Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Summary

Wir haben ein neuartiges Protokoll für das Studium der heterozellulären Populationsdynamik als Reaktion auf Störungen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt eine bildgebende Plattform, die quantitative Datensätze zur gleichzeitigen Charakterisierung mehrerer zellulärer Phänotypen heterocyclischer Populationen in einer robusten Weise erzeugt.

Abstract

Zelluläre Prozesse sind komplex und ergeben sich aus dem Zusammenspiel von mehreren Zelltypen und deren Umgebung. Bestehende zellbiologische Techniken erlauben oft keine genaue Interpretation dieses Zusammenspiels. Mit einem quantitativen bildgebenden Ansatz präsentieren wir ein hochauflösendes Protokoll zur Charakterisierung der dynamischen phänotypischen Reaktionen ( dh Morphologieveränderungen, Proliferation, Apoptose) heterogener Zellpopulationen auf Veränderungen der Umweltreize. Wir unterstreichen unsere Fähigkeit, zwischen Zelltypen zu unterscheiden, die entweder auf Fluoreszenzintensität oder inhärenten Morphologiemerkmalen je nach Anwendung basieren. Diese Plattform ermöglicht eine umfassendere Charakterisierung der Subpopulation Antwort auf Störung unter Nutzung kürzere Zeit, kleinere Mengen an Reagenzien und geringere Wahrscheinlichkeit von Fehler als herkömmliche Zellbiologie Assays. Allerdings können in einigen Fällen Zellpopulationen schwer zu identifizieren und zu quantifizieren, basierend auf komplexen celluFeatures und erfordert zusätzliche Fehlersuche; Wir heben einige dieser Umstände im Protokoll hervor. Wir zeigen diese Anwendung mit Hilfe von Medikamenten in einem Krebsmodell; Allerdings kann es leicht breiter auf andere physiologische Prozesse angewendet werden. Dieses Protokoll erlaubt es, Subpopulationen innerhalb eines Co-Kultursystems zu identifizieren und die jeweilige Antwort von jedem auf externe Reize zu charakterisieren.

Introduction

Zellbasierte Assays waren ein Arbeitspferd in Grundlagenforschung und Arzneimittelentwicklung. Allerdings sind die Einschränkungen dieser Standard-Assays zunehmend offensichtlich mit der Diskordanz zwischen in vitro und klinischen Daten und das Versagen der meisten Medikamente, um FDA-Zulassung zu erhalten. Hier stellen wir eine neuartige Methode zur Verwendung einer quantitativen Bildgebung vor, um gleichzeitig heteroelluläre Phänotypen als Reaktion auf relevante, gleichzeitig auftretende Umwelteinflüsse zu analysieren.

Herkömmliche zellbasierte Assays, die verwendet werden, um die Zelllebensfähigkeit zu messen, umfassen: Trypanblau-Ausschluss-Assays, MTT / MTS und Annexin-V-FITC-Durchflusszytometrie-Färbung. Trypan Blue Ausschluss Assays, während einfach und kostengünstig, erfordern eine große Anzahl von Zellen, sind zeitaufwendig, und werden oft von Benutzer Bias ^{1 beeinflusst} . MTT- und MTS-Assays messen die Zelllebensfähigkeit durch Messungen der mitochondrialen metabolischen Rate indirekt. Allerdings ist die metabolische activiDie Zellen können durch unterschiedliche Kulturbedingungen (wie Medien- oder Sauerstoffkonzentration) beeinflusst werden, was zu ungenauen Ergebnissen führt und die Standardisierung über die Zelltypen und die Bedingungen ^{2 , 3 verhindert} . Ein weiterer wichtiger Nachteil dieser Techniken ist ihre Unfähigkeit, zwischen mehreren Zelltypen zu unterscheiden - die meisten biologischen Systeme sind heterozellulär. Während Durchflusszytometrie-Verfahren die Fähigkeit haben, zwischen mehreren Zellpopulationen zu unterscheiden, sind Zelletiketten erforderlich, dynamische Abtastung ist eine Herausforderung, und bei der Verwendung von adhärenten Zellen wird diese Anwendung zeitaufwändig und fehleranfällig.

Andere wichtige zelluläre Phänotypen, einschließlich morphologischer Veränderungen, treten in Reaktion auf Umwelteinflüsse auf, werden aber nicht durch herkömmliche zellbasierte Assays erfasst. Profiling Zelle Zustände durch morphologische Charakterisierung und Abbildung Ähnlichkeiten über Proben ist ein leistungsfähiges, unvoreingenommenes Werkzeug mit dem aUm neue Erkenntnisse in viele Aspekte der grundlegenden und translationalen Forschung zu geben, einschließlich der grundlegenden Zellbiologie und der Wirkstoffforschung ⁴ . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Tumorzellmorphologie mit den Tumorsubtypen ⁵ und der Aggressivität korreliert. Daher ist es von großem Interesse, diese zellulären Merkmale zu studieren und wie sie sich auf spezifische Umweltstörungen beziehen. Darüber hinaus kann man Unterschiede in morphologischen Merkmalen verwenden, um zwischen Subpopulationen in Co-Kultursystemen zu unterscheiden. Fluoreszenzmarkierende Zellen haben Abfälle ( dh die Veränderung der inhärenten Zelleigenschaften, zeitaufwändig) und daher sind zusätzliche Methoden zur Klassifizierung von Zelltypen vorteilhaft.

Die Mikroskopie-basierte Bildgebung ist eine alternative Methode zur Profilierung von zellulären Phänotypen in multiplexierter, quantitativer und robuster Weise. In diesem Manuskript wenden wir unsere quantitative bildgebende Pipeline an, um die evolutio hervorzuhebenNary Dynamik heterogener Zellpopulationen innerhalb eines Tumors. Wir konzentrieren uns auf die Wechselwirkung zwischen Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) Zellen und Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs), dem am häufigsten vorkommenden Stromazellen-Typ, der in Tumoren gefunden wird. CAFs wurden in Tumorinitiierung, Progression und therapeutische Reaktion verwickelt; Daher kann die Durchführung von phänotypischen Assays auf Tumorzellen in Abwesenheit von CAFs irreführend ^{7 , 8 , 9 sein} . Insbesondere haben wir die Effekte von CAFs auf Tumorzellen als Reaktion auf Erlotinib, ein kleines Molekül, das auf den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) abzielt, der häufig in der klinischen Behandlung von NSCLC verwendet wird, ausgewertet. Wir haben eine hochauflösende Screening-Plattform und die dazugehörige Bildanalyse-Software zur Auswertung eingesetzt. In einem Versuch, diese Methodik anderen Forschern zugänglich zu machen, haben wir auch ein vergleichbares Downstream-Protokoll mit der Open-Source-Software entwickelt:CellProfiler ¹⁰ und CellProfiler Analyst ¹¹ . Die meisten bildbasierten High-Content-Screening-Assays werden mit kommerzieller Software analysiert, die für ein bestimmtes Instrumentenmodell spezifisch ist. Ergebnisse sind schwierig, in anderen Labors mit unterschiedlicher Software zu replizieren, weil die zugrunde liegenden Algorithmen oft proprietär sind. Unter Verwendung dieser bildbasierten Pipeline wurden Zellproliferation, Tod und Morphologie jeder Subpopulation einer heterozellulären Kultur als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung unter Verwendung von Fluoreszenz- und Morphologie-basierter Klassifikation gemessen. Das folgende Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung komplexer zellulärer Prozesse.

Protocol

1. Zellkultur

HINWEIS: Hier wurden phänotypische Reaktionen von NSCLC-Zellen (H3255) auf das EGFR-Targeting-Agens, Erlotinib, bei Co-Kultivierung mit Lungenfibroblasten (CCD-19Lu GFP) untersucht. Für denselben Datensatz wurde eine fluoreszenzbasierte und morphologiebasierte Klassifikation der beiden Zellpopulationen (H3255 und CCD-19Lu GFP) durchgeführt, um ihre Konkordanz zu veranschaulichen. Es muss jedoch nur eine Klassifizierungsmethode verwendet werden, die auf der Grundlage der Anwendung ausgewählt werden sollte.

1. Vorbereiten von 500 ml RPMI-1640, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und 1% Penicillin / Streptomycin.
   HINWEIS: Das Wachstumsmedium und die Ergänzungen können nach Bedarf für andere Zelltypen ersetzt werden.
2. Kulturzellen in 10 cm ³ Platten als reine Populationen in 5% CO ₂ bei 37 ° C und Durchgang in jedem geeigneten Verhältnis alle 3-4 Tage.

2. Vorbereitung der Zellen

1. Um eine Zelle Suspension vorzubereiten, entfernen Sie cEll-Medien und Waschzellen mit 5 ml 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Absaugen des PBS, Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin auf 37 ° C erwärmt und 5 min inkubieren (oder bis die Zellen nicht mehr an der Platte haften) bei 37 ° C.
3. Um Trypsin zu neutralisieren, fügen Sie 4 ml RPMI zu H3255 und CCD-19Lu GFP Platten hinzu und pipettieren Sie die Zelllösungen in 15 ml konische Röhrchen.
4. Zentrifugen von Zellen bei 150 xg für 5 min bei RT.
5. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren von Zellpellets in 10 ml RPMI-Medium in konischen Röhrchen, um sich auf die Aussaat vorzubereiten.

3. Zelle Beschichtung

1. Zähle die Zellen, um die Aussaat zu standardisieren.
   1. Umdrehen von Röhrchen, um Zellen in Lösung zu mischen. 10 μl jeder Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und 10 μl Trypanblau hinzufügen.
   2. 10 μl dieser Lösung in einen Zellzählschieber pipettieren und in den automatischen Zellzähler einfügen.
      HINWEIS: Andere Methoden der Zellzählung (z. Hämocytometer) verwendet werden.
   3. Wiederholen Sie die Zellzahl mindestens dreimal, oder bis die erhaltenen Zählungen konsistent sind.
2. Samen Zellen auf eine Multi-Well-Platte
   HINWEIS: Die Anzahl der zu sägenden Platten hängt von der Anzahl der abgebildeten Zeitpunkte ab. Alternativ kann eine Platte im Laufe der Zeit neu abgebildet werden, wenn die Zellen mit Histon-2B-GFP (oder anderen stabilen lentiviralen Kernflecken, die eine adäquate Kernsegmentierung bereitstellen) transduziert werden.
   1. Saatgut insgesamt 1.500 Zellen / Vertiefung in 100 μl RPMI. Bereiten Sie drei Zellsuspensionen vor, um drei Zellpopulationen zu plattieren: H3255, CCD-19Lu GFP und 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. Führen Sie jede in dreifacher Ausfertigung mit identischen Platten-Setups für jeden Zeitpunkt.
      ANMERKUNG: Für jede Zelllinie und Plattengröße sollten anfängliche Seededichten optimiert werden.
   2. Samenzellen in 3 x 96-Well-Platten mit einer Mehrkanalpipette. Inkubieren von Zellen O / N bei 37 ° C, 5% CO ₂ .

4. Arzneimitteldosierung

1. Füge DMSO zu Erlotinib Pulver hinzu, um eine endgültige Erlotinib-Stammlösung von 10 mM Konzentration zu bilden.
   HINWEIS: Das Medikament kann nach Wunsch ersetzt werden.
2. Verdünnen Sie das Medikament mit Zellkulturmedium auf 2x der Endkonzentration mit der höchsten Endkonzentration bei 10 μM und verdünnen Sie viermal im Verhältnis 1:10 für insgesamt fünf Arzneimittelkonzentrationen und ohne Medikamentenkontrolle.
   HINWEIS: Wenn die Konzentration von DMSO bei der höchsten Arzneimitteldosis 0,1% v / v übersteigt oder übersteigt, sollte die Medikamentenkontrolle keine äquivalente Menge an DMSO enthalten, um sicherzustellen, dass die beobachteten beobachteten Effekte nicht auf die DMSO-Toxizität zurückzuführen sind.
3. 100 μl Arzneimittellösung in die geeignete Vertiefung für eine abschließende Arzneimittelkonzentration von 1x, verdünnt in Medien, pipettieren.

5. Bildaufnahme

HINWEIS: Bilder wurden an den Tagen 0, 2 und 3 erworben. Je nach Zelltypen und zellulären Prozessen, die untersucht wurden, oDie gewünschten Zeitpunkte können untersucht werden.

1. Fleckzellen zur Vorbereitung auf die Bildgebung.
   1. Die Farbstofflösung bei den folgenden Endkonzentrationen auffüllen.
      1. Zur fluoreszenzbasierten Klassifizierung werden 5 μg / mL Kernfleck und 5 μM toter Zellfleck in PBS hergestellt (siehe Tabelle der Materialien ).
      2. Zur morphologiebasierten Klassifizierung werden 5 μg / mL Kernfleck, 5 μM toter Zellfleck und 5 μM Zellfleck in PBS hergestellt (siehe Tabelle der Materialien ).
   2. 20 μl Farbstofflösung zu jeder Vertiefung geben. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C vor Licht geschützt.
2. Optimieren und Erfassen von Bildern.
   1. Entfernen Sie die Bohrkrone aus dem Inkubator, wischen Sie den Boden der Platte mit 70% EtOH und legen Sie die Platte in die Abbildungskammer.
   2. Klicken Sie auf der Registerkarte 'Setup' auf die Schaltfläche '+' unter 'Kanalauswahl', um entsprechende Kanäle hinzuzufügenBild ( dh Hellfeld, Kernfleck, toter Zellfleck, GFP und RFP Signale).
   3. Klicken Sie auf "Layout Selection" und nehmen Sie z-gestapelte Testbilder alle 2 μm ab 0 μm und enden bei 20 μm, um die Fokusebene zu identifizieren. Geben Sie diesen Abstand für jeden Kanal unter 'Höhe' ein.
   4. Klicken Sie unter jedem Kanal auf "Schnappschuss", um Intensitäten zu bewerten und die Belichtungszeiten zu optimieren. Geben Sie unter "Zeit" nach Bedarf höhere oder niedrigere Werte ein.
   5. Auf der rechten Seite des Bildschirms, markieren Sie geeignete Brunnen (abzubilden) auf dem Plattenschema. In den unten stehenden Brunnen markieren Sie die fünfundzwanzig Felder, die in ähnlicher Weise abgebildet werden sollen.
   6. Unter "Run Experiment" markieren Sie die Platte in 'Plate Name' auf der linken Registerkarte und klicken Sie auf die Schaltfläche 'Start' (unten), um das Bildaufnahmeprotokoll mit einem 10fachen Ziel zu starten, um Graustufen-TIFF-Bilder in den oben genannten Kanälen zu erzeugen.
      HINWEIS: Schritt-für-Schritt-InstRuktionen für das Imaging-Protokoll können sich zwischen den Instrumenten unterscheiden, aber die Parameterwerte sollten noch optimiert werden.
   7. Wiederholen Sie die Bildgebung an den Tagen zwei und drei.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Die gesamte Bildanalyse wurde mit proprietärer Software durchgeführt. Da dies aber nicht öffentlich zugänglich ist, wurden auch vergleichbare Analysen auf CellProfiler 2.2 und CellProfiler Analyst 2.0 mit einem nachfolgend aufgeführten Kurzprotokoll und einem detaillierten Protokoll als Ergänzungsmaterial (Testbilder sind bereits in Pipelines geladen, um den Workflow zu testen). Die Bilder aus diesem Experiment wurden auf einer pro-well-Basis zusammengefasst, so dass jeder Brunnen einzeln geladen werden konnte. Die unten aufgeführten CellProfiler-Pipelines enthalten einen regulären Ausdruck, der Metadateninformationen aus jedem Bilddateinamen analysiert und die Bilder weiter nach Kanal gruppiert.

1. Laden und installieren Sie die Open-Source-Software: 'CellProfiler9; Und "CellProfiler Analyst". Übernehmen Sie alle Standardoptionen und Add-ons während der Installation.
2. Klassifizierung heterocyclischer Kulturen in Subpopulationen.
   1. Öffnen Sie 'CellProfiler' Software, klicken Sie auf 'Datei' | 'Pipeline importieren' 'Aus Datei' und wählen Sie die entsprechende Datei ("Fluorescence_Classification.cppipe" für die Fluoreszenz-basierte Klassifizierung oder "Morphology_Classification.cppipe" für die Morphologie-basierte Klassifizierung).
      HINWEIS: Diese Dateien enthalten Protokolle für die grundlegende Bildverarbeitung und die Kern- / Zellsegmentierung. Wegen des unebenen Hoechst-Fleckes, der über diesen Zellen vorhanden war, wurden die Kerne segmentiert und vergrößert und dann verwendet, um das Bild zu maskieren, um die Segmentierung von Kernen mit niedrigeren Intensitäten zu ermöglichen.
      1. Wählen Sie die Fluoreszenz-basierte Klassifizierungspipeline, um Zellen als H3255 oder CCD-19Lu auf der Grundlage der eGFP-Intensität zu klassifizieren und um Morphologiemerkmale zu berechnen.
         HINWEIS: CCD-19Lu-Zellen wurden mit GFP transduziert.
      2. Wählen Sie die Morphologie-basierte Klassifizierungspipeline, um Kerne und Zellen zu segmentieren und um Morphologiemerkmale zu berechnen.
         HINWEIS: Für die Klassifizierung wird eine weitere Downstream-Analyse in 'CellProfiler Analyst' benötigt. Tote Zellen werden durch fluoreszenzbasierte Klassifizierung klassifiziert.
   2. Klicken Sie unten links auf dem Bildschirm auf "Ausgabeeinstellungen". Wählen Sie den Ort der Bilddateien für die Analyse ('Default Input Folder') und das Ziel für die extrahierten Daten ('Default Output Folder').
   3. Klicken Sie auf "Bilder analysieren", um die Analyse zu starten. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf "OK" und gehen Sie zum "Standard-Ausgabeordner", um die berechneten Daten anzuzeigen.
      HINWEIS: Beispielparameterwerte und -bilder sind in der Ergänzungsdatei 1-CellProfilerProtocol.pdf verfügbar .
   4. Für die Morphologie-basierte Klassifizierung (nur) die folgenden.
      1. Öffnen Sie die Software "CellProfiler Analyst", wählen Sie die in CellProfiler generierte Datenbankeigenschaftsdatei aus und klicken Sie auf "Öffnen".
      2. Klicken Sie oben links auf den Bildschirm "Classifier". Um zufällige Zellbilder aus dem Experiment aufzurufen, klicken Sie auf 'Fetch'; Bilder werden im nicht klassifizierten Fenster angezeigt.
   5. Manuelles Klassifizieren von Zellen als positiv (H3255) oder negativ (CCD-19Lu) durch Auswählen und Ziehen von Zellen in eine geeignete Bin (siehe Ergänzende Datei 2-Pipeline.pdf : Abbildung B ). Nach der Klassifizierung von mindestens 50 Zellen pro Subpopulation, klicken Sie auf 'Train Classifier', und klicken Sie dann auf 'Progress prüfen'.
      HINWEIS: Die Zellen werden über einen vom Benutzer überwachten zufälligen Forstmaschinen-Lernalgorithmus ¹² klassifiziert. Wenn die Genauigkeit nicht über der zulässigen Schwelle (> 90%) liegt, kann es notwendig sein, zurückzugehen und die Zellsegmentierung auf "CellProfiler" zu optimieren, oder die Zellen sind möglicherweise nicht ideal für classiDurch Morphologie verunglimpfen
   6. Klicken Sie auf 'Score All', um eine Tabelle mit Zellzählungen für jede Subpopulation zu erzeugen.

Results

Wir haben ein Bildset bestehend aus 25 Feldern / Brunnen, 54 Wells / Platte (3 Zellpopulationen x 6 Arzneimittelkonzentrationen x 3 Replikate), über drei Platten für insgesamt 4.050 Einzelbilder erstellt. Die im Laufe des Experiments erzeugten Bildmengen wurden mittels proprietärer Software (siehe Materialtabelle) analysiert, um verschiedene quantitative Eigenschaften von Zellen ( dh Morphologie, Fluoreszenz) zu extrahieren, die dann zur Klassifizierung von Zell-Subpopulationen verwendet werden konnten. Da jedoch die verwendete kommerzielle Software nur begrenzten Zugang hat, wurden vergleichbare nachgeschaltete Pipelines in CellProfiler und CellProfiler Analyst erstellt.

Heterozelluläre Einteilung in Subpopulationen

Nuklei wurden identifiziert und segmentiert, basierend auf dem DNA-Fleck (hier Hoechst) und Zellpopulationen wurden entweder auf der Basis von Fluoreszenz oder MoRphologie ( Abbildung 1 ). Für die Fluoreszenz-basierte Klassifikation wurden die Fibroblasten (CCD-19Lu) zuvor mit GFP-Lentivirus transduziert. Die GFP-Intensitätsniveaus wurden für jeden Kern gemessen, und diejenigen, die oberhalb der akzeptierten Schwelle (basierend auf dem Hintergrundsignal) berechnet wurden, wurden als CCD-19Lu klassifiziert, während die folgenden als Tumorzellen identifiziert wurden (H3255). Für die Morphologie-basierte Klassifikation wurden die Zellen zuvor mit einem nicht-toxischen Zellfleck gefärbt (siehe die Tabelle der Materialien), und dies wurde verwendet, um das Zytoplasma zu identifizieren und zu segmentieren. Ein maschineller Lernalgorithmus wurde mit ~ 50-100 Zellen aus jeder Population trainiert. Es wurden morphologische Merkmale identifiziert, die zwischen den Populationen signifikant unterschiedlich waren, die dann zur Bildung eines linearen Klassifikators verwendet wurden, um zwischen CCD-19Lu- und H3255-Zellen zu unterscheiden. Die Fluoreszenz- und Morphologie-Klassifizierungsprotokolle waren 97,4% (n = 1403), die bei der Unterscheidung zwischen den beiden Zellpopulationen übereinstimmtenAtionen in unbehandelten Bedingungen und 92,5% (n = 916) übereinstimmend in medikamentenbehandelten Bedingungen (1 μM Erlotinib) ( Abbildung 2 ).

Phänotypische Analysen von Subpopulationen

Neben der Unterscheidung zwischen Zelltypen zielten wir darauf ab, die phänotypischen Eigenschaften jeder Subpopulation zu charakterisieren. Multiplexing-Assays spart Zeit und Reagenzien, fügt Konsistenz hinzu und liefert zusätzliche Informationen über das zu untersuchende System. Es gibt viele potentielle phänotypische Ausgänge und man sollte sie auf der Grundlage der interessanten Fragen wählen. Hier wurden Veränderungen in der Zellmorphologie und dem Lebensfähigkeitsstatus als Reaktion auf die Erlotinib-Behandlung untersucht. Nach drei Tagen medikamentöser Behandlung wurde eine Abnahme des Kernbereichs und eine Zunahme der Zellfläche der H3255-Zellen beobachtet ( Abbildung 3A ). Der mittlere Unterschied im Kernbereich zwischenEs wurde festgestellt, dass die "Nicht-Arzneimittel" und "Arzneimittel" behandelten Populationen über einen zweiseitigen Typ-2 (gleicher Varianz) t- test ( p = 7,92 x 10 & ^supmin ; ^¹ ) statistisch signifikant waren. Wir vermuten, dass diese Beobachtung eine zelluläre Antwort auf den Stress ist, der durch eine medikamentöse Behandlung auferlegt wird.

Es ist auch von Interesse zu untersuchen, ob ein Arzneimittel eine zytotoxische ( dh eine Zunahme der Anzahl von toten Zellen im Laufe der Zeit) oder eine zytostatische ( dh eine Verringerung der Anzahl von Zellgeburten über die Zeit) auf die Zellen hat, da dies einen tiefen klinischen Einfluss hat. Zum Beispiel induziert ein zytostatischer Arzneimittelwirkung Wachstumsstopp und beseitigt die Zellen nicht aus dem Tumor, so dass es möglich ist, dass Krebszellen die Zellproliferation neu initialisieren, sobald das Medikament entfernt ist. Drogeneffekte können oft Kontext-, Konzentrations- und Zelltypen sein. Wir haben zuvor beobachtet, dass Erlotinib eine zytotoxische Antwort in einem Zelltyp hervorruft, während er ac zeigtYtostatische Antwort in einem anderen ¹³ .

Traditionelle Lebensfähigkeitstests geben die relative Zellzahl aus und unterscheiden daher nicht zwischen Wachstumsstörungen und Zelltod. Hier wurden tote Zellen auf der Basis von Propidiumjodidfärbung identifiziert ( 3B ). Sowohl zytotoxische als auch zytostatische Effekte von Erlotinib auf H3255-Zellen wurden beobachtet, mit einer Zunahme der Zahl der Todesfälle und einer Abnahme der Anzahl der Geburten nach einer medikamentösen Behandlung ( Abbildung 3C ). Es ist erwähnenswert, dass die Anzahl der toten Zellen nach dem Tag 1 wahrscheinlich aufgrund der Zellfreisetzung sinkt. CCD-19Lu-Zellen wurden nicht von der Droge betroffen. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform ist die Erzeugung von quantitativen Daten. Zum Beispiel wurde bei unserem Co-Kultur-Experiment eine anfängliche Subpopulation von 1.118 (75,8%) H3255-Zellen nach drei Tagen ohne oder mit Erlotin 2.817 (87,9%) oder 396 (57,2%) festgestelltIb-Behandlung ( Abbildung 4 ). Da wir anstelle des relativen Prozentsatzes (wie bei Durchflusszytometrieverfahren) tatsächlich tatsächliche Zellzahlen erzeugen können, schließen wir, dass die Veränderung der Zusammensetzung während der medikamentösen Behandlung auf eine Abnahme der H3255-Zellen und nicht auf eine Erhöhung der CCD-19Lu zurückzuführen ist. Es ist nichts wert, dass die Sterberaten aufgrund der Zellfreisetzung unterschätzt werden können, was schwer experimentell zu beurteilen ist und sich wahrscheinlich über Zelltypen unterscheidet.

Abbildung 1: Überblick über das Bildanalyse-Protokoll. Zwei potenzielle Downstream-Bildanalyse-Pipelines zur Klassifizierung heterozellulärer Populationen unter Verwendung entweder morphologiebasierter Klassifikation oder fluoreszenzbasierter Klassifikation. Maßstäbe = 100 μm. Bitte klicke sie anUm eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Konkordanz zwischen Morphologie und Fluoreszenz-basierter Klassifikation. ( A ) Konkordanzdiagramm, das die Überlappung der beiden Klassifizierungsprotokolle anzeigt. Die gleichen Zellen wurden als H3255 unter Verwendung von morphologie- und fluoreszenzbasierter Klassifikation klassifiziert. Die beiden Protokolle stimmten mit der Klassifizierung für 97,4% (n = 1403) unbehandelter Zellen und 92,5% (n = 916) von mit Erlotinib behandelten Zellen (Anmerkung: weißer Bereich ist zu klein, um zu visualisieren). ( B ) 10X-Bilder, die Beispiele für eine gute und schlechte Konkordanz zwischen fluoreszenzbasierter und morphologiebasierter Klassifikation darstellen. Die weißen Pfeile weisen auf Zellen hin, die widersprüchlich zwischen Plattformen klassifiziert wurden. Eingabebild: blue - nuclei (Hoechst); Grün - CCD19Lu (GFP). KlasseBilder: Rot - H3255; Grün - CCD-19Lu. Maßstab = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Multiplexierte phänotypische Messungen aus einem einzigen experimentellen Setup. ( A ) Morphologische Merkmale, wie Kerne und Zellfläche, wurden auf der Ebene der einzelnen Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von Arzneimitteln berechnet. Hinweis: Zellbereiche, die kleiner als 100 μm ^{2 sind,} wurden als Trümmer betrachtet und von Analysen ausgeschlossen. Box-Plot zeigt Median mit dem ersten und dritten Quartilbereich und 95% Konfidenzintervall-Fehlerbalken. ( B ) H3255 (blau) und CCD-19Lu (grüne) Zellen wurden co-kultiviert und tote Zellen wurden auf der Grundlage der Intensität von Propid identifiziertIodjodidfleck (rot) und mit einem 10fachen Ziel abgebildet. Maßstab = 1 mm (obere Platte); 100 μm (untere bilder). ( C ) Die Gesamtzahl der lebenden und toten Zellen wurde über drei Tage mit oder ohne medikamentöse Behandlung mit einer offensichtlichen Abnahme der Anzahl von lebenden Zellen und Erhöhung der toten Zellen unter Zugabe von Erlotinib berechnet. Fehlerbalken stellen einen Standardfehler des Mittelwertes dar, der auf drei Wiederholungen basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Subpopulation Dynamik über Zeit. Repräsentative 10X Bilder von Brunnen mit H3255 (blau) und CCD-19Lu (grün) am Tag 0 oder Tag 3 mit und ohne Medikament. Zellen, die zu jeder Subpopulation gehörten, wurden gezählt und proportionale Kreisdiagramme zeigen die aVeränderung der Populationszusammensetzung über Proben hinweg. Maßstäbe = 1 mm (mittlere Tafeln, eingeklemmt, obere Platte), 1 mm (oberes Bild), 100 μm (untere Bilder). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Das oben beschriebene Protokoll verbessert die derzeitigen zellbiologischen Assays, indem es umfassendere Einblicke in die phänotypische Dynamik mehrerer Zelltypen als Reaktion auf Umweltstörungen bietet, während gleichzeitig Reagenzien und Zeit reduziert werden. Ein großer Vorteil dieses Versuchsdesigns ist die Möglichkeit, mehrere Phänotypen mit einem einzigen Aufbau zu analysieren und quantitative Daten zu generieren, die diese Phänotypen auf Einzelzellebene charakterisieren. Ein technischer Vorteil dieser Plattform ist die einfache anfängliche Fehlerbehebung im Vergleich zu anderen Assays. Da diese Methode bildbasiert ist, ist es möglich, die Wells für offensichtliche Über-/Untersaat zu visualisieren. Es ist ratsam, Zellen für die Dauer des Experiments in der exponentiellen Wachstumsphase zu haben und nicht durch Nährstoff- oder räumliche Einschränkungen eingeschränkt oder durch Seneszenz aufgrund von knapper Aussaat verwirrt zu werden. Andernfalls sind die Geburten- und Sterberaten zwischen den Experimenten möglicherweise nicht reproduzierbar. Als Referenz ist CellPD ein öffentlich zugängliches Programm zur Berechnung von Geburten- und Sterberaten¹⁴. Zusätzlich kann visualisiert werden, ob in jeder Vertiefung ausreichende Konzentrationen von Farbstoffen zugesetzt wurden. Pipettierprobleme in einer einzelnen Vertiefung können zu Fehlsegmentierung und verzerrten Daten führen, können aber mit dem oben genannten Protokoll leicht erkannt werden.

Leider sind nicht alle Zelltypen für diese Anwendung geeignet. Es ist wichtig, die Zellkerne und Zellen genau segmentieren zu können, daher ist die Analyse von Zellen, die sich in kugelförmigeren oder verklumpten Strukturen organisieren, möglicherweise nicht geeignet. Für einige Zellen kann es auch vorteilhaft sein, vor der Aussaat ein Zellsieb zu verwenden, um die anfängliche Aussaat einzelner Zellen sicherzustellen. Darüber hinaus ist die lineare Klassifikatortechnik nur auf Zelltypen anwendbar, die anhand morphologischer Merkmale leicht unterschieden werden können.

Für den Erfolg des Protokolls ist es wichtig, zunächst die Abbildungsbedingungen zu optimieren, da die Validität nachgelagerter Analysen von der Qualität der Bilder abhängt. Während wir hier Experimente mit einer High-Content-Screening-Plattform durchgeführt haben, kann die Bildaufnahme auch mit jedem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt werden (obwohl eine automatisierte Bildgebungsplattform ideal für Hochdurchsatzansätze ist). Testbilder sollten vor jedem Bildgebungszeitpunkt aufgenommen werden, um sicherzustellen, dass es keine Probleme mit dem Mikroskop oder dem Protokoll gibt. Das Signal-Rausch-Verhältnis sollte hoch sein, insbesondere für die Kanäle, die für die Segmentierung verwendet werden (z. B. Zellkerne, Zellfärbungen). Darüber hinaus ist es wichtig, in der optimalen Fokusebene abzubilden. Wenn die Bilder unscharf sind, wird die Segmentierung viel schwieriger und die berechneten morphologischen Merkmale sind wahrscheinlich ungenau. Beleuchtungsunterschiede zwischen den Feldern können ebenfalls zu Problemen bei der Bildsegmentierung führen. Große Helligkeitsunterschiede erschweren die automatische Auswahl von Schwellenwerten. Darüber hinaus kann es bei heterogenen Fluoreszenzintensitäten zwischen den Zellen vorkommen, dass ein einzelner Schwellenwert nicht alle Zellen in einem Bild ausreichend segmentiert. In dieser Analyse wurden diese Probleme überwunden, indem Masken um hellere und dunklere Zellpopulationen erstellt und jede Population separat segmentiert wurde.

Während die Phänotypen, die in diesem Protokoll untersucht werden, auf lebende, tote und morphologische Charakterisierungen beschränkt sind, können sie leicht erweitert werden, um andere Merkmale zu untersuchen. Zum Beispiel können funktionelle genetische Studien mit RNAi, Überexpression oder anderen chemischen Störungen hinzugefügt werden.

In dieser Arbeit wurde die Fähigkeit des Protokolls zur Messung der Reaktion von nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen auf Erlotinib in Gegenwart und Abwesenheit von CAFs demonstriert. Dies ist jedoch nur ein Beispiel für die vielen Zelltypen und Mikroumgebungsparameter, die getestet werden können. Wir haben dieses Protokoll auf die Verwendung mit anderen Zelltypen und Arzneimittelstudien ausgeweitet, einschließlich Primärzellen, die aus Patiententumoren isoliert wurden^13,15.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Corning	10-040-CV	Zellkulturmedium
Fötales Kälberserum (FBS)	Gemini	100-106	Medium Supplement
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15-140-122	Medium Supplement
TC20	Biorad	1450102	Zellzähler
TC20 Objektträger mit Trypanblau	Biorad	1450003	Zelle Gegenschieber
96-Well-Platten	Corning	3904	Platten mit klarem Boden
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	Lösung zur Resuspendierung des Medikaments
Hoechst	Invitrogen	H21491	nuklearer Farbstoff
Propidiumiodid (PI)	Invitrogen	P1304MP	Färbung toter Zellen
Cell Tracker Orange CMRA	Life Technologies	C34551	Ganzzellfärbung
Operetta High Content Imaging System	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institute	Version 2.2.0 (rev 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
Zellkultur-Inkubator			Jeder Zellkultur-Inkubator ist geeignet - die Zellen wurden unter 37 º C mit 5 % CO2,
15 mL konische Falcon-Röhrchen	Falcon	14-959-53A
10 cm2 Zellkulturplatten	TPP	93040