Name: PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie die PIP-on-a-Chip-Technik zur quantitativen, label-freien Analyse von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen auf mikrofluidischen Plattformen. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante Studien membranständiger Proteine.

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DS und CEC wurden teilweise durch die Gewährung von AI053531 (NIAID, NIH) unterstützt; SS und PSC wurden durch die Erteilung von N00014-14-1-0792 (ONR) unterstützt.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Jede PIP-Variante, wenn auch bei niedrigen Konzentrationen, liegt auf der zytosolischen Oberfläche spezifischer Organellen vor, wo sie zur Etablierung einer einzigartigen physikalischen Zusammensetzung und funktionellen Spezifität der organellaren Membran 1 beitragen. Eine der wichtigsten Verwendungen von PIPs ist eine spezifische Docking-Plattform für die Vielzahl von Proteinen, die eine spezifische subzelluläre Lokalisierung und / oder Aktivierung erfordern 6 ,</sup...

Unzählige Wechselwirkungen und biochemische Prozesse finden auf zweidimensional flüssigen Membranoberflächen statt. Membran-umschlossene Organellen in eukaryotischen Zellen sind nicht nur in biochemischen Prozessen und ihrem assoziierten Proteom, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung einzigartig. Eine außergewöhnliche Klasse von Phospholipiden ist Phosphoinositide (PIPs). Obwohl sie nur 1% des zellulären Lipidoms enthalten, spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion, Autophagie und Membranhandel unter anderem 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische Phosphorylierung der Inositol - Kopfgruppe durch zelluläre PIP - Kinasen führt zu sieben PIP - Kopfgruppen , die Mono-, Bis- oder Tris-phosphoryliert 5. Zusätzlich definieren PIPs die subzelluläre Identität von Membranen und dienen als spezialisierte Membran-Docking-Stellen für Proteine ​​/ Enzyme, die ein oder mehrere Phosphoinos enthaltenItide-bindende Domänen, z. B. Pleckstrin-Homologie (PH), Phox-Homologie (PX) und Epsin-N-terminale Homologie (ENTH) 6 , 7 . Eine der am besten untersuchten PIP-bindenden Domänen ist Phospholipase C (PLC) -δ1 PH-Domäne, die spezifisch mit Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2 ) innerhalb einer hohen Nanomolar-niedrigen Mikromolarbereich-Affinität 8 wechselwirkt , 9 , 10 , 11 Eine Vielzahl von qualitativen und quantitativen in vitro Methoden wurden entwickelt und verwendet, um den Mechanismus, die Thermodynamik und die Spezifität dieser Wechselwirkungen zu untersuchen. Zu den am häufigsten verwendeten PIP-Bindungsassays gehören die Oberflächenplasmonresonanz (SPR), die isotherme Kalorimetrie (ITC), die Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie, der Liposom-Flotations- / Sedimentationsassay und die Lipidblots (Fat-Blots / PIP-Streifen)12 , 13 Auch wenn diese weitgehend genutzt werden, haben sie alle viele Nachteile. Zum Beispiel benötigen SPR, ITC und NMR große Mengen an Probe, teure Instrumentierung und / oder geschultes Personal 12 , 13 . Einige Assayformate wie Antikörper-basierte Lipid-Blots verwenden wasserlösliche Formen von PIPs und präsentieren sie in einer nichtphysiologischen Weise 12 , 14 , 15 , 16 . Darüber hinaus können Lipid-Blots nicht zuverlässig quantifiziert werden und haben oft zu falsch-positiven / negativen Beobachtungen 12 , 17 , 18 geführt . Um diese Herausforderungen zu bewältigen und den aktuellen Werkzeugsatz zu verbessern, wurde eine neue, etikettfreie Methode auf Basis einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) im Rahmen von am<html> Mikrofluidische Plattform, die erfolgreich auf die Untersuchung von Protein-PIP-Wechselwirkungen angewendet wurde ( Abbildung 1 ) 19 . Die zur Detektion von Protein-PIP-Wechselwirkungen eingesetzte Strategie basiert auf der pH-Modulationssensorik. Hierbei handelt es sich um einen pH-empfindlichen Farbstoff, der ortho- Sulforhodamin B ( o SRB) direkt an die Phosphatidylethanolamin-Lipidkopfgruppe 20 konjugiert hat. Die o SRB-POPE-Sonde ( Fig. 2A ) ist bei niedrigem pH-Wert hoch fluoreszierend und bei hohem pH-Wert mit einem pKa um 6,7 innerhalb von 7,5 Mol-% PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs abgeschreckt ( Fig. 5B ). PLC-δ1-PH-Domäne wurde für die Validierung von Protein-PIP-Bindungsmethoden aufgrund ihrer hohen Spezifität gegenüber PI (4,5) P 2 ( Abbildung 5A ) 21 , 22 ,&quot;&gt; 23 , 24 , 25. Daher haben wir festgestellt, dass die PLC-δ1-PH-Domäne verwendet werden kann, um ihre Bindung an PI (4,5) P 2 durch den PIP-on-a-Chip-Assay zu testen. Das PH-Domänen-Konstrukt verwendet , das in dieser Studie eine positive Nettoladung (pI 8,4) hat, und so zieht OH -. Ionen (5C) auf zu PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs Bindung bringt die PH - Domäne , die OH - Ionen zu dem Membranoberfläche, die wiederum das Grenzflächenpotential moduliert und den Protonierungszustand von o SRB-POPE verschiebt ( Abbildung 5C ) 26. Als Funktion der PH-Domänenkonzentration wird die Fluoreszenz abgeschreckt ( Abbildung 6A ). Schließlich sind die normierten Daten Zu einer bindenden Isotherme passt, um die Affinität der PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion zu bestimmen ( Abbildung 6B , 6C )/ P&gt; In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um Proteinbindung an PIP-haltige SLBs innerhalb einer mikrofluidischen Plattform durchzuführen. Dieses Protokoll nimmt den Leser vom Zusammenbau der mikrofluidischen Vorrichtung und der Vesikelpräparation zur SLB-Bildung und Proteinbindung an. Zusätzlich werden Richtungen für die Datenanalyse zur Extraktion von Affinitätsinformationen für die PLC-δ1-PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion bereitgestellt.

<table><tbody><tr><td>Deckglas</td><td></td><td></td><td></td></tr>Glas <tr><td>Deckgläser: Rechtecke</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, Nr. 1 1/2; Borosilikatglas</td></tr><tr><td>7X Reinigungslösung</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>PYREX Kristallisationsschale</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Borosilikatglasschale mit flachem Boden; Durchmesser x Höhe (190 x 100 mm); Händler: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Kiln</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>><PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polydimethylsiloxan (PDMS); Vertrieb: Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>PYREX Exsikkator</td><td>VWR</td><td>89134-402</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumbewerteter Biopsiestempel</td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; 1,0 mm Durchmesser; Miltex Biopsie-Stanze mit Kolben (Kat. Nr. 15110-10) kann alternativ verwendet werden</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Gerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Reinigungssystem</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>2-stufige Öl-Vakuumpumpe mit Direktantrieb, O2-Service (Krytox aufgeladen)</td></tr><tr><td>Digitale Heizplatte</td><td>Benchmark</td><td>H3760-H</td><td>Erworben über Denville Scientific (Kat. Nr. 1005640)</td></tr><tr><td>Fixierte Mikro-Dias</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>mattiert, selektiert und vorgereinigt; Hergestellt aus Schweizer Glas; Dicke: 1 mm; Abmessungen: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Zeichensoftware für das Fotomaskendesign</td></tr><tr><td>Photomask</td><td>CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>Das Design mit schwarzem Hintergrund und klaren Merkmalen wurde mit einer Auflösung von 20k dpi auf eine transparente Maske (5 x 7 Zoll) gedruckt von CAD/Art Services</td></tr><tr><td>Silikonwafer</td><td>Universitätswafer</td><td>1575</td><td>Prime Grade, einseitig poliert; 100 mm (4 Zoll) Durchmesser; 525 μm Dicke</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Negativton-Fotolack; Penn State Nanofabrication Facility Grundstück</td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Property</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol-4-phosphat</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850757C</td><td>POPE; Erforderlich für die Synthese von oSRB-POPE</td></tr>, <tr><td>Lissamin, Rhodamin, B-Sulfonylchlorid (gemischte Isomere)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>Erforderlich für die Synthese von oSRB-POPE pH-empfindlicher</td></tr><tr><td>fluoreszierender Lipidsonde (oSRB-POPE)</td><td>Inhouse:</td><td>N/A</td><td>, Inhouse-Synthese (Huang, D. et al., 2013)</td></tr><tr><td>Glasszintillationsfläschchen</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>20 mL Volumenkapazität</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td> Ultraschall-Wasserbad-Nukleporen-Bahn-geätzte <td></td></tr><tr><td>Membranen</td><td>Whatman</td><td>110605</td><td>Polycarbonat-Membran; Durchmesser: 25 mm; Porengröße: 0,1 μm; Vertrieb: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Grade LIPEX Extruder</td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Thermobarrel</td></tr><tr><td>Extruder Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Dynamische Lichtstreuung; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v.6</td><td>Kurvenanpassungssoftware für die Datenanalyse</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>N/A</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>AxioCam MRm Kamera</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>N/A</td><td>Kamera</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Lichtquelle</td></tr><tr><td>Alexa 568 Filterset</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td><td>Carl Zeiss Mikroskopie</td><td>N/A</td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td> Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Andere</td>Spitzen VWR 10034-132 200 μL-Pipettenspitzen<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>; Dünne und glatte Spitze zum Auftragen der Proteinlösung in den mikrofluidischen Kanal</td></tr><tr><td>Tipps</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>10 μl Pipettenspitzen; Dünne und glatte Spitze zum Auftragen der Vesikellösung in den mikrofluidischen Kanal</td></tr><tr><td>Orion Star A321 pH-Messgerät</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA3210 pH-Messgerät</td><td></td></tr><tr><td>Orion Mikro-pH-Sonde</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>Mikro-pH-Sonde</td></tr><tr><td>N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazin-N'-(2-Ethansulfonsäure)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES, Freie Säure</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td><td>NaCl-Schläuche</td></tr><tr><td></td><td>Allied Wire & Kabel</td><td>TFT-200-24 N</td><td>Innendurchmesser: 0,020-0,026 Zoll (0,051-0,066 cm); Wandstärke: 0,025 cm (0,010 Zoll); Flexible dünnwandige Schläuche aus Polytetrafluorethylen; Natürliche Farbe</td></tr><tr><td>Stickstoff Gas - Industrie</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Lokaler Anbieter</td></tr><tr><td>Sauerstoff Gas - Industrie</td><td>Praxair</td><td>N /A</td><td>Lokaler Anbieter</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Lokaler Anbieter</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip: eine label-freie studie von protein-phosphoinositid-wechselwirkungen

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Zahlreiche zelluläre Proteine ​​wechselwirken mit Membranoberflächen, um essentielle zelluläre Prozesse zu beeinflussen. Diese Wechselwirkungen können auf eine spezifische Lipidkomponente innerhalb einer Membran gerichtet sein, wie im Fall von Phosphoinositiden (PIPs), um eine spezifische subzelluläre Lokalisation und / oder Aktivierung zu gewährleisten. PIPs und zelluläre PIP-bindende Domänen wurden intensiv untersucht, um ihre Rolle in der zellulären Physiologie besser zu verstehen. Wir haben einen pH-Modulationstest auf geträgerten Lipiddoppelschichten (SLBs) als ein Werkzeug zur Untersuchung von Protein-PIP-Wechselwirkungen angewendet. In diesen Studien wird pH-sensitives ortho- Sulforhodamin B-konjugiertes Phosphatidylethanolamin verwendet, um Protein-PIP-Wechselwirkungen zu detektieren. Nach der Bindung eines Proteins an eine PIP-haltige Membranoberfläche wird das Grenzflächenpotential moduliert ( dh Änderung des lokalen pH-Werts), wobei der Protonierungszustand der Sonde verschoben wird. Eine Fallstudie der erfolgreichen Verwendung des pH-Modulationstests wird unter Verwendung von Phospholipase C delta1 PleckstrIn der Homologie (PLC-δ1 PH) -Domäne und Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2 ) -Interaktion als Beispiel. Die scheinbare Dissoziationskonstante ( Kd, app ) für diese Wechselwirkung betrug 0,39 ± 0,05 μM, ähnlich Kd, app- Werte, die von anderen erhalten wurden. Wie bereits erwähnt, ist die PLC-δ1-PH-Domäne PI (4,5) P 2 spezifisch, zeigt eine schwächere Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat und keine Bindung an reine Phosphatidylcholin-SLBs. Der PIP-on-a-Chip-Assay ist gegenüber herkömmlichen PIP-Bindungsassays vorteilhaft, einschließlich, aber nicht beschränkt auf niedrige Probenvolumina und keine Ligand / Rezeptor-Markierungsanforderungen, die Fähigkeit, hoch- und niederaffine Membran-Wechselwirkungen sowohl mit kleinen als auch mit testen zu testen Große Moleküle und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis. Dementsprechend wird die Verwendung des PIP-on-a-Chip-Ansatzes die Aufklärung von Mechanismen einer breiten Palette von Membranwechselwirkungen erleichtern. Darüber hinaus könnte diese Methode möglicherweise u seinSed bei der Identifizierung von Therapeutika, die die Fähigkeit des Proteins modulieren, mit Membranen zu interagieren.

Wir verwendeten den pH-Modulationstest, um die PLC-δ1 PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion innerhalb eines PIP-on-a-Chip-Mikrodevals zu untersuchen ( Abbildung 1 ). Durch ein detailliertes Protokoll haben wir gezeigt, wie man mikrofluidische Gerätekomponenten vorbereitet und zusammensetzt, kleine unilamellare Vesikel (SUVs) bildet ( Abbildung 2 ), SLBs innerhalb einer Vorrichtung bilden ( Abbildung...

Hier präsentieren wir eine unterstützte Lipiddoppelschicht im Rahmen einer mikrofluidischen Plattform zur Untersuchung von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen unter Verwendung eines etikettfreien Verfahrens auf Basis der pH-Modulation.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Das übergeordnete Ziel des PIP-on-a-Chip-Assays ist es, Proteinmembraninteraktionen auf quantitative markierungsfreie Weise zu bewerten. Proteinmembran-Wechselwirkungen sind das Herzstück so vieler Prozesse der Zelle und ihrer Krankheitserreger, aber es gibt nur wenige Techniken, um diese Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Vorteile dieser Technik sind ein geringes einfaches Volumen, keine Anforderungen an die Liganden- oder Rezeptormarkierung in Kombination mit der Möglichkeit, Membraninteraktionen auf physiologisch relevante Weise zu testen.Viele therapeutische Ziele von Viren sind Membranproteine, Studien dieser Zielproteine werden oft in Lösung mit Detergenzien durchgeführt. Unsere Technik bietet eine biologisch relevantere Alternative. Sie werden zwar sehen, dass dieser Assay in der Lage ist, die Wechselwirkungen von Proteinen mit Membranen zu überwachen, aber er ist eigentlich ein recht vielseitiger Assay und kann zur Überwachung von Eisenmembran-, Kleinmolekülmembran- und sogar Peptidmembraninteraktionen verwendet werden.Mischen Sie zunächst das Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Prepolymer und das Härter im Verhältnis 10:1 in einer großen Kunststoffwaage. Entgasen Sie das Gemisch eine Stunde lang im Vakuum mit einer Vakuumstärke von 500 Tor oder weniger. Legen Sie den Silizium-Master, der mehrere Repliken desselben SU8-Mikromusters enthält, in eine große Kunststoffwaage, gießen Sie das Entgasungs-PDMS hinein und härten Sie es dann über Nacht in einem trockenen Ofen bei 60 Grad Celsius aus.Ziehen Sie am nächsten Tag das PDMS vorsichtig mit den Händen vom Siliziummaster ab. Markieren Sie die Grenzen jedes Mikromusters in Rechtecken mit einem chirurgischen Skalpell und einem Lineal. Schneiden Sie dann das PDMS in Blöcke, stanzen Sie mit einem Biopsiestanzer 16 Löcher an beiden Enden jedes Mikrokanals, um Löcher mit einem Durchmesser von 1,0 Millimetern zu bohren.Pipettieren Sie die berechneten Volumina von Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat und pH-empfindlicher Fluoreszenzsonde in ein einzelnes 20-Milliliter-Belüftungsfläschchen aus Glas. Trocknen Sie das Gemisch 10 Minuten lang in einem Stickstoffgasstrom in der chemischen Abzugshaube oder bis das Lösungsmittel verdampft ist und sich der dünne Lipidfilm am Boden des Fläschchens bildet. Anschließend wird die Mischung mindestens drei Stunden lang unter Vakuum bei einer Vakuumstärke von 10 Millitor getrocknet, um alle organischen Lösungsmittelreste zu entfernen.Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit fünf Millilitern Laufpuffer, legen Sie das rehydrierte Lipid für 30 Minuten bei Raumtemperatur in ein Ultraschallbad bei einer Betriebsfrequenz von 35 Kilohertz. Die Vesikelsuspension mit flüssigem Stickstoff und dem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad einfrieren, auftauen, um unilaminare Vesikel zu erhalten. Wiederholen Sie das Auftauen des Einfrierens 10 Mal, extrudieren Sie die Vesikelsuspension zu einer 0,1-Mikron-Polycarbonatmembran an der Spurkante und verwenden Sie einen Lipidextruder, um kleine unilaminare Vesikel anzureichern.Wiederholen Sie die Extrusion 10 Mal. Testen Sie die Ein- und Auslässe des PDMS-Blocks auf Verstopfung, indem Sie entionisiertes Wasser mit einer Wasserwaschflasche durch die Löcher spritzen, und trocknen Sie dann den PDMS-Block mit Stickstoffgas. Legen Sie anschließend den PDMS-Block und den vorgereinigten Deckschirm in die Probenkammer des Sauerstoffplasmasystems.Belichten Sie den PDMS-Block und den Deckglas 45 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma mit den Leistungsstufen auf 75 Watt, der Sauerstoffströmungsgeschwindigkeit auf 10 Kubikzentimeter pro Minute und der Vakuumstärke von 200 Millitor. Legen Sie anschließend die Musteroberfläche des PDMS-Blocks unmittelbar nach der Sauerstoffplasmabehandlung in den Kontakt mit dem Deckglas. Leicht drücken, um Luftblasen an den Kontaktstellen zu entfernen.Stellen Sie das Gerät drei Minuten lang auf eine ebene Heizplatte bei 100 Grad Celsius, um die Verklebung zu verbessern. Verwenden Sie ein nasses, fusselfreies Tuch mit 100 % Ethanol, um Staubpartikel von der Ober- und Unterseite des Geräts zu entfernen. Kleben Sie dann das Gerät auf einen Glasobjektträger.Übertragen Sie 100 Mikroliter des Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat, das kleine unilaminare Vesikel enthält, in ein 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf etwa 3/2 ein, indem Sie 6,4 Mikroliter 0,2 normale Salzsäure hinzufügen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der pH-eingestellten kleinen unilaminaren Vesikellösung durch den Einlass in jeden Kanal und üben Sie mit der Pipette Druck aus, bis die Lösung den Auslass erreicht.Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie am Gerät befestigt. Nachdem Sie diesen Schritt für jeden Kanal wiederholt haben, inkubieren Sie das Gerät 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, die Injektion von Vesikeln in Mikrokanäle sollte unmittelbar nach dem Zusammenbau des Geräts erfolgen. Schneiden Sie in der Zwischenzeit mit einer Pinzette Sätze von Einlass- und Auslassschläuchen ab, verbinden Sie den Auslassschlauchsatz mit dem Gerät und kleben Sie das Gerät dann auf einen Mikroskoptisch.Tauchen Sie ein Ende des Einlassschlauchs in 25 Milliliter Laufpuffer, der in einem konischen Schlauch enthalten ist, und kleben Sie ihn mit Klebeband ab, um sicherzustellen, dass der Schlauch gesichert ist. Platzieren Sie das konische Röhrchen mit einem Laborheber auf einem höheren Boden als das Gerät, um die Lösung durch die Schwerkraft durch die Mikrokanäle zu drücken. Verwenden Sie für jeden Einlassschlauch eine Spritze, um einen Milliliter Laufpuffer aus dem freien Ende des Schlauchs zu ziehen.Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Einlass und führen Sie das freie Ende des Einlaufschlauchs in das Gerät ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle Einlassschlauchstücke mit dem Gerät zu verbinden. Fließender Laufpuffer durch die Kanäle hilft, überschüssige, nicht gerissene Vesikel zu entfernen und die Doppelschicht auf experimentelle Bedingungen auszugleichen.Öffnen Sie anschließend die Mikroskopsteuerungssoftware. Klicken Sie im linken Bereich auf die Registerkarte Mikroskop und wählen Sie das 10-fach-Objektiv aus. Klicken Sie auf Live und dann auf die Alexa 568-Bildsymbole in der Symbolleiste, indem Sie mit den Fein- und Grobeinstellknöpfen auf die Mikrokanäle fokussieren.Scannen Sie das Gerät, um die Qualität der SLBs und der Kanäle zu überprüfen. Klicken Sie dann in der Symbolleiste auf das Symbol für das geschlossene Bild des FL-Verschlusses, klicken Sie auf die Registerkarte Aufnahme und wählen Sie unter Grundeinstellungen die Option Belichtungszeit aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 200 Millisekunden ein.Klicken Sie im linken Bereich auf mehrdimensionale Erfassung. Wählen Sie im Filtermenü den roten Kanal aus. Klicken Sie dann auf das Zeitraffermenü, stellen Sie das Zeitintervall auf fünf Minuten, die Dauer auf 30 Minuten und das Zeitraffermenü ein.Wählen Sie das Kreiswerkzeug auf der Registerkarte "Messen" aus und zeichnen Sie einen Kreis in einem beliebigen Kanal. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während der Kreis ausgewählt ist, und wählen Sie Eigenschaften. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Profil" alle T-Werte, um die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit anzuzeigen.Stellen Sie sicher, dass diese Kurve ein Plateau erreicht, das ein Gleichgewicht anzeigt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, und senken Sie die Pufferlösung auf den gleichen Boden wie das Gerät, um den Fluss zu stoppen. Lösen Sie nacheinander jeden Auslassschlauch und geben Sie mit einer Pipette 200 Mikroliter jeder Proteinverdünnung in den Auslasskanal. Üben Sie keinen Druck aus, lassen Sie die Schwerkraft die Arbeit machen.Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie an der mikrofluidischen Vorrichtung befestigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Kanal und stellen Sie sicher, dass während dieses Vorgangs keine Luftblasen in die Kanäle gelangen. Senken Sie als Nächstes den Einlassschlauch auf einen Boden unterhalb des mikrofluidischen Geräts ab, um das Protein durch die Mikrokanäle fließen zu lassen.Klebe das freie Ende des Schlauchs an einen Abfallbehälter. Lassen Sie die Verdünnungen der Pleckstrin Homologiedomäne 30 Minuten lang fließen. Klicken Sie im linken Bereich der Software auf der Registerkarte Zeitraffer auf Start, um das Imaging erneut zu starten.Hier ist eine repräsentative Ansicht des Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat enthaltenden SLBs in Mikrokanälen. Vor und nach dem Hinzufügen der Pleckstrin-Homologiedomäne bei den angegebenen Konzentrationen. Die Fluoreszenzintensitäten der Linie, die über Mikrokanäle abgetastet wurde, werden als Funktion der Entfernung und der Pixel für Phosphatidylcholin-, Phosphatidylinositol-4-Phosphat- und Phosphatidylinositol-4-5-Bisphosphat-Bindungsexperimente aufgetragen.Dann normalisieren Sie die Bindungsdaten aus einzelnen Experimenten, die als Funktion der Konzentration der Phospholipase C delta 1 Pleckstrin Homologiedomäne aufgetragen und an einen Bindungsisoterm angepasst werden, um scheinbare Assoziationskonstanten zu extrahieren. Der Vergleich der scheinbaren Assoziationskonstanten zeigt, dass die Phospholipase C Delta 1 Pleckstrin Homologiedomäne wie erwartet spezifisch mit Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat interagiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kleine unilaminare Vesikel herstellen, mikrofluidische Geräte herstellen und gestützte Lipiddoppelschichten in diesen mikrofluidischen Geräten als Ihre Proteinmembranbindungsinteraktionen bilden, indem Sie diesen Assay mit unserem PIP-on-a-Chip-Ansatz verwenden.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen durchgeführt werden, um den Einfluss der Proteinmembranbindung auf die laterale Diffusion der Lipide zu beurteilen. Diese Technik ebnet den Weg für die Untersuchung von Proteinmembran-Wechselwirkungen mit der Zusammensetzung von Lipiden, die in Zellen vorkommen, anstatt einzeln, und wird daher die Biochemie und Zellbiologie von Proteinmembran-Wechselwirkungen umfassend beeinflussen.

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Research

Forschung

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Biotechnik

In diesem Video demonstrieren wir Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen in einem mikrofluidischen Muster unter Verwendung des pH-Modulationsassays unter Verwendung eines pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der an das Phosphatidylethanolamin-Lipid einer unterstützten Lipiddoppelschicht, einer sogenannten mikrofluidischen Plattform, gebunden ist. Die Modulation des pH-Werts nach der Proteinbindung an Phospholipid führt zu einer Fluoreszenzlöschung.

pH-Modulationsassay an gestützten Lipiddoppelschichten zum Nachweis von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Hier das Protokoll beschreibt die Wechselwirkungen von gereinigten hEAG1 Ionen-Kanal-Protein mit niedermolekularer Lipid Liganden Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP-2). Die Messung zeigt, dass BLI eine mögliche Methode für neue kleine Molekül-Ion Channel Liganden Screening werden könnte.

Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.

Fluoreszenzbasierte Messungen des Phosphatidylserin/Phosphatidylinositol-4-Phosphat-Austauschs zwischen Membranen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung von endogenen Phosphoproteinphosphatasen und ihren interagierenden Proteinen aus Zellen und Geweben und deren Identifizierung und Quantifizierung durch massenspektrometriebasierte Proteomik vor.

Ein massenspektrometriebasierter Ansatz zur Identifizierung von Phosphoproteinphosphatasen und ihren Interaktoren

Wir stellen eine kostengünstige Methode zur Beurteilung der liposomalen Membranpermeabilität vor, die im Vergleich zu herkömmlichen Techniken eine überlegene Sensitivität und Auflösung aufweist. Unter Verwendung einer neuartigen verkapselten Ligandensubstitutionsreaktion werden mit dieser Technik Phospholipase A2-induzierte Veränderungen in Modellmembranen nachgewiesen. Dieser leicht in Standardanalysen integrierbare Ansatz verbessert die Auflösung für die Untersuchung der Membranbiophysik und...

Ein Liposomenmembran-Permeabilitätsassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Phosphatidylinositolphosphatgruppen auf die membranotrope Wirkung des Giftes PLA2

Ein neuartiger Ansatz, dass die hochauflösende Analyse von Krebs Zell-Interaktionen ermöglicht mit exogenen Hyaluronsäure (HA) beschrieben wird. Gemusterten Oberflächen werden durch die Kombination Carbodiimid Chemie und Mikrokontaktdrucken hergestellt.

Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Lernen Sie die PIP-on-a-Chip-Technik zur quantitativen, label-freien Analyse von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen auf mikrofluidischen Plattformen. Diese Methode ermöglicht physiologisch relevante Studien membranständiger Proteine.

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

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