Diese Studie stellt eine Technik für die Isolierung von Neuronen aus WT neonatalen Mäusen vor. Es erfordert die sorgfältige Sezierung des Rückenmarks aus der neonatalen Maus, gefolgt von der Trennung von Neuronen aus dem Rückenmarksgewebe durch mechanische und enzymatische Spaltung.
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Methodenartikel
Wirbelsäule Neuronen Isolierung und Kultur aus neonatalen Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und Kultur der Rückenmark Neuronen. Die Neuronen werden aus neonatalen C57BL / 6-Mäusen gewonnen und sind am postnatalen Tag 1-3 isoliert. Ein Mausstreu, in der Regel 4-10 Welpen aus einem Zuchtpaar geboren, ist für ein Experiment gesammelt, und Wirbelsäule werden einzeln von jeder Maus nach Euthanasie mit Isofluran gesammelt. Die Wirbelsäule wird ausgeschnitten und dann wird das Rückenmark aus der Säule entnommen. Die Wirbelsäule werden dann gehackt, um die Oberfläche der Abgabe für eine enzymatische Protease zu erhöhen, die es ermöglicht, dass die Neuronen und andere Zellen aus dem Gewebe freigesetzt werden. Trituration wird dann verwendet, um die Zellen in Lösung freizusetzen. Diese Lösung wird anschließend in einem Dichtegradienten fraktioniert, um die verschiedenen Zellen in Lösung zu trennen, wodurch Neuronen isoliert werden können. Etwa 1-2,5 x 10 6 Neuronen können aus einer Wurfgruppe isoliert werden. Die Neuronen werden dann auf mit Klebstoff beschichteten Wells ausgesätRs, die für ein angemessenes Wachstum und Reifung zu ermöglichen. Die Neuronen dauern ca. 7 Tage, um die Reife im Wachstums- und Kulturmedium zu erreichen und können danach zur Behandlung und Analyse verwendet werden.
Einleitung
Das Verständnis der Rückenmarkpathologie erfordert die Verwendung verschiedener Modelle, sowohl auf makroskopischer als auch auf mikroskopischer Ebene. Große und kleine Tiermodelle 1 , 2 , 3 werden für in vivo Untersuchungen von Rückenmarkserkrankungen und Verletzungen verwendet. Während das Studium dieser Probleme in vivo hat seine Verdienste, ist die Analyse des Rückenmarks auf ganze Rückenmark-Homogenat oder Gewebe-Abschnitte 4 begrenzt . Dies schafft eine gewisse Unklarheit beim Versuch, spezifische Reaktionen und Ziele im ....
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Protokoll
Die Pflege und Behandlung von Tieren in diesem Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Colorado durchgeführt.
1. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten und lagern Sie alle Lösungen bei geeigneten Temperaturen, wie in Tabelle 1 gezeigt .
2. Beschichtungsbrunnen und -rutschen
HINWEIS: Neuronen haften nicht gut an Kunststoff- oder Glasoberflächen.
- Einen Tag vor der Isolierung der Neuronen beschichten die Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Kulturplatte mit 0,5 m....
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Ergebnisse
Mit dieser Technik erlaubt ein einzelner Wurf (4-10 Welpen) die Isolierung von 1-2,5 10 6 Neuronen, die für die Aussaat auf Kulturplatten geeignet sind. Typischerweise werden 4-8 Vertiefungen in der oben erwähnten Konzentration ( dh 300.000 Zellen / ml) ausgesät. Abbildung 3 zeigt das Auftreten von Neuronen in dieser Konzentration nach einer Woche in der Kultur bei der Nieder- ( a ) und der Hoch- ( b ) Ve.......
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Diskussion
Diese Technik ermöglicht die zuverlässige Kultur der Rückenmark Neuronen. Sobald die Technik erreicht ist, dauert es ca. 3,5 Stunden. Wir konnten die Isolierung von Neuronen aus 2 getrennten Würfen (16 Mäuse insgesamt) in ca. 4 h durchführen. Der entscheidende Schritt in der Machbarkeit ist es, die Rückenmarke von den Mäusen kompetent zu extrahieren. Die Ausbeute ermöglicht das Plattieren von mehreren Vertiefungen und die Fähigkeit, die Neuronen unter verschiedenen Bedingungen zu testen. Wir konnten die Neuronen nach de.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben.
Danksagungen
Die Autoren haben keine Anerkennung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hibernate A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium - 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X - 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 | |
| B27 Supplement 50X - 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, lyophilisiert - 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium - 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-Lysin (PDL) Hydrobromid - 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Maus Laminin - 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypanblau - 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium - 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlordimethylsilan ( DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glaspipette - 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipettenbirne - 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| MARKE® Petrischale, Glas - 60 x 15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24-Well-Zellkulturplatte | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hämazytometer (Zählkammer aus Glas) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
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| NeuN Rabbit Monoklonaler Antikörper - 100 & micro; L | Abcam | ab177487 | Nach Fixierung in Paraformaldehyd (PFA) und Blockierung mit 5 % BSA wurden Zellen auf einem 12 mm Deckglas in dem 1:200 verdünnten Antikörper für 18 h in 4 ° inkubiert; C |
| MAP-2 Maus Monoklonaler Antikörper - 50 & Mikro; L | Abcam | ab11267 | Nach Fixierung in Paraformaldehyd und Blockierung mit 5 % BSA wurden Zellen auf einem 12 mm Deckglas in dem 1:500 verdünnten Antikörper für 18 h in 4 & deg inkubiert; C |
Referenzen
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
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Nachdrucke und Genehmigungen
