PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel des PIP-on-a-Chip-Assays ist es, Proteinmembraninteraktionen auf quantitative markierungsfreie Weise zu bewerten. Proteinmembran-Wechselwirkungen sind das Herzstück so vieler Prozesse der Zelle und ihrer Krankheitserreger, aber es gibt nur wenige Techniken, um diese Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Vorteile dieser Technik sind ein geringes einfaches Volumen, keine Anforderungen an die Liganden- oder Rezeptormarkierung in Kombination mit der Möglichkeit, Membraninteraktionen auf physiologisch relevante Weise zu testen.

Viele therapeutische Ziele von Viren sind Membranproteine, Studien dieser Zielproteine werden oft in Lösung mit Detergenzien durchgeführt. Unsere Technik bietet eine biologisch relevantere Alternative. Sie werden zwar sehen, dass dieser Assay in der Lage ist, die Wechselwirkungen von Proteinen mit Membranen zu überwachen, aber er ist eigentlich ein recht vielseitiger Assay und kann zur Überwachung von Eisenmembran-, Kleinmolekülmembran- und sogar Peptidmembraninteraktionen verwendet werden.

Mischen Sie zunächst das Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Prepolymer und das Härter im Verhältnis 10:1 in einer großen Kunststoffwaage. Entgasen Sie das Gemisch eine Stunde lang im Vakuum mit einer Vakuumstärke von 500 Tor oder weniger. Legen Sie den Silizium-Master, der mehrere Repliken desselben SU8-Mikromusters enthält, in eine große Kunststoffwaage, gießen Sie das Entgasungs-PDMS hinein und härten Sie es dann über Nacht in einem trockenen Ofen bei 60 Grad Celsius aus.

Ziehen Sie am nächsten Tag das PDMS vorsichtig mit den Händen vom Siliziummaster ab. Markieren Sie die Grenzen jedes Mikromusters in Rechtecken mit einem chirurgischen Skalpell und einem Lineal. Schneiden Sie dann das PDMS in Blöcke, stanzen Sie mit einem Biopsiestanzer 16 Löcher an beiden Enden jedes Mikrokanals, um Löcher mit einem Durchmesser von 1,0 Millimetern zu bohren.

Pipettieren Sie die berechneten Volumina von Phosphatidylcholin, Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat und pH-empfindlicher Fluoreszenzsonde in ein einzelnes 20-Milliliter-Belüftungsfläschchen aus Glas. Trocknen Sie das Gemisch 10 Minuten lang in einem Stickstoffgasstrom in der chemischen Abzugshaube oder bis das Lösungsmittel verdampft ist und sich der dünne Lipidfilm am Boden des Fläschchens bildet. Anschließend wird die Mischung mindestens drei Stunden lang unter Vakuum bei einer Vakuumstärke von 10 Millitor getrocknet, um alle organischen Lösungsmittelreste zu entfernen.

Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit fünf Millilitern Laufpuffer, legen Sie das rehydrierte Lipid für 30 Minuten bei Raumtemperatur in ein Ultraschallbad bei einer Betriebsfrequenz von 35 Kilohertz. Die Vesikelsuspension mit flüssigem Stickstoff und dem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad einfrieren, auftauen, um unilaminare Vesikel zu erhalten. Wiederholen Sie das Auftauen des Einfrierens 10 Mal, extrudieren Sie die Vesikelsuspension zu einer 0,1-Mikron-Polycarbonatmembran an der Spurkante und verwenden Sie einen Lipidextruder, um kleine unilaminare Vesikel anzureichern.

Wiederholen Sie die Extrusion 10 Mal. Testen Sie die Ein- und Auslässe des PDMS-Blocks auf Verstopfung, indem Sie entionisiertes Wasser mit einer Wasserwaschflasche durch die Löcher spritzen, und trocknen Sie dann den PDMS-Block mit Stickstoffgas. Legen Sie anschließend den PDMS-Block und den vorgereinigten Deckschirm in die Probenkammer des Sauerstoffplasmasystems.

Belichten Sie den PDMS-Block und den Deckglas 45 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma mit den Leistungsstufen auf 75 Watt, der Sauerstoffströmungsgeschwindigkeit auf 10 Kubikzentimeter pro Minute und der Vakuumstärke von 200 Millitor. Legen Sie anschließend die Musteroberfläche des PDMS-Blocks unmittelbar nach der Sauerstoffplasmabehandlung in den Kontakt mit dem Deckglas. Leicht drücken, um Luftblasen an den Kontaktstellen zu entfernen.

Stellen Sie das Gerät drei Minuten lang auf eine ebene Heizplatte bei 100 Grad Celsius, um die Verklebung zu verbessern. Verwenden Sie ein nasses, fusselfreies Tuch mit 100 % Ethanol, um Staubpartikel von der Ober- und Unterseite des Geräts zu entfernen. Kleben Sie dann das Gerät auf einen Glasobjektträger.

Übertragen Sie 100 Mikroliter des Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat, das kleine unilaminare Vesikel enthält, in ein 0,65-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf etwa 3/2 ein, indem Sie 6,4 Mikroliter 0,2 normale Salzsäure hinzufügen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der pH-eingestellten kleinen unilaminaren Vesikellösung durch den Einlass in jeden Kanal und üben Sie mit der Pipette Druck aus, bis die Lösung den Auslass erreicht.

Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie am Gerät befestigt. Nachdem Sie diesen Schritt für jeden Kanal wiederholt haben, inkubieren Sie das Gerät 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, die Injektion von Vesikeln in Mikrokanäle sollte unmittelbar nach dem Zusammenbau des Geräts erfolgen. Schneiden Sie in der Zwischenzeit mit einer Pinzette Sätze von Einlass- und Auslassschläuchen ab, verbinden Sie den Auslassschlauchsatz mit dem Gerät und kleben Sie das Gerät dann auf einen Mikroskoptisch.

Tauchen Sie ein Ende des Einlassschlauchs in 25 Milliliter Laufpuffer, der in einem konischen Schlauch enthalten ist, und kleben Sie ihn mit Klebeband ab, um sicherzustellen, dass der Schlauch gesichert ist. Platzieren Sie das konische Röhrchen mit einem Laborheber auf einem höheren Boden als das Gerät, um die Lösung durch die Schwerkraft durch die Mikrokanäle zu drücken. Verwenden Sie für jeden Einlassschlauch eine Spritze, um einen Milliliter Laufpuffer aus dem freien Ende des Schlauchs zu ziehen.

Entfernen Sie die Pipettenspitze aus dem Einlass und führen Sie das freie Ende des Einlaufschlauchs in das Gerät ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle Einlassschlauchstücke mit dem Gerät zu verbinden. Fließender Laufpuffer durch die Kanäle hilft, überschüssige, nicht gerissene Vesikel zu entfernen und die Doppelschicht auf experimentelle Bedingungen auszugleichen.

Öffnen Sie anschließend die Mikroskopsteuerungssoftware. Klicken Sie im linken Bereich auf die Registerkarte Mikroskop und wählen Sie das 10-fach-Objektiv aus. Klicken Sie auf Live und dann auf die Alexa 568-Bildsymbole in der Symbolleiste, indem Sie mit den Fein- und Grobeinstellknöpfen auf die Mikrokanäle fokussieren.

Scannen Sie das Gerät, um die Qualität der SLBs und der Kanäle zu überprüfen. Klicken Sie dann in der Symbolleiste auf das Symbol für das geschlossene Bild des FL-Verschlusses, klicken Sie auf die Registerkarte Aufnahme und wählen Sie unter Grundeinstellungen die Option Belichtungszeit aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 200 Millisekunden ein.

Klicken Sie im linken Bereich auf mehrdimensionale Erfassung. Wählen Sie im Filtermenü den roten Kanal aus. Klicken Sie dann auf das Zeitraffermenü, stellen Sie das Zeitintervall auf fünf Minuten, die Dauer auf 30 Minuten und das Zeitraffermenü ein.

Wählen Sie das Kreiswerkzeug auf der Registerkarte "Messen" aus und zeichnen Sie einen Kreis in einem beliebigen Kanal. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, während der Kreis ausgewählt ist, und wählen Sie Eigenschaften. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Profil" alle T-Werte, um die Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit anzuzeigen.

Stellen Sie sicher, dass diese Kurve ein Plateau erreicht, das ein Gleichgewicht anzeigt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, und senken Sie die Pufferlösung auf den gleichen Boden wie das Gerät, um den Fluss zu stoppen. Lösen Sie nacheinander jeden Auslassschlauch und geben Sie mit einer Pipette 200 Mikroliter jeder Proteinverdünnung in den Auslasskanal. Üben Sie keinen Druck aus, lassen Sie die Schwerkraft die Arbeit machen.

Lösen Sie die Spitze von der Pipette und lassen Sie sie an der mikrofluidischen Vorrichtung befestigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Kanal und stellen Sie sicher, dass während dieses Vorgangs keine Luftblasen in die Kanäle gelangen. Senken Sie als Nächstes den Einlassschlauch auf einen Boden unterhalb des mikrofluidischen Geräts ab, um das Protein durch die Mikrokanäle fließen zu lassen.

Klebe das freie Ende des Schlauchs an einen Abfallbehälter. Lassen Sie die Verdünnungen der Pleckstrin Homologiedomäne 30 Minuten lang fließen. Klicken Sie im linken Bereich der Software auf der Registerkarte Zeitraffer auf Start, um das Imaging erneut zu starten.

Hier ist eine repräsentative Ansicht des Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat enthaltenden SLBs in Mikrokanälen. Vor und nach dem Hinzufügen der Pleckstrin-Homologiedomäne bei den angegebenen Konzentrationen. Die Fluoreszenzintensitäten der Linie, die über Mikrokanäle abgetastet wurde, werden als Funktion der Entfernung und der Pixel für Phosphatidylcholin-, Phosphatidylinositol-4-Phosphat- und Phosphatidylinositol-4-5-Bisphosphat-Bindungsexperimente aufgetragen.

Dann normalisieren Sie die Bindungsdaten aus einzelnen Experimenten, die als Funktion der Konzentration der Phospholipase C delta 1 Pleckstrin Homologiedomäne aufgetragen und an einen Bindungsisoterm angepasst werden, um scheinbare Assoziationskonstanten zu extrahieren. Der Vergleich der scheinbaren Assoziationskonstanten zeigt, dass die Phospholipase C Delta 1 Pleckstrin Homologiedomäne wie erwartet spezifisch mit Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphat interagiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kleine unilaminare Vesikel herstellen, mikrofluidische Geräte herstellen und gestützte Lipiddoppelschichten in diesen mikrofluidischen Geräten als Ihre Proteinmembranbindungsinteraktionen bilden, indem Sie diesen Assay mit unserem PIP-on-a-Chip-Ansatz verwenden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen durchgeführt werden, um den Einfluss der Proteinmembranbindung auf die laterale Diffusion der Lipide zu beurteilen. Diese Technik ebnet den Weg für die Untersuchung von Proteinmembran-Wechselwirkungen mit der Zusammensetzung von Lipiden, die in Zellen vorkommen, anstatt einzeln, und wird daher die Biochemie und Zellbiologie von Proteinmembran-Wechselwirkungen umfassend beeinflussen.