der Gewebe-Blut-Schnittstelle auf die gespeicherten Bilder.
  13. Messen Sie die diastolischen Dimensionen zum Zeitpunkt der scheinbaren maximale LV diastolischen Dimensionen und LV-Ende-systolische Dimensionen zum Zeitpunkt der meisten anterioren systolischen Exkursion von der hinteren Wand des LV. Berühre den Touchscreen der " Analyse " Symbol und dann auf die " LVAWd " Symbol. Positionieren Sie die elektronische Bremssattel an der Schnittstelle zwischen dem rechtsventrikuläre Hohlraum und der vorderen Wand der LV in Diastole.
  14. Position des elektronischen Bremssattels an der Schnittstelle zwischen der vorderen Wand des LV und der LV-Hohlraum, die LV diastolische anterior Wandstärke zu erhalten, die Software wird direkt auf die interne End-diastolischen LV-Messung wechseln.
  15. Positionieren Sie den Bremssattel an der Schnittstelle zwischen dem LV Hohlraum und der hinteren Wand der LV den End-diastolischen LV-Innendurchmesser zu erhalten, die Software wird auf der hinteren Wand-Dickenmessung LV wechseln.
  16. Position der Bremssattel an der Schnittstelle zwischen der hinteren Wand des LV und das Perikard, die LV diastolische posterior Wandstärke zu erhalten. LV systolischen Dimensionen, tippen Sie auf den Touchscreen auf der " LVAWs " Symbol und Position der elektronischen Bremssattel an der Schnittstelle zwischen dem rechtsventrikuläre Hohlraum und der vorderen Wand des LV in Systole.
  17. Position der elektronischen Bremssattel an der Schnittstelle zwischen der vorderen Wand des LV und der LV-Hohlraum, die LV systolische anteriore Wandstärke zu erhalten. Wiederholen Sie den Vorgang wie oben beschrieben für den Ende systolischen LV-Innendurchmesser und die LV systolischen posterior Wandstärke. Verwenden die Vorderkante Konvention durch die amerikanische Gesellschaft der Echokardiographie nachzuvollziehen endokardialen und epicardial Grenzen 13 , 27.
    Hinweis: LV kontraktile Funktionsparameter werden automatisch mit der vorherigen Messungen berechnet werden. Die LV gebrochene Verkürzung (FS) ist definiert als FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] X 100. Die LV Auswurffraktion (EF) errechnet sich mit der veränderten Teicholz Formel, wo EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] X 100 12. Siehe Abb. 1A und B.
  18. Speichern die Daten auf CDs oder USB-Memory-Sticks und Sicherungskopien.
  19. Import, analysieren und exportieren Sie die Daten mit Hilfe der entsprechenden Software.
    Hinweis: Nach dieser Baseline-Messungen kann das Experiment angehalten werden. Wenn Sie einen direkten Vergleich zwischen Ko Tiere und Wildtyp Wurfgeschwistern durchführen, fahren Sie mit der histologische Analysen- 6. Für Cre-ERT2; Lox/Lox Mauslinien, weiter am nächsten Tag mit Tamoxifen Induktion durch Injektion i.p., wie beschrieben 5 , 24. Bei experimentellen Myokardinfarkt durch die Ligatur der linken Koronararterie 5 , 28 induziert, konnte die Operation direkt nach der echokardiographischen Messungen durchgeführt werden wenn die Mäuse sind unter Narkose. Andernfalls sollte eine minimale Verzögerung von einer Woche zwischen den zwei Runden der Anästhesie, um die Rate der postoperativen Letalität zu begrenzen beibehalten werden.

2. Vorbereitung der Herz-Proben zur histologischen Auswertung

  1. die Tiere durch zervikale Dislokation zu opfern. Messen Sie ihr Körpergewicht. Brust und Bauch mit einem 70 % Alkoholtupfer desinfizieren.
  2. Machen eine Quereinschnitt in der Haut 1 cm distal des Brustbeins. Mit stumpfen Pinzette, entfernen Sie die Haut von Thorax, in Richtung des Kopfes. Das Brustbein leicht mit einer feinen Pinzette halten und öffnen das Zwerchfell durch das stumpfe Ende des feinen Schere einfügen.
  3. Senken des Brustkorbs auf beiden Seiten parallel zum Brustbein. Bewegen Sie das Brustbein in Richtung des Kopfes. Suchen Sie die Herzen im Brustkorb. Halten den vaskulären Stamm des Herzens mit feinen Zangen und unten mit einer feinen Schere geschnitten.
  4. Öffne die Truhe und Verbrauchsteuern das gesamte Herz aus der Brust, das Herz Gewicht zu messen und eine Herz-zu-Körper-Gewicht-Verhältnis 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 < /SUP >.
  5. Fix das Herz in 2 mL 10 % neutral gepuffertem Formalin-Lösung in 15 mL Röhrchen über Nacht bei 4 ° c
    Vorsicht: Gefahr! Arbeiten mit Formalin Lösungen müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden; Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.
    Hinweis: Da die Puffer-Komposition für Formalin-Lösungen mit verschiedenen Lieferanten unterscheiden, verwenden die gleichen Lieferanten während der gesamten Studie.
  6. Am nächsten Tag die Herzen in der Querebene, in der Mitte geschnitten und in Kassetten für Paraffin einbetten, überführen, erfolgt in der Pathologielabor unter Verwendung eine automatisierte einbetten Vorrichtung.
  7. -Schnitt durchführen.
    1. Abschnitt Paraffin blockiert bei einer Dicke von 3 µm mit einem Mikrotom und schweben sie in einem 40 ° C Wasser mit destilliertem Wasser Baden.
    2. Übertragen die Abschnitte auf Folien. Ermöglichen die Folien über Nacht trocknen in einem Inkubator 37 ° C und bei 4 ° C aufbewahrt bis einsatzbereit.
      Hinweis: Das Protokoll kann angehalten werden hier bis der Benutzer bereit ist für die Färbung (Schritt 3).
  8. Deparaffinize und rehydrieren das Gewebe gleitet.
    1. Legen Sie die Folien in der Färbung Gläser mit Glaseinsätzen in einem 55 ° C Ofen für 10 Minuten das Paraffin schmilzt.
    2. Deparaffinize Folien in zwei Änderungen von 200 mL Xylol oder Xylol Ersatz für 5 min.
      Achtung: Leicht entzündlich und giftig! Arbeiten Sie in einem chemischen Abzug; Handschuhe und Schutzbrille zu tragen.
    3. Übertragen die Folien auf 200 mL 100 % Alkohol. Zwei Änderungen für 3 min und einmal über 200 mL 95 % Alkohol für 3 min. übertragen
      Achtung: Entzündlich! Von Zündquellen fernhalten; kein Rauchen.
    4. Zweimal in 200 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 5 min spülen und fahren Sie mit Schritt 3, 4 oder 5.

3. Hämatoxylin und Eosin Färbung

  1. die Folien mit ihren Sektionen in destilliertem Wasser abspülen.
  2. Färben Sie die Kerne mit Hämatoxylin Lösung für 8 min.
  3. Spülen unter fließendem Leitungswasser für 10 min.
  4. Färben mit Eosin-Lösung für 2 min.
  5. Gelief dreimal für 2 min bei 100 % igem Ethanol (EtOH). Klar drei Mal für 2 Minuten in Xylol und Xylol zu ersetzen. Berg in Xylol-basierte Eindeckmedium.
  6. Die Folien zu fotografieren und Messen Sie den Durchmesser des Cardiomyocyte auf der Ebene des Zellkerns in Längsprofile der interventricular Septum. Messen Sie mindestens 100 Zellen pro Abschnitt und drei Abschnitte pro Herz.

4. WGA Färbung

  1. inkubieren Sie die Folien aus Schritt 2.7 mit Tetramethylrhodamine (oder andere Fluoreszenzfarbstoffe) gewonnen-WGA (1: 100 mit PBS-Puffer) für 60 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer konjugiert.
  2. Für 5 min dreimal mit PBS waschen.
    3. Mount
  3. mit Fluoreszenz Montage Medium mit DAPI. Shop bei 4 ° C im Dunkeln vor der Analyse.
    Achtung: Tragen Sie Augenschutz und kompatibel-chemikalienbeständige Handschuhe.
  4. Die Folien zu fotografieren.
    1. Verwendung setzt ein Mikroskop mit Fluoreszenz-Epi-Beleuchtung und Filter ausgestattet für DAPI und Tetramethylrhodamine (siehe die Tabelle der Materialien). Stellen Sie die Blende, die maximale und die Helligkeit auf Belichtungsautomatik.
      2. Bilder bei 400 X Vergrößerung für die blaue und die rote Kanäle getrennt
    2. erwerben. Öffnen Sie die Bilder in ImageJ. Stellen Sie die Helligkeit und Kontrast bei Bedarf (Bild > Adjust > Helligkeit/Kontrast).
    3. Jedes Bild auf 8-Bit festgelegt (Bild > Typ > 8-Bit). Das DAPI und WGA Bilder zu überlagern. Verwenden Sie den blauen Kanal für DAPI und den Rot-Kanal für WGA; die grünen und grauen Kanäle auf none gesetzt (Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen) 31.
  5. Bestimmen die Cardiomyocyte Durchmesser auf der Ebene des Zellkerns in Querschnitte der interventricular Scheidewand.
    1. Definieren die Skalierung der Bilder in ImageJ. Zu diesem Zweck Fotografieren ein Objekts bekannter Größe (z. B. einer Hemocytometer-Kammer mit der gleichen Vergrößerung als die Herz-Abschnitte, Schritt 4,4).
    2. Verwenden Sie das lineare Werkzeug zum Zeichnen einer Linie von Anfang bis Ende der bekannten Struktur (Analyze > Maßstab).
      Hinweis: Der Abstand in Pixel wird automatisch angezeigt werden; die bekannten Abstand und Längeneinheit müssen eingegeben werden. Fahren Sie fort mit Cardiomyocyte Messungen auf der Ebene des Zellkerns.
    3. Zeichnen einer geraden Linie von der WGA-positiven Membrane durch DAPI-positiven Kern auf der gegenüberliegenden Seite der Zellmembran WGA-positiv (Analyze > Maßnahme). Im Ergebnisfenster stellen sicher, dass die Längenwerte eine sinnvolle Anzahl von Dezimalstellen (Analyze > Set Messungen > stellen nach dem Komma).
    4. Maßnahme mindestens 100 Zellen pro Abschnitt und drei Abschnitte pro Herz. Die Ergebnisse in Excel exportieren (Klicken Sie auf Ergebnisse > Datei > speichern als > CSV) 6 , 31.

5. PECAM-1 Immunostaining

  1. führen Sie Antigen Demaskierung.
    1. Hinzufügen, 1.600 mL Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween 20, pH 6.0), einen Schnellkochtopf. Setzen Sie den Schnellkochtopf auf die Herdplatte und schalten Sie ihn auf volle Leistung. Sichern Sie den Deckel des Schnellkochtopfes zu diesem Zeitpunkt nicht; ruhen sie sich einfach an der Spitze.
      Vorsicht: Heiß!
    2. Sobald die Natrium-Citrat-Puffer kocht, die Folien von Schritt 2.5 auf den Schnellkochtopf übertragen. Sichern Sie den Schnellkochtopf Deckel. Sobald der Herd voll Druck erreicht hat, 7 min. warten. Wenn 7 min. vergangen sind, schalten Sie die Herdplatte und legen Sie den Schnellkochtopf in eine leere sinken. Aktivieren Sie das Überdruckventil und laufen Sie kaltes Wasser über den Herd. Sobald es de-unter Druck gesetzt hat, öffnen Sie den Deckel und führen Sie kaltes Wasser in den Herd für 5 min. Ort Folien in 200 mL PBS.
      Hinweis: Alternativ Mikrowelle Antigen Demaskierung genutzt werden, obwohl die Gefahr der Überhitzung erhöht wird.
  2. Verwendung 0,3 % Wasserstoffperoxid in Methanol zu Block endogene Peroxidase-Aktivität für 5 min. Spülen Sie die Folien für dreimal jeweils in 200 mL PBS für 2 min.
    Achtung: Entzündlich und giftig!
  3. Inkubieren Sie die Folien für 15 min in verdünnte normale blockierende Serum (5 % normalem Ziegenserum mit PBS-Puffer), der auch einen Avidin-Block (4 Tropfen in 1 mL) enthält.
  4. Vorsichtig Tippen Sie die Flüssigkeit aus den Abschnitten und inkubieren sie mit Pecam-1 Antikörper vom Kaninchen, verdünnte 01:50 in PBS mit 2,5 % normalem Ziegenserum und 4 Tropfen Biotin Block pro mL. Inkubieren Sie die Folien über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4 ° c
  5. Die Folien drei Mal für 5 min in 200 mL PBS waschen. Inkubieren Sie die Abschnitte mit biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen IgG Antikörper verdünnt 1: 200 mit PBS-Puffer mit 2,5 % normalem Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Folien drei Mal für 5 min in 200 mL PBS.
  6. Inkubieren tHe-Abschnitte mit einem Avidin/Biotin-basierte Peroxidase-System für 20 min (Reagenz A und Reagenz B müssen kombinierte 30 Minuten vorher zu verwenden). Waschen Sie die Folien drei Mal für 5 min in 200 mL PBS.
  7. Auflösen 1 3,3 '-Diaminobenzidine (DAB) und 1 Harnstoff Wasserstoffperoxid tablet in 5 mL bidestilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Abschnitte mit DAB Lösung für ca. 3 min, Farbe Entwicklung sorgfältig zu überwachen. Die Farbreaktion vorbeischauen, sanft waschen die Folien in 200 mL PBS.
    Achtung: Krebserregend; chemisch beständige Handschuhe!
  8. Counterstain die Kernen für 6 min mit Hämatoxylin. Spülen Sie in fließendem Leitungswasser für 2 min. gelief dreimal für 2 min in 200 mL 100 % Alkohol. Deaktivieren Sie dreimal für 2 min jeweils in 200 mL Xylol oder Xylol Ersatz. Berg in Xylol-basierte Eindeckmedium.
  9. Folien (mindestens zehn Felder bei 40 X Vergrößerung aus der interventricular Scheidewand von jedes Herz) zu fotografieren und die Flächendichte Pecam-1 mit Hilfe der frei verfügbare ImageJ Software 31 messen. Verwenden Sie die Farbe Dekonvolution 32 Plugin für DAB und Hämatoxylin und passen Sie den Kontrast des Bildes auf das gleiche Niveau.
    Hinweis: für den Fall, dass die Farbe braune und lila/blau haben erhebliche spektrale Überlappung, die Schwierigkeiten mit Farbe Dekonvolution verursachen könnte, könnte man verschiedene Marken von Hämatoxylin Lösung um klare, hellblaue nuklearen Färbung zu erhalten versuchen. Alternativ, Immunfluoreszenz oder manuelle Zählung der Kapillaren durchgeführt werden konnte.

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Ergebnisse

In Abbildung 1zeigen repräsentative echokardiographische Aufnahmen die Nützlichkeit der Echokardiographie, kardiale Phänotypen bei genetisch veränderten Mäusen zu identifizieren. Der Unterschied zwischen einer Maus mit normalen Herzfunktion (Abbildung 1A) und ein Tier mit einem dilatierten linken Ventrikel und reduzierte LV-Funktion (Abb. 1 b) kann leicht identifiziert werden. Ab...

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Diskussion

Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um kardiale Struktur und Funktion bei Mäusen, einschließlich Echokardiographie, Kontrast-verstärkte MRI, Mikro-CT und PET-Scan zu bewerten. Aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit und Einfachheit ist Echokardiographie die am weitesten verbreitete Technik zur Funktionsanalyse in Mäusen11. In der Regel wegen der geringen Größe des Herzens und der hohen Frequenz der Herzfrequenz bei Mäusen, Wandler mit einer Frequenz > 10 MHz sollte verwendet werden, obwohl erf...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Arbeit wurde von der französischen Regierung (National Research Agency, ANR) durch das Programm "Investitionen für die Zukunft" LABEX SIGNALIFE (Referenz ANR-11-LABX-0028-01) unterstützt und durch Zuschüsse, K. D. W. von der Association pour la Recherche Sur le Cancer Fondation de France, und planen Sie Krebs Inserm. D. B. und A. V. Feldkamp von der Fondation Pour la Recherche Médicale und von der Stadt Nizza, beziehungsweise. Die Echokardiograph und der Wandler wurden uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Philips. Wir danken A. Borderie, S. Destree, M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini und S. M. Wagner für ihre qualifizierte technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Weizenkeim-Agglutinin (WGA)-konjugiertes TetramethylrhodaminLife Technologies, Molekulare SondenW849
Biotinylierte Ziege Anti-Kaninchen-IgG-AntikörperVectorlabsBA-1000
Avidin/Biotin Blocking KitVectorlabsSP-2001
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)VectorlabsPK-6100
VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPIVectorlabsH-1200
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidin TablettenSigmaD4168
WasserstoffperoxidlösungSigmaH1009
Anti-Pecam-1 (CD31) AntikörperAbcamab28364
Ultraschall-Transmissionsgel, Gel Aquasonic 100Parker
Lineare Ultraschallsonde, L15-7ioPhilips Healthcare
Echokardiograph, IE33 xMATRIXPhilips Healthcare Mikroskop
, Leica DMi8Leica
Fluoreszenzfilterset DAPILeica11525304
Filterset TxRLeica11525310
Digitalkamera, SPOT RT3 Color SliderSpot Imaging
Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic SoftwareSpot Imaging
Imaging ComputerDell
Fine ScissorsFine Science Tools14028-10
Große SchereFine Science Tools14501-14
SkalpellklingenFine Science Tools10023-00
Graefe ForcepsFine Science Tools11650-10
NagetierrasiererHarvard Apparatus34-0243
Kassetten zum Einbetten von ParaffinSakura4155F
neutral gepuffert FormalinSakura8727
XylolSakura8733
Paraffin TEK IIISakura4511
automatisierte Einbettungsapparatur, Tissue-Tek VIPSakura6032
Paraffineinbettstation, Tissue-Tek TEC 5Sakura5229
Mikrotomklingen, Accu-Edge S35Sakura4685
Objektträger, Tissue-TekSakura9533
Deckgläser, Tissue-TekSakura9582
Eindeckmedium Tissue-TekSakura1408
ObjektträgerboxenSakura3958
EosinlösungSakura8703
HämatoxylinlösungSakura8711
Mikrotom, RM2125RTLeica720-1880 (VWR)
Wasserbad, Leica HI1210Leica720-0113(VWR)
EthanolVWRACRO444220050
15 ml TubenVWR734-0451
FärbeglasschaleVWRMARI4220004
FärbegläserVWRMARI4200005
InkubatorBinder9010-0012
DAB und Harnstoff Wasserstoffperoxid Tabletten, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidin TablettenSigmaD4293
PBS (10X)Thermo Fisher Scientific70011044

Referenzen

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