Das vorliegende Verfahren dient der Isoform-spezifische Inhibitoren der Histon Deacetylases (HDAC) in HeLa-Zellen durch die UHPLC-MS-Analyse von mehreren Substraten zu identifizieren. Dies ist ein Antikörper-freie Methode entwickelt, um HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit im Wohnzimmer wiedergeben Zelle Umgebung, im Gegensatz zu Single-Isoform zellfreie Assays.
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Methodenartikel
Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Suche nach neuen Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitoren ist zunehmend an Bedeutung in der Wirkstoffforschung. Isoform Selektivität ist die Genehmigung des Romidepsin, eine Klasse im Rampenlicht seit ich HDAC Inhibitor für Krebstherapie und die klinische Untersuchung der HDAC6-spezifische Hemmstoffe für Multiples Myelom. Das vorliegende Verfahren dient die inhibitorische Aktivität der Testverbindungen für HDAC1 und HDAC6 in den Zellen zu bestimmen. Die Isoform Aktivität wird anhand die ultra-high-Performance liquide Chromatography-Massenspektrometrie (UHPLC-MS) Analyse der spezifischen Substraten mit behandelten und unbehandelten HeLa-Zellen inkubiert. Die Methode hat den Vorteil der Reflexion der endogenen HDAC-Aktivität innerhalb der Umgebung der Zelle, im Gegensatz zur zellfreien biochemischen Assays auf isolierte Isoformen durchgeführt. Darüber hinaus da es auf die Quantifizierung der synthetische Substrate basiert, erfordert die Methode nicht die Antikörper Anerkennung der endogenen Schimmelpilzschäden Proteine. Es ist leicht anpassbar an verschiedene Zelllinien und einen automatisierten Prozess. Die Methode hat sich bereits bei der Suche nach HDAC6-selektive Verbindungen in Neuroblasten bewährt. Repräsentative Ergebnisse werden hier gezeigt, mit dem standard HDAC-Inhibitoren Trichostatin ein (unspezifisch), MS275 (HDAC1-spezifisch) und Tubastatin (HDAC6-spezifisch) mit HeLa-Zellen.
Einleitung
HDACs gehören zu einer Familie von Enzymen in der Lage, die Histone innerhalb der Chromatinstruktur deacetylate. Sie haben andere Protein-Substrate in der Zellflüssigkeit und befinden sich in verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Insgesamt 18 HDAC-Isoformen wurden bisher identifiziert und haben wurde im Zusammenhang mit mehreren Zellmechanismen, einschließlich der Regulierung von Transkriptionsfaktoren und Genexpression sowie Zelle signalisieren und1,2,3,4,5,6,
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Protokoll
(1) Zellkultur
Hinweis: Die folgenden Schritte sind in einem standard Gewebekultur Abzug durchgeführt. Vertrautheit mit steriler Technik wird erwartet.
- Kultur von HeLa-Zellen zu 80 % Konfluenz in einem T75 Zelle Kultur Kolben in MEM ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin G (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/mL).
Hinweis: Zelle Kultur, Behandlung und Lyse Schritte erfolgen unter Laminar-Flow mit Zelle Inkubation bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre des 5 % CO2 unter sterilen Bedingungen durchgeführt. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 mL des DPBS, aspirieren Sie des DPBS und fügen Sie 1 mL de....
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Ergebnisse
Die Anwendung der Methode zur Identifizierung von nicht-selektiven und selektiver Inhibitoren für HDAC1 nachweisen (Klasse I) und HDAC6 (Klasse IIb), HeLa-Zellen wurden mit bekannten standard-Compounds behandelt: Trichostatin A (nicht-selektiven zwischen HDAC1 und HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selektiver Hemmstoff)19und Tubastatin (HDAC6-selektiver Hemmstoff)20. Mithilfe der vorliegenden Methode (Abbildu.......
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Diskussion
HDAC-Hemmung ist ein heißes Thema in der Drogeentdeckung, mit dem aktuellen Fokus auf HDAC6-selektive Inhibitoren für Krebs-Therapie-21. HDAC Selektivität bemisst sich in der Regel durch eine Reihe von hohem Durchsatz, zellfreie Assays, die beabsichtigen, die inhibitorische Potenz gegenüber einzelnen HDAC Isoformen21bestimmen. Jedoch die Selektivität der Inhibitor muss zusätzlich bestätigt werden in lebenden Zellen durch die Auswertung des Acetylierung Status des endogenen .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren erkennen COST Action CM1406 (epigenetische chemische Biologie). Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der Stiftung Pierre Mercier unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-AC-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitril, HPLC-Qualität | Fisher | Scientific 10660131 | |
| Ameisensäure, LC/MS-Qualität | Fisher | Scientific 10596814 | |
| H2O, HPLC-Qualität | destilliertes H2O, filtriert durch ein Milli-Q-Aufreinigungssystem HeLa-Zellen | ||
| ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | ||
| Zelldissoziation Reagenz TrypLE | Express ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, Zellkulturqualität | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fötales Rinderserum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA Puffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast Proteaseinhibitor Tabletten | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-Well-Platten, steril, flacher Boden, Gewebekultur behandelt Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-Well-Platten, unsteril, V-Boden Corning | VWR | 29442-404 | zur Verwendung im Zentrifugationsschritt |
| 96-Well-Platte, konischer Boden, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | kompatibel mit dem Acquity UHPLC-System |
| T75 Zellkulturkolben Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Schälbare Heißsiegelfolie | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC System | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integrationssoftware: MassLynx V4.1 | Waters | Katalognummer nicht verfügbar | |
| Kombi-Heißsiegelgerät SP-0669/240 | Waters | Katalognummer nicht verfügbar | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Katalognummer nicht verfügbar |
Referenzen
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
