PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Unzählige Wechselwirkungen und biochemische Prozesse finden auf zweidimensional flüssigen Membranoberflächen statt. Membran-umschlossene Organellen in eukaryotischen Zellen sind nicht nur in biochemischen Prozessen und ihrem assoziierten Proteom, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung einzigartig. Eine außergewöhnliche Klasse von Phospholipiden ist Phosphoinositide (PIPs). Obwohl sie nur 1% des zellulären Lipidoms enthalten, spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion, Autophagie und Membranhandel unter anderem ^{1 , 2 , 3 , 4} . Dynamische Phosphorylierung der Inositol - Kopfgruppe durch zelluläre PIP - Kinasen führt zu sieben PIP - Kopfgruppen , die Mono-, Bis- oder Tris-phosphoryliert ^5. Zusätzlich definieren PIPs die subzelluläre Identität von Membranen und dienen als spezialisierte Membran-Docking-Stellen für Proteine ​​/ Enzyme, die ein oder mehrere Phosphoinos enthaltenItide-bindende Domänen, z. B. Pleckstrin-Homologie (PH), Phox-Homologie (PX) und Epsin-N-terminale Homologie (ENTH) ^{6 , 7} . Eine der am besten untersuchten PIP-bindenden Domänen ist Phospholipase C (PLC) -δ1 PH-Domäne, die spezifisch mit Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P ₂ ) innerhalb einer hohen Nanomolar-niedrigen Mikromolarbereich-Affinität ⁸ wechselwirkt ^{, 9 , 10 , 11}

Eine Vielzahl von qualitativen und quantitativen in vitro Methoden wurden entwickelt und verwendet, um den Mechanismus, die Thermodynamik und die Spezifität dieser Wechselwirkungen zu untersuchen. Zu den am häufigsten verwendeten PIP-Bindungsassays gehören die Oberflächenplasmonresonanz (SPR), die isotherme Kalorimetrie (ITC), die Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie, der Liposom-Flotations- / Sedimentationsassay und die Lipidblots (Fat-Blots / PIP-Streifen)^{12 , 13} Auch wenn diese weitgehend genutzt werden, haben sie alle viele Nachteile. Zum Beispiel benötigen SPR, ITC und NMR große Mengen an Probe, teure Instrumentierung und / oder geschultes Personal ^{12 , 13} . Einige Assayformate wie Antikörper-basierte Lipid-Blots verwenden wasserlösliche Formen von PIPs und präsentieren sie in einer nichtphysiologischen Weise ^{12 , 14 , 15 , 16} . Darüber hinaus können Lipid-Blots nicht zuverlässig quantifiziert werden und haben oft zu falsch-positiven / negativen Beobachtungen ^{12 , 17 , 18 geführt} . Um diese Herausforderungen zu bewältigen und den aktuellen Werkzeugsatz zu verbessern, wurde eine neue, etikettfreie Methode auf Basis einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) im Rahmen von am Mikrofluidische Plattform, die erfolgreich auf die Untersuchung von Protein-PIP-Wechselwirkungen angewendet wurde ( Abbildung 1 ) ¹⁹ .

Die zur Detektion von Protein-PIP-Wechselwirkungen eingesetzte Strategie basiert auf der pH-Modulationssensorik. Hierbei handelt es sich um einen pH-empfindlichen Farbstoff, der ortho- Sulforhodamin B ( o SRB) direkt an die Phosphatidylethanolamin-Lipidkopfgruppe ²⁰ konjugiert hat. Die o SRB-POPE-Sonde ( Fig. 2A ) ist bei niedrigem pH-Wert hoch fluoreszierend und bei hohem pH-Wert mit einem pKa um 6,7 innerhalb von 7,5 Mol-% PI (4,5) P ₂ -haltigen SLBs abgeschreckt ( Fig. 5B ). PLC-δ1-PH-Domäne wurde für die Validierung von Protein-PIP-Bindungsmethoden aufgrund ihrer hohen Spezifität gegenüber PI (4,5) P ₂ ( Abbildung 5A ) ^{21 , 22 ,}"> 23 ^{, 24 , 25.} Daher haben wir festgestellt, dass die PLC-δ1-PH-Domäne verwendet werden kann, um ihre Bindung an PI (4,5) P ₂ durch den PIP-on-a-Chip-Assay zu testen. Das PH-Domänen-Konstrukt verwendet , das in dieser Studie eine positive Nettoladung (pI 8,4) hat, und so zieht OH ^-. Ionen (5C) auf zu PI (4,5) P ₂ -haltigen SLBs Bindung bringt die PH - Domäne , die OH ^- Ionen zu dem Membranoberfläche, die wiederum das Grenzflächenpotential moduliert und den Protonierungszustand von o SRB-POPE verschiebt ( Abbildung 5C ) ^26. Als Funktion der PH-Domänenkonzentration wird die Fluoreszenz abgeschreckt ( Abbildung 6A ). Schließlich sind die normierten Daten Zu einer bindenden Isotherme passt, um die Affinität der PH-Domäne-PI (4,5) P ₂ -Interaktion zu bestimmen ( Abbildung 6B , 6C )/ P>

In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um Proteinbindung an PIP-haltige SLBs innerhalb einer mikrofluidischen Plattform durchzuführen. Dieses Protokoll nimmt den Leser vom Zusammenbau der mikrofluidischen Vorrichtung und der Vesikelpräparation zur SLB-Bildung und Proteinbindung an. Zusätzlich werden Richtungen für die Datenanalyse zur Extraktion von Affinitätsinformationen für die PLC-δ1-PH-Domäne-PI (4,5) P ₂ -Interaktion bereitgestellt.

1. Reinigung der Glasdeckel

1. 7x Reinigungslösung verdünnen (siehe Werkstofftabelle ) 7-fach mit entionisiertem Wasser in einer 100 mm tiefen Borsilikatglasschale mit flachem Boden und erhitze sie bis zu 95 ° C auf einer ebenen Heizplatte für 20 min oder bis die trübe Lösung klar wird .
   HINWEIS: Die Lösung wird heiß, Vorsicht, um Körperverletzungen zu vermeiden. Die 7x Reinigungslösung ist eine proprietäre Mischung aus Hexanatrium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] oxyphosphoryl] phosphat, 2- (2-Butoxyethoxy) ethanol, Natrium-1,4-bis (2-ethylhexoxy) -1,4-dioxobutan -2-sulfonat und nicht gefährliche Zusätze.
2. Mit Pinzetten die Deckgläser (40 mm Länge x 22 mm Breite x 0,16-0,19 mm Höhe) auf einem Aluminium-Färbegestell in abwechselnden Richtungen anordnen. Halten Sie einen leeren Fleck zwischen jedem Deckglas, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig berühren.
3. Völlig das Färbegestell mit den Deckgläsern in die Reinigungslösung eintauchen. Halten Sie die Deckgläser inDie Lösung für 1 h.
   HINWEIS: Wenn das Wasser verdunstet ist, füge man frisches deionisiertes Wasser hinzu, um die Lösungskonzentration unverändert zu halten.
4. Nehmen Sie die Färbereien aus der Reinigungslösung und waschen Sie die Deckgläser mit reichlich Menge an entionisiertem Wasser ab, um das Waschmittel zu entfernen.
5. Trocknen Sie die Deckgläser mit Stickstoffgas (ca. 5 min pro Färbegestell) und legen Sie die Deckgläser in einen Ofen für 6 h bei 550 ° C zum Glühen auf.
   HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt, der grobe Eigenschaften auf der Glasoberfläche glättet.
6. Legen Sie die Deckgläser in einen Plastikbehälter und halten Sie sie vor Staub.

2. Herstellung von Micropatterned PDMS-Blöcken

1. Das Polydimethylsiloxan (PDMS) -Prepolymer und das Härtungsmittel im Verhältnis 10: 1 (w / w) in einem großen Plastikwaagen mischen und im Vakuum für 1 h mit Vakuumfestigkeit bei 500 Torr oder weniger entgasen.
   HINWEIS: PDMS ist ein transparentes und inertes Silikonpolymer. Um den gewünschten PDMS-Block zu bekommen tHülligkeit (0,5 cm), 55 g des Präpolymers mit 5,5 g des Härters vermischen.
2. Legen Sie den Silizium-Master, der mehrere Replikate des gleichen SU-8 Micropattern in einem großen (10 cm Basen Durchmesser) Kunststoff wiegen Boot und gießen Sie in die entgaste PDMS. Dann heilen Sie es in einem trockenen Ofen bei 60 ° C über Nacht.
   HINWEIS: Micropattern sind groß genug, um mit dem bloßen Auge gesehen zu werden. Jedes Muster enthält 8 Mikrokanäle (100 μm Breite x 40 μm Höhe x 1 cm Länge) mit 40 μm Abstand dazwischen ( Abbildung 1A , 1B ). Silizium-Wafer-Form, die aus hartgebackenem SU-8-Photoresist besteht, wurde in einer Nanofabrikationsanlage ^{27 hergestellt} . Andere Ansätze für die Vorbereitung von Zubereitungen umfassen Flußsäure (HF) Ätzen, Hochtemperatur-Wasser-Ätzen, Xurographie und 3D-Druck ^{28 , 29 , 30 , 31} . CommercEs können auch Quellen für die Silizium-Master-Vorbereitung verwendet werden. Die Muster für das mikrofluidische Gerät wurden mit einer Entwurfssoftware entworfen (siehe Tabelle der Materialien). Die Originaldatei mit dem Musterdesign wird als Ergänzungsdatei "Pattern Design.dwg" zur Verfügung gestellt, die direkt dem Hersteller zur Verfügung gestellt werden kann.
3. Schieben Sie das PDMS vorsichtig aus dem Silizium-Master mit den Händen ab. Markiere die Grenzen jedes Mikromusters in Rechtecken mit einem chirurgischen Skalpell und einem Lineal. Dann schneide das PDMS in Blöcke.
4. Stanzen Sie 16 Löcher (8 Einlässe und 8 Auslässe pro Block) an beiden Enden jedes Mikrokanals mit einem Biopsie-Stempel (1,0 mm Lochdurchmesser), wie in 3B gezeigt .
5. Tragen Sie Klebeband über jeden PDMS-Block auf, um die Mikromuster vor Beschädigung und Staub zu schützen. In einem Plastikbehälter aufbewahren.

3. Vorbereitung kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs)

HINWEIS: Negative Kontrolle Doppelschicht ZusammensetzungIst 99,5 Mol-% 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphocholin (POPC) und 0,5 Mol-% ortho- Sulforhodamin-B-1-palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamin ( o SRB- PAPST). Test-Bilayer-Zusammensetzung beträgt 92,0 Mol-% POPC, 0,5 Mol-% o SRB-POPE und 7,5 Mol-% entweder L-α-Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P) oder L-α-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI ( 4,5) P _2). Unten ist das Verfahren zur Herstellung von 92,0 Mol-% POPC, 0,5 Mol-% o SRB-POPE und 7,5 Mol-% PI (4,5) P ₂ -haltigen SUVs. Die Synthese von o SRB-POPE, die in dieser Studie verwendet wurde, wurde zuvor beschrieben ²⁰ .

1. Berechnen Sie das Volumen von POPC, PI (4,5) P ₂ und o SRB-POPE, das gemischt werden muss, was die folgenden Gesamtmengen ausmacht: 2,22 mg POPC, 0,26 mg PI (4,5) P ₂ , und 2,1 x 10 ^-5 mg o SRB-Papst.
2. Pipette das berechnete Volumen von POPC, PI (4,5) P ₂ , <Em> o SRB-POPE in eine einzelne 20 ml Glas-Szintillationsröhre.
   HINWEIS: POPC- und o SRB-POPE-Stammlösungen kommen in eine Chloroformlösung, während der PI (4,5) P ₂ (und andere Phosphoinositide) in einem Chloroform: Methanol: Wasser (20: 9: 1) Lösungsmittelgemisch vorliegt. Für die Genauigkeit die Pipettenspitze mit Chloroform benetzen, bevor Sie sie verwenden. Aus Sicherheitsgründen sollte dieser Schritt in einer chemischen Dunstabzugshaube erfolgen.
3. Trocknen Sie die Mischung in einem Stickstoffgasstrom innerhalb einer chemischen Dunstabzugshaube für 10 min oder bis das Lösungsmittel verdampft und ein dünner Lipidfilm am Boden der Durchstechflasche bildet.
4. Die Mischung unter Vakuum für ≥ 3 h bei einer Vakuumfestigkeit von 10 mTorr trocknen, um restliches organisches Lösungsmittel zu entfernen.
   HINWEIS: Die 3-stündige Austrocknungszeit reicht für den in diesem Protokoll beschriebenen Maßstab der SUV-Vorbereitung aus, der für 50 Experimente ausreicht. Wenn ein größerer Maßstab der SUV-Vorbereitung erforderlich ist, kann eine Übertrocknung durchgeführt werden.
5. Rehydrieren Sie die drLipidfolie mit 5 ml Laufpuffer (20 mM HEPES, 100 mM NaCl bei pH 7,0) gegeben und in einem Ultraschallbad bei einer Betriebsfrequenz von 35 kHz für 30 min bei RT gegeben.
   ANMERKUNG: Das Mischen der in Schritt 3.1 angegebenen Mengen an Lipiden und das Hinzufügen von 5 ml Laufpuffer in Schritt 3.5 ergibt eine Vesikelsuspension mit 0,5 mg / ml. In diesem Stadium ist die Vesikelsuspension eine Mischung aus unilamellaren und multilamellaren Vesikeln ( Abbildung 2B ). Die Lösung erscheint rosa / lila in der Farbe und relativ trüb.
6. Gefrier-Tauwetter die Vesikel-Suspension mit flüssigem Stickstoff und Wasserbad bei 40 ° C, um unilamellare Vesikel zu bekommen. Wiederholen Sie das Gefrier-Tau-10 mal.
   HINWEIS: (Optional) Um das Fehlen von nicht-unilamellaren Vesikeln in der Suspension zu gewährleisten, kann der Zentrifugationsschritt ^{32 , 33} angewendet ^werden .
7. Extrudieren der Vesikelsuspension durch eine 0.10 μm gleisgeätzte Polycarbonatmembran unter Verwendung eines Lipidextruders (sTabelle der Materialien), um für SUVs zu bereichern. Wiederholen Sie die Extrusion 10 mal.
   HINWEIS: Ein 15-mL konisches Rohr kann verwendet werden, um die extrudierten Vesikel zu sammeln. Die Lösung sollte in diesem Stadium ungünstig sein. SUV-Durchmesser kann durch dynamische Lichtstreuung (DLS) bestätigt werden ( Abbildung 2C ). SUVs eignen sich am besten für die Bildung von SLBs ³⁴ .
8. Das konische Rohr mit Aluminiumfolie abdecken und bei 4 ° C aufbewahren.

4. Zusammenbau der mikrofluidischen Vorrichtung

1. Testen Sie die Einlässe und Steckdosen des PDMS-Blocks auf Blockade, indem Sie deionisiertes Wasser durch die Löcher mit einer Wasserwaschflasche spritzen. Dann trocknen Sie den PDMS-Block mit Stickstoffgas.
   HINWEIS: Dieser Schritt entfernt auch alle Staubpartikel, die möglicherweise innerhalb und / oder zwischen den Kanälen gefangen wurden. Gegebenenfalls vorgereinigte Deckgläser mit Stickstoffgas entstauben, um Staubpartikel zu entfernen.
2. Legen Sie den PDMS-Block und die vorgereinigte(Siehe Abschnitt 1) ​​im Inneren des Sauerstoffplasmasystems (siehe Tabelle der Werkstoffe) Probenkammer mit Sauerstoffplasma für 45 s mit Leistungseinstellung bei 75 Watt, Sauerstoffdurchflussgeschwindigkeit bei 10 cm ³ / min und Vakuumstärke bei 200 mTorr .
3. Legen Sie die gemusterte Oberfläche des PDMS-Blocks sofort nach der Sauerstoff-Plasmabehandlung mit dem Deckglas in Berührung. Drücken Sie vorsichtig, um Luftblasen an Kontaktstellen zu entfernen.
4. Legen Sie das Gerät auf eine ebene Heizplatte bei 100 ° C für 3 min, um die Verklebung zu verbessern.
5. Verwenden Sie ein nasses fusselfreies Wischen ( zB Kimwipe) mit 100% Ethanol, um Staubpartikel von oben (PDMS) und den Boden (Glas) des Gerätes zu entfernen. Dann klebe das Gerät auf ein Glasmikroskop-Objektträger.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine übermäßige Menge an Ethanol und vermeiden Sie, dass Ethanol in die Einlass- und Auslasskanäle gelangt. Wenn Sie diesen Schritt durchführen, während das Gerät noch heiß ist, wird empfohlen, um sicherzustellen, dass das Ethanol sofort verdunstet. Glas micrOscopy-Folien können in 100% iger Ethanol-Lösung gelagert werden, um Staub und andere Verunreinigungen zu entfernen.

5. Gestaltung unterstützter Lipid-Bilayer (SLBs)

1. Übertragen Sie 100 μl PI (4,5) P ₂ -haltige SUVs aus Schritt 3.8 in ein 0,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Den pH-Wert der Lösung auf ~ 3,2 einstellen, indem man 6,4 μl 0,2 N Salzsäure zugibt.
   HINWEIS: Bestätigen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter, der mit einer Mikro-pH-Sonde ausgestattet ist (siehe Tabelle der Materialien).
2. 10 μl der pH-angepassten SUV-Lösung in den Kanal durch den Einlass pipettieren und durch die Pipette Druck drücken, bis die Lösung den Auslass erreicht. Trennen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie an das Gerät angeschlossen.
3. Wiederholen Sie den obigen Schritt für jeden Kanal und inkubieren Sie das Gerät für 10 min bei RT.
   HINWEIS: Die Injektion von Vesikeln in Mikrokanäle sollte unmittelbar nach der Gerätemontage erfolgen.
4. Schneidsätze von Einlass- und Auslaufschlauch eaCh 60 cm (Einlaßschlauch) und 8 cm (Auslaßschlauch) lang.
   HINWEIS: Schneiden Sie den Schlauch diagonal und schaffen eine scharfe Kante, macht es einfacher, den Schlauch in die Einlässe und Steckdosen einzusetzen. Der Auslaufschlauch sollte eine Bogenform haben. Die Länge des Einlassrohres kann je nach Mikroskopaufbau variieren. Der Innendurchmesser des Schlauches beträgt 0,05 cm.
5. Mit Pinzette den Auslassschlauch auf das Gerät anschließen und dann das Gerät auf eine Mikroskopstufe aufkleben.
6. Tauchen Sie ein Ende des Einlassrohres in 25 ml Laufpuffer in einem konischen Rohr und Band, um sicherzustellen, dass die Schläuche gesichert ist.
7. Legen Sie das konische Rohr auf einen höheren Boden (~ 20 cm) als die Vorrichtung, um die Lösung durch die Mikrokanäle über den Schwerkraftfluss zu schieben; Hier kann eine Laborbuchse verwendet werden.
8. Für jedes Einlassrohr verwenden Sie eine Spritze, um 1 ml Laufpuffer aus dem freien Ende des Schlauches zu ziehen. Entfernen Sie die Pipettenspitze vom Einlass und stecken Sie dieFreies Ende des Einlassrohres in das Gerät.
   HINWEIS: Führen Sie einen Tropfen Laufpuffer auf den Einlass ein, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass eine Luftblase während dieses Schrittes in den Kanal eingeführt wird. Nachdem der Einlassschlauch am Gerät befestigt ist, verwenden Sie ein fusselfreies Wischen, um den überschüssigen Puffer zu entfernen.
9. Wiederholen Sie den obigen Schritt, um alle Einlassschlauchstücke mit dem Gerät zu verbinden.
   HINWEIS: Fließender Laufpuffer durch die Kanäle hilft, überschüssige Vesikel zu entfernen und die Doppelschicht auf experimentelle Bedingungen auszugleichen.
10. Öffnen Sie die Mikroskop-Steuerungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Klicken Sie auf der linken Seite auf die Registerkarte "Mikroskop" und wählen Sie das Ziel "10X".
11. Klicken Sie auf "Live" und dann "Alexa 568" Bildsymbole auf der Symbolleiste. Mit den Fein- und Kurseinstellknöpfen auf den Mikrokanälen fokussieren.
12. Scannen Sie durch das Gerät, um die Qualität der SLBs und der Kanäle zu überprüfen ( Abbildung 8 ). Dann,Klicken Sie auf der Symbolleiste auf das Symbol "FL Shutter Closed".
13. Klicken Sie auf die Registerkarte "Akquisition" und wählen Sie unter "Grundeinstellungen" die Option "Belichtungszeit". Stellen Sie die Belichtungszeit auf "200 ms" ein.
14. Klicken Sie auf der linken Seite auf "Multidimensionale Akquisition" und wählen Sie unter dem Filtermenü den roten Kanal (markiert als "Alexa 568"). Dann klicken Sie auf das Menü "Zeitraffer", stellen Sie das Zeitintervall auf 5 min, Dauer auf 30 min und klicken Sie auf "Start".
    HINWEIS: Auf der Grundlage der Dauer (30 min) und der Durchflussrate (~ 1,0 μl / min) werden 30 μl Laufpuffer zum Equilibrieren des SLB innerhalb eines Kanals verwendet, dh für alle 8 Kanäle werden 240 μl Laufpuffer verwendet.
15. Wählen Sie das "Circle" -Tool unter der Registerkarte "Measure" und zeichnen Sie einen Kreis in einem beliebigen Kanal. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während der Kreis ausgewählt ist und wählen Sie "Eigenschaften". Klicken Sie auf der Registerkarte "Profil" auf "Alle T", um die Ansicht anzuzeigenFluoreszenzintensität als Funktion der Zeit.
    1. Stellen Sie sicher, dass diese Kurve ein Plateau erreicht, was das Gleichgewicht anzeigt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
16. Senken Sie die Pufferlösung auf einen gleichen Boden, wie das Gerät, um den Fluss zu stoppen.
17. Sparen Sie die Zeitraffer-Datei.

6. Testen der PLC-δ1-PH-Domänen-Interaktion mit PI (4,5) P ₂ -haltigen SLBs

1. Bereiten Sie Verdünnungen der PH-Domäne mit dem laufenden Puffer als Verdünnungsmittel vor.
   HINWEIS: Da es acht Kanäle innerhalb des Gerätes gibt, verwenden Sie mindestens zwei davon für leere Steuerelemente. Wählen Sie die entfernten Enden auf jeder Seite und verwenden Sie die restlichen Kanäle für Proteinverdünnungen. Die folgenden PH-Domänenkonzentrationen wurden getestet: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 und 2,50 & mgr; M. Etwa 200 & mgr; l jeder Verdünnung reichten aus, um innerhalb von 30 min ein Gleichgewicht zu erreichen.
2. Eine nach dem anderen, trennen Sie jeden Auslaufschlauch und wenden Sie 200 μl jeder Proteinverdünnung inDer Auslaufkanal mit einer Pipette. Wenden Sie keinen Druck an, lassen Sie die Schwerkraft die Arbeit machen. Trennen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie an der mikrofluidischen Vorrichtung angebracht.
3. Wiederholen Sie den obigen Schritt für jeden Kanal und stellen Sie sicher, dass Luftblasen nicht in die Kanäle während dieses Prozesses eingeführt werden.
4. Senken Sie den Einlassschlauch auf einen Boden unterhalb der mikrofluidischen Vorrichtung, um das Fließen des Proteins durch die Mikrokanäle zu beginnen. Kleben Sie das freie Ende des Schlauches zu einem Abfallbehälter. Fließen Sie die Proteinverdünnungen für 30 min.
   HINWEIS: Dies wird den Fluss umkehren und das Protein in die Kanäle einführen lassen. Die Zeit bis zur Äquilibrierung und das Volumen der benötigten Proteinverdünnungen hängt von der Affinität der Wechselwirkung ab.
5. Klicken Sie auf der linken Seite der Software unter der Registerkarte "Zeitraffer" auf "Start", um die Bildgebung erneut zu starten.
6. Wiederholen Sie den Schritt 5.15, um sicherzustellen, dass das Gleichgewicht erreicht ist. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, speichern Sie den ZeitrafferDatei.

7. Beurteilung der Membranflüssigkeit

ANMERKUNG: Fluoreszenz-Wiederherstellung Nach Photobleaching (FRAP) Experimente sollten mit jeder neuen Charge von SUVs durchgeführt werden und gereinigte Glas-Deckgläser, um sicherzustellen, dass die SLBs flüssig sind.

1. Befolgen Sie die Vorgehensweise für die Reinigung von Glasdeckgläschen (1.1-1.6), die Herstellung von mikrostrukturierten PDMS-Blöcken (2.1-2.5), die Vorbereitung von SUVs (3.1-3.8), die Montage der mikrofluidischen Vorrichtung (4.1-4.5) und die Bildung von SLBs (5.1-5.17) wie bisher Beschrieben.
2. Konzentriere das Mikroskop auf die Doppelschicht, stelle die Belichtungszeit auf 200 ms und das Binning auf 1.
3. Bleichen Sie einen Kreisfleck mit einem 532 nm, 2 mW Laserstrahl (13 μM Radius). Unmittelbar nach der Photobleichung beginnen Sie, eine Serie von Bildern alle 3 s für die ersten 45 s zu erfassen, gefolgt von einem 30 s Intervall für den Rest der Zeit (15 min Gesamtdauer). Sobald die Datenerfassung abgeschlossen ist, speichern Sie die Zeitraffer-Datei.
4. Wähle die gebleicht aRea mit dem Kreiszeichnungswerkzeug, um Fluoreszenzintensitätswerte als Funktion der Zeit zu extrahieren. Zusätzlich wählen Sie zwei weitere Bereiche in der Nähe, eine entsprechend einer ungebleichten Region und einer, die einer Region ohne SLB entspricht.
5. Berechnen Sie die Fluoreszenzwiederherstellung ( y ) unter Verwendung der folgenden Gleichung:
   
   HINWEIS: Hier F _t die Intensität des gebleichten Bereichs als eine Funktion der Zeit darstellt, F _i die Fluoreszenzintensität vor dem Bleichen (use „1“ als normierter Wert in diesem Fall); F ₀ ist die Hintergrundintensität.
6. Plot Fluoreszenz Erholung (y-Achse) als Funktion der Zeit (x-Achse), um eine FRAP-Kurve zu generieren. Dann passen Sie die Daten zu einer einzigen exponentiellen Funktion wie folgt,
   
   HINWEIS: Hier steht A für den mobilen Bruch und t _1/2 ):
   
7. Verwenden Sie die t _1/2 , um die Diffusionskonstante ( D ) zu berechnen:
   
   HINWEIS: Hier steht R für den Laserstrahlradius (13 μm). Die Diffusionskonstante für eine flüssige Doppelschicht sollte ≥1,0 ​​μm ² / s betragen.

8. Daten verarbeiten

HINWEIS: Die Routine der Datenanalyse hängt vom Mikroskop, der Bildverarbeitungssoftware und der verwendeten Kurvenanpassungssoftware ab.

1. Öffnen Sie die Zeitraffer-Dateien von vor (ab Schritt 5.17) und nach (ab Schritt 6.6) Titration der PH-Domäne. Gehen Sie zum letzten Frame von jeder Zeit Lapse-Datei und führen Sie eine Linie Scan über alle Mikrokanäle, um die Fluoreszenz zu erhaltenIntensitätsdaten als Funktion der Distanz in Pixeln ( Abbildung 6A ). Übertragen Sie die Daten in eine Tabellenkalkulationssoftware.
2. Für jeden Mikrokanal (vor und nach der PH-Domain-Addition) probieren Sie einige Daten innerhalb des Kanals und auf beiden Seiten des Kanals, der die Grundlinie repräsentiert ( Abbildung 7A ).
   HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität des Blindkanals sollte unverändert geblieben sein. Alle anderen Kanäle sind auf den leeren Kanal normiert, so dass es entscheidend ist, zwei leere Kanäle zu haben und sicherzustellen, dass ihre Fluoreszenzintensitäten mit einander übereinstimmen.
3. Wenden Sie die folgende Formel an, um die Daten auf den leeren Kanal zu normalisieren. Eine Beispielberechnung ist in 7B vorgesehen .
   
   HINWEIS: Hierbei repräsentiert ΔF- _Protein die vom Hintergrund subtrahierte Fluoreszenzintensität des Proteinkanals, Δ, F- _Blind repräsentiert die Hintergrund-subtrahierte Fluoreszenzintensität des Blindkanals, vor und nach dem Verweis auf vor und nach Proteintitrationsschritten und α stellt den Korrekturfaktor dar, der das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten des Proteinkanals und des Blindkanals ist ([ F- _Protein / F- _Blind ] _vor ) bei einem Pre-Protein-Titrationsschritt. Da die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der PH-Domänenkonzentration abnimmt, sind normalisierte Daten negativ im Wert.
4. Mit einer Kurvenanpassungssoftware (siehe Materialtabelle ) die normalisierte Fluoreszenz als Funktion der PH-Domänenkonzentration auftragen und an eine Langmuir-Isotherme anpassen ( Abbildung 6C ):
   
   HINWEIS: Hierbei repräsentiert ΔF die Änderung der Fluoreszenzintensität gegenüber der maximalen FluoänderungResistenz-Intensität, wenn eine Sättigungskonzentration von Protein vorliegt ( ΔF _max ), während die K _{d, app} die scheinbare Dissoziationskonstante darstellt, die gleich der Bulk-Proteinkonzentration ist ( [PLC-δ1 PH] ), bei der 50% Membran-gebundener Komplex) erreicht wird. Dies ist eine gleichgewichtsbasierte Bindungsmessung, so dass die normalisierten Daten zu einer einfachen Langmuir-Isotherme passen, um einen scheinbaren experimentellen Parameter K _{d, app} zu extrahieren. Basierend auf der Anpassungssoftware beträgt die K _{d, App} für PLC-δ1 PH-PI (4,5) P ₂ -Interaktion 0,39 ± 0,05 μM ( Abbildung 6B ).

Wir verwendeten den pH-Modulationstest, um die PLC-δ1 PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion innerhalb eines PIP-on-a-Chip-Mikrodevals zu untersuchen ( Abbildung 1 ). Durch ein detailliertes Protokoll haben wir gezeigt, wie man mikrofluidische Gerätekomponenten vorbereitet und zusammensetzt, kleine unilamellare Vesikel (SUVs) bildet ( Abbildung 2 ), SLBs innerhalb einer Vorrichtung bilden ( Abbildung 3 ) und getestete Proteinbindung an PIP-haltige SLBs. Ein Flussdiagramm eines typischen SLB-Bindungsexperiments ist in 4 dargestellt . Das Prinzip des pH - Modulations Tests wird in 5 veranschaulicht das PH - Domäne-PI unter Verwendung von (4,5) P 2 als ein Beispiel zu binden. Die aus dieser Studie gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PH-Domäne an PI (4,5) P 2 -haltige SLBs bindet. Genauer gesagt, beobachteten wir, dass bei der Bindung der lokale pH-Wert einfacher wurde. Dies lokale pH - Änderung wurde durch die O - SRB-POPE fluoreszierenden Sonde , die innerhalb SLBs erfaßt wird , die dann entsprechend (6A, 6C) gequencht wurde. Das Abschrecken war konzentrationsabhängig und sättigbar, so dass die Anpassung der Daten an eine Langmuir-Isotherme eine Kd, App von 0,39 ± 0,05 μM ergab ( Abbildung 6B , 6D ). Die PH-Domäne zeigte eine Selektivität gegenüber PI (4,5) P 2, da keine Bindung gegenüber POPC (zwitterionisches Lipid) und einer schwächeren Bindung an PI4P-haltige SLBs ( K d, app = 1,02 ± 0,20 μM) beobachtet wurde ( 6B ). Eine Stichprobenberechnung ist enthalten, um zu zeigen, wie Fluoreszenzdaten verarbeitet werden ( Abbildung 7 ). In Fig. 8 werden eine Reihe von Mikrokanalbildern dargestellt, um visuelle Hinweise zur Bestimmung der Qualität von SLBs und der Mikrokanäle bereitzustellen.

Abbildung 2. Kleine unilamellare Vesikel (SUV) Vorbereitung und Qualitätskontrolle Studien. ( A ) Lipidkomponenten, die bei der Herstellung von Vesikeln verwendet werden: ortho -Sulforhodamin B-POPE ( o SRB-POPE), L-α-Phosphatidylinositol-4-phosphat (PI4P), L-α-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat ( PI (4,5) P 2 ) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn- glycero-3-phosphocholin (POPC). ( B ) Arten von Lipidvesikeln: SUV, großes unilamellares Vesikel (LUV), Riesiges unilamellares Vesikel (GUV) und multilamellare Vesikel (MLV). SUVs eignen sich am besten für die Vorbereitung der SLBs 34 . ( C ) Dynamische Lichtstreuung (DLS) basierte Bestätigung über die Größe der Vesikel-Nachlipid-Extrusion (durch 0,1 μm Filter). Der hydrodynamische Radius (Rh) von 53,9 nm bestätigt, dass die m Ean der Vesikelgrößenverteilung ist ~ 100 nm. Ergebnisse stellen die Messung von PI (4,5) P 2 -haltigen SUVs dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: SLB-Bildung auf einer Glasstütze. ( A ) Vesikel der gewünschten Lipidzusammensetzung werden hergestellt und dann durch Mikrokanäle geflossen. Vesikel werden an der Glasoberfläche adsorbiert und deformiert. Sobald eine kritische Oberflächenbedeckung erreicht ist, bricht die Bläschen spontan zu SLBs. Angepasst aus den Referenzen 35 , 36 . ( B ) SLBs innerhalb eines Gerätes unter einem 10fachen Objektiv wird gezeigt. Alexa 568 Filtersatz (Anregung / Emission bei 576/603 nm) wird verwendet.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Flussdiagramm eines typischen SLB-Bindungsexperiments Mikrofluidische Gerätekomponenten, dh gemusterter PDMS-Block und gereinigte Deckgläser, werden mit Sauerstoffplasma behandelt, um beide Oberflächen hydrophil zu machen und dann zusammenzubauen. SUVs werden durch Mikrokanäle geleitet, um SLBs zu bilden. Überschüssige Vesikel werden entfernt und SLBs werden zu experimentellen Bedingungen durch Fließen einer laufenden Pufferlösung äquilibriert. Dann werden Proteinverdünnungen durch Mikrokanäle durchströmt. Schließlich werden die Fluoreszenzintensitätsdaten analysiert, normalisiert und als Funktion der Proteinkonzentration aufgetragen. Die normalisierten Daten passen zu einer Funktion, um eine scheinbare Dissoziationskonstante ( K d, app ) va zu extrahierenLue Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Prinzipien der pH-Modulations-basierten Erfassung. ( A ) Röntgenstruktur der PLC-δ1-PH-Domäne im Komplex mit PI (4,5) P 2 -Kopfgruppe Inositol 1,4,5-Trisphosphat (Ins (1,4,5) P 3 ) (PDB ID: 1MAI) 37 . ( B ) Die o SRB-POPE-Sonde ist bei niedrigem pH-Wert hoch fluoreszierend und bei hohem pH-Wert mit einem pKa von 6,7 innerhalb von 7,5 Mol-% PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs, wie in der pH-Titrationskurve angegeben, abgeschreckt. ( C ) Die in dieser Studie verwendete PH-Domäne hat einen isoelektrischen Punkt (pI) von 8,4, so dass bei experimentellem pH (7,0) das Protein positiv geladen ist. Ein positives c tragenDas Protein zieht OH - Ionen an. Wenn die PH - Domäne bindet , PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs, er die OH bringt - Ionen an die Membranoberfläche wird das Grenzflächenpotential , das das Protonierungsgrad von o SRB-POPE wiederum moduliert verschiebt, und ihre Fluoreszenz Wird in PH-Domäne konzentrationsabhängig abgeschreckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: PLC-δ1 PH-Membranbindung über pH-Modulation überwacht ( A ) Die Ansicht der Mikrokanäle vor und nach der Zugabe der PH-Domäne bei angegebenen Konzentrationen. ( B ) Vergleich der Affinitäten gegenüber POPC, PI4P und PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs. PH Domain Bindung Bis 7,5 Mol-% PI (4,5) P 2 -haltige SLBs ergab eine K d, app von 0,39 ± 0,05 μM. Eine schwächere Bindung wurde gegenüber 7,5 Mol-% PI4P-haltigen SLBs (Kd , app von 1,02 ± 0,20 & mgr; M) beobachtet, und es wurde keine Bindung für reine POPC-SLBs beobachtet. Fehlerbalken zeigen SEM (n = 3) an. Zwei-tailed- t- test wurde verwendet, um die Affinitäten zwischen PI4P und PI (4,5) P 2 -Bindung (* p = 0,0396) zu vergleichen. ( C ) Fluoreszenzintensitäten von der Zeilenabtastung über Mikrokanäle werden als Funktion der Distanz in Pixeln für POPC-, PI4P- und PI (4,5) P 2 -bindungsversuche aufgetragen. ( D ) Normalisierte und gemittelte POPC-, PI4P- und PI- (4,5) P 2 -bindungsdaten sind als Funktion der PLC-δ1-PH-Domänenkonzentration aufgetragen und passen dann zu einer Langmuir-Isotherme, um K d, app zu extrahieren. Siehe die Gleichung in Schritt 8.4 für Details."Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7: Beispielberechnung für Datenverarbeitung. ( A ) Vor (Schwarz-) und nach (rotem) Proteintitrationslinien-Scan-Daten für Blind- (kein Protein) und Proteinkanal, wobei Fluoreszenzintensitätsdaten als Funktion der Distanz in Pixeln dargestellt werden. Schattierte Bereiche repräsentieren die Regionen, die verwendet wurden, um Daten für die Berechnungen zu extrahieren. Baseline-Fluoreszenzintensitätsdaten werden direkt vor und nach jedem Kanal extrahiert. ( B ) Die Daten werden für Blind- und Proteinkanäle sowohl vor als auch nach der Proteintitration extrahiert. Die Mittelwerte werden für die Grundlinie und innerhalb eines Kanals Fluoreszenzdaten durchgeführt. Nach der Baseline-Subtraktion werden die Fluoreszenzdaten auf den leeren Kanal normiert. Siehe die Gleichung in Schritt 8.3 für Details. Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8: Beurteilung der Integrität von SLBs und Mikrokanälen. ( A ) Ein Bild, das hochwertige SLBs und Mikrokanäle veranschaulicht. ( B ) Unvollständige Fusion. ( C ) Kondensierte Mikrokanäle ( D ) Staubpartikel, die in einem Mikrokanal gefangen sind. ( E ) Luftblasen, die in Mikrokanälen gefangen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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