Methodenartikel

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit

11K Ansichten

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DOI:

10.3791/55886

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25. Juli 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zusammenfassung

In utero Elektroporation ist eine schnelle und leistungsstarke Ansatz, um den Prozess der radialen Migration in der Hirnrinde der Entwicklung von Maus Embryonen zu studieren. Es hat dazu beigetragen, die verschiedenen Schritte der radialen Migration zu beschreiben und die molekularen Mechanismen zu charakterisieren, die diesen Prozess kontrollieren. Um die Migrationsneuronen direkt und dynamisch zu analysieren, müssen sie im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der in der utero- Elektroporation mit organotypischer Schichtkultur und zeitraffer konfokaler Bildgebung kombiniert, die eine direkte Untersuchung und dynamische Analyse von radial wandernden kortikalen Neuronen ermöglicht. Darüber hinaus ist eine detaillierte Charakterisierung von Migrationsneuronen wie Migrationsgeschwindigkeit, Geschwindigkeitsprofilen sowie radiale Orientierungsänderungen möglich. Die Methode kann leicht angepasst werden, um funktionelle Analysen von Genen von Interesse bei der radialen Migration von kortikalen Neuronen durch Verlust und Gewinn der Funktion sowie Rettungsexperimente durchzuführen. ZeitrafferDie Bildgebung von Migrationsneuronen ist eine hochmoderne Technik, die einstmals ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Entwicklung der Hirnrinde bei Mausmodellen von neuronalen Migrationsstörungen ist.

Einleitung

Der Neocortex ist der Hauptort der kognitiven, emotionalen und sensomotorischen Funktionen. Es besteht aus sechs horizontalen Schichten, die parallel zur Oberfläche des Gehirns ausgerichtet sind. Während der Entwicklung führen die Vorläuferzellen in der lateralen Wand des dorsalen Telencephalons zu Projektion Neuronen, die radial in Richtung der Pial Oberfläche wandern und erwerben eine Schicht Typ-spezifische neuronale Identität. Nachdem sie in den ventrikulären / subventrikulären Zonen (VZ / SVZ) erzeugt wurden, werden diese Neuronen vorübergehend multipolar und verlangsamen ihre Migration. Nach einem kurzen Aufenthalt in der Zwischenzone (IZ) wechseln sie zu einer bipolaren Morphologie, befestigen sie an dem radialen Gliagerüst und setzen eine radial orientierte Migration in die Kortikalplatte (CP) fort. Bei Erreichen ihrer endgültigen Zielprojektion lösen sich Neuronen von den radialen Gliaprozessen und erwerben schichtspezifische Identität. Mutationen in Genen, die verschiedene Schritte der neuronalen Migration beeinflussen, können zu schweren kortikalen Fehlbildungen führen, wie zB lissencEphalie oder weiße Substanz Heterotopie 1 , 2 .

In utero Elektroporation ist eine schnelle und leistungsstarke Technik, um neuronale Vorläuferzellen in das sich entwickelnde Gehirn der Nagetierembryonen 3 , 4 zu transfizieren. Mit dieser Technik ist es möglich, Gene zu knüpfen und / oder zu überexprimieren, um ihre Funktionen bei der Entwicklung von Neuronen zu untersuchen. Diese Methode hat gezielt dazu beigetragen, die morphologischen Details zu beschreiben und die molekularen Mechanismen des Prozesses der radialen Migration zu charakterisieren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radial wandernde Neuronen unterliegen dynamischen Veränderungen in der Zellform, Migrationsgeschwindigkeit und Migrationsrichtung, die eine direkte und kontinuierliche Beobachtung über die Zeit erfordern. Organotypische ScheibenkulturRe und zeitraffer konfokale bildgebung von elektroporierten Gehirnen erlauben es, die migrierenden Neuronen im Laufe der Zeit direkt zu beobachten. Mit diesem kombinierten Ansatz ist es möglich, verschiedene Merkmale von migrierenden Neuronen zu analysieren, die nicht in festen Gewebeabschnitten von elektroporierten Gehirnen untersucht werden können.

Wir wendeten kürzlich Zeitraffer konfokale Bildgebung von Neuronen in Kulturen von slice elektroporiert Gehirnen wandernde die Rolle des Transkriptionsfaktors B - Zell CLL / Lymphom 11a (BCL11A) während des kortikalen Entwicklung 10 zu studieren. Bcl11a wird in jungen, migrierenden kortikalen Neuronen ausgedrückt und wir verwendeten ein bedingtes mutiertes Bcl11a- Allel ( Bcl11a flox ) 11 , um seine Funktionen zu studieren. Die Elektroporation von Cre-Rekombinase zusammen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) in kortikale Progenitoren von Bcl11a- Flox- / Flox- Gehirnen ermöglichte es uns, eine Mosaikmutanten-Situation zu schaffen, in der nur wenige Zellen in einem mutiert sindSonst Wildtyp Hintergrund. Auf diese Weise war es möglich, zell-autonome Funktionen von Bcl11a auf Einzelzellenebene zu untersuchen. Wir fanden, dass Bcl11a- Mutanten-Neuronen reduzierte Geschwindigkeit, Verschiebungen in ihren Geschwindigkeitsprofilen sowie zufällige Orientierungsänderungen während ihrer Migration zeigen 10 . In dem skizzierten Protokoll beschreiben wir einen Workflow für eine erfolgreiche Elektroporation und Slice-Kultur-Präparation 12 von Maus-Gehirnen sowie eine zeitliche Konfokale Bildgebung von kortikalen Scheibenkulturen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tierschutzausschuss (Regierungspräsidium Tübingen) genehmigt und nach dem Tierschutzgesetz und der EU-Richtlinie 2010/63 / EU durchgeführt.

1. In der Utero Electroporation

  1. Mikroinjektionsnadeln
    1. Ziehen Sie Borosilikatglas-Kapillaren (Außendurchmesser: 1,0 mm, Innendurchmesser: 0,58 mm, Länge: 100 mm) in Mikroinjektionsnadeln unter Verwendung eines Mikropipettenabziehers mit einem Kastenfaden (2,5 mm x 2,5 mm) und dem folgenden Programm: HEAT: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 und DELAY: 140. Bestimmen Sie den HEAT-Wert für jeden einzelnen Faden, indem Sie einen RAMP-Test durchführen (HEAT-Wert: RAMP + 25).
    2. Kegelnadeln in einem Winkel von 38 ° und einer mittleren bis hohen Umdrehungsgeschwindigkeit mit einem Mikroförderer, um eine Spitzengröße von 20 bis 30 μm zu erhalten, um am embryonalen Tag (E) 13,5 oder jünger und 30 bis 40 μm für die Injektion bei älteren Embryonalen zu injizierenStufen Zur Aufbewahrung Nadel in einer Schachtel oder Petrischale mit modelliertem Ton fixieren, um Schäden an den Spitzen zu vermeiden.
  2. Plasmid-DNA-Lösung
    1. Vorbereiten des Plasmid-DNA-Konstrukts, das fluoreszierendes Reporterprotein ( z. B. GFP) enthält, unter Verwendung eines endotoxinfreien Maxi-Präparationskits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Die Plasmid-DNA-Lösung auf eine Endkonzentration von 1 - 2 μg / μl in endotoxinfreiem Tris-EDTA-Puffer mit Fast Green bei einer Endkonzentration von 0,01% verdünnen. Aliquot-Lösung und bei -20 ° C aufbewahren.
  3. Bakteriostatische Natriumchloridlösung
    1. Bakteriostatische Natriumchloridlösung durch Zugabe von Benzylalkohol zu einer Endkonzentration von 0,9% zu isotonischer 0,9% iger Natriumchloridlösung herstellen. Sterilfilterlösung sofort vor Gebrauch.
  4. Carprofen Injektionslösung
    1. Vorbereiten der Carprofen-Injektionslösung durchZugabe von Carprofen zu einer Endkonzentration von 0,5 mg / ml zu steriler isotonischer 0,9% iger Natriumchloridlösung. Bei 4 ° C für bis zu 28 Tage aufbewahren.
  5. Anästhesie, DNA-Injektion und Elektroporation
    1. Wiegen Sie eine E14.5-zeitgesteuerte Maus und legen Sie sie in eine transparente Betäubungskammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist und mit 5% Isofluran gesättigt ist. Wenn das Tier bewusstlos ist, transportiere es auf eine anästhesierende Maske, die an einer 37 ° C wärmenden Platte befestigt ist und sie mit 1,8 - 2,2% Isofluran betäubt hält.
      Anmerkung: Beurteilung der Entwicklung der chirurgischen Anästhesie durch Verlust der Heckklemme und Pedalreflexe ( Zehenklemme).
    2. Für die Analgesie injizieren 100 μl Carprofen-Injektionslösung pro 10 mg Mauskörpergewicht (5 mg / kg Körpergewicht) subkutan. Drehen Sie die Maus mit dem Rücken nach unten und sorgfältig bedecken die Augen mit Vaseline, um sie vor dem Trocknen zu verhindern.
    3. Die Glieder vorsichtig ausbreiten und fixierenAuf die wärmende Platte mit chirurgischem Band. Sterilisieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol, gefolgt von Iodlösung (7,5 mg / ml) unter Verwendung von Cellulose-Tupfern. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um eine ordnungsgemäße Desinfektion zu gewährleisten.
    4. Decken Sie den Bauch mit steriler Gaze, in dem ein Schnitt wurde geschnitten, um ein Feld (Durchmesser: 2 - 2,5 cm) für die Bauch-Inzision zu ersparen. Befeuchten Sie die Gaze mit bakteriostatischer Kochsalzlösung.
      Achtung: Neugestaltung der Entwicklung der chirurgischen Anästhesie durch Verlust des Pedalreflexes.
    5. Mit Micro Adson Forceps (gezackt, Länge: 12 cm) und feine Schere (abgewinkelt zur Seite, Länge: 9 cm) schneiden Sie die Haut ca. 1,5 cm entlang der Mittellinie des Bauches. Schneide den zugrunde liegenden Muskel entlang der Linie alba.
    6. Entfernen Sie ein Uterushorn mit Ringpinzette (Länge: 9 cm, Außendurchmesser: 3 mm, Innendurchmesser: 2,2 mm) und legen Sie es vorsichtig auf die angefeuchtete Gaze.
      Achtung: Halten Sie das Uterushorn mit Ringpinzetten nur zwischen den Embryonen anD stört die Plazenta oder keine Versorgungsschiffe. Halten Sie den Uterus jederzeit mit bakteriostatischer Kochsalzlösung feucht.
    7. Sorgfältig einen Embryo mit Ringpinzette positionieren und den lateralen Ventrikel lokalisieren, der als halbmondförmiger Schatten parallel zum sagittalen Sinus steht. Die Injektionsstelle liegt etwa in der Mitte einer Linie zwischen dem pigmentierten Auge und dem Zusammenfluss von Nebenhöhlen, wo der Sagittal-Sinus zu zwei Quer-Nebenhöhlen verzweigt. Schieben Sie die Mikroinjektionsnadel durch die Uteruswand und in den Seitenventrikel.
      Hinweis: Bei Bedarf kann die Tiefe der Einspritzung durch Rückzug der Nadel korrigiert werden.
    8. 1 bis 2 μl DNA-Lösung in den lateralen Ventrikel mit einem mit einem Fußpedal betriebenen Mikroinjektor mit den folgenden Einstellungen einspritzen: 25 psi, 10 bis 20 ms pro Puls und 5 bis 10 Impulse. Eine erfolgreiche Injektion kann durch die farbige DNA-Lösung überwacht werden, die das ventrikuläre System füllen soll.
    9. Legen Sie Pinzetten-Elektroden (3 mm Durchmesser für E13.5 oder jüngeren und 5 mm Durchmesser für E14.5 oder älter) so ein, dass der "positive" Anschluss auf der gleichen Seite wie der eingespritzte Ventrikel und der "negative" Terminal ist auf der gegenüberliegenden Seite des injizierten Ventrikels unter dem Ohr des Embryos Kopf.
    10. Befeuchten Sie die Elektroporationsstelle mit einigen Tropfen bakteriostatischer Natriumchloridlösung und legen Sie 5 Wechselstromimpulse (35 V für E13.5 oder jünger und 40 V für E14.5 oder älter) von 50 ms Dauer mit 950 ms Intervallen auf.
      Anmerkung: Ströme von 60 bis 90 mA reichen in der Regel für eine erfolgreiche Elektroporation aus. Niedrigere Ströme werden die Neuronen nicht effizient transfizieren, während höhere Ströme zum embryonalen Tod führen können.
    11. Wiederholen Sie den Vorgang (vgl. Schritt 1.5.7 bis 1.5.10.) Für jeden Embryo des Uterushorns und legen Sie ihn vorsichtig wieder in die Bauchhöhle zurück.
    12. Das Uterushorn von der anderen Seite entfernen und den Proc wiederholenEdure beschrieben in Schritt 1.5.7. Bis 1.5.11.
    13. Schließen Sie die Bauchhöhle, indem Sie die Muskelschicht nähen, bevor Sie die Haut mit Micro Adson Forceps, Mathieu Nadelhalter (Wolframkarbid, Länge: 14 cm) und nicht resorbierbare chirurgische Naht (3/8 Kreis, 13 mm, Kegelspitze) nähen.
      Achtung: Achten Sie darauf, den Uterus oder andere Organe während der Naht nicht zu fangen.
    14. Die Hautnaht sorgfältig mit Jodlösung (7,5 mg / ml) desinfizieren und den periozioxten Überschuss von Vaseline mit Zellstofftupfern vorsichtig entfernen. Lege die Maus unter eine Infrarotlampe, bis sie aufwacht. Die Maus in den nächsten zwei Tagen genau beobachten. Wiederholen Sie die Analgesiebehandlung wie in Schritt 1.5.2 nach 12 bis 24 h beschrieben.

2. Organotypische Scheibe Kultur

  1. Laminin Stock Solution
    1. 1 mg lyophilisiertes Laminin in sterilem Wasser auflösen, um eine 1 mg / ml Laminin-Stammlösung zu erhalten. 50 μl Aliquots vorbereiten aLager bei -80 ° C.
  2. Poly-L-Lysin-Stammlösung
    1. 50 mg Poly-L-lysin in sterilem Wasser auflösen, um eine 1 mg / ml Poly-L-lysin-Stammlösung zu erhalten. 0,5 ml Aliquote vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren.
  3. Vollständige Hank's Balanced Salt Solution (Komplette HBSS)
    1. Vorbereiten des vollständigen HBSS durch Kombinieren von 50 ml 10x HBSS-Lösung, 1,25 ml 1 M HEPES-Puffer (pH 7,4), 15 ml 1 M D-Glucoselösung, 5 ml 100 mM Calciumchloridlösung, 5 ml 100 mM Magnesiumsulfat Lösung und 2 ml einer 1 M Natriumhydrogencarbonatlösung. Füge steriles Wasser bis zu 0,5 l hinzu, steriler Filter und bei 4 ° C aufbewahren.
  4. Scheibe Kultur Medium
    1. Kombinieren Sie 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml vollständiges HBSS (vgl. 2.3.1.), 1,35 ml 1 M D-Glucose, 0,25 ml 200 mM L-Glutamin und 0,5 ml Penicillin-Streptomycin zu 50 ml Scheibenkultur erhaltenMittel. Sterilfilter und fügt Pferdeserum zu einer Endkonzentration von 5% hinzu. Bei 4 ° C bis zu 4 Wochen aufbewahren.
  5. Niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose Lösung
    1. Vorbereitung von 3% LMP-Agaroselösung durch Auflösen von 1,5 g LMP-Agarose in 50 ml vollständigem HBSS durch Erhitzen in einem Mikrowellenofen für 1 bis 2 min bei mittlerer Leistung.
      Hinweis: Überwachen Sie die Hitze sorgfältig, um einen Überlauf beim Kochen zu verhindern.
    2. Legen Sie die Lösung in ein Wasserbad bei 38 ° C, bis sie gebrauchsfertig ist. Bei 4 ° C aufbewahren und einmal wieder verwenden.
  6. Beschichtung von Membraneinsätzen
    1. Füge ein Aliquot der Laminin-Stammlösung (vgl. Schritt 2.1.1) und ein Aliquot der Poly-L-lysin-Stammlösung (vgl. Schritt 2.2.1) zu 6 ml sterilem Wasser ein, um eine Beschichtungslösung zu erhalten (genügend für 6 Einsätze) .
    2. Legen Sie Membraneinsätze in eine 6-Well-Platte mit 2 ml sterilem Wasser in den Boden jeder Vertiefung. 1 ml Beschichtungslösung zugeben(Vgl. Schritt 2.6.1) oben auf jede Membran und über Nacht bei 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre inkubieren.
      Hinweis: Verwenden Sie nur Einsätze mit optisch klaren Membranen wie Polytetrafluorethylen (PTFE) Membran.
    3. Die Membranen dreimal mit 1 ml sterilem Wasser waschen und trocknen. Verwenden Sie beschichtete Membranen am selben Tag oder lagern Sie in einer sauberen 6-Well-Platte bei 4 ° C für bis zu vier Wochen.
  7. Hirndissektion und Einbettung
    1. Zwei Tage nach der Elektroporation platzieren Sie die Maus in eine transparente Kammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist und mit 5% Isofluran gesättigt ist. Wenn das Tier bewusstlos ist, entfernen Sie es aus der Kammer und opfern es durch zervikale Versetzung.
    2. Entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen und legen Sie sie in eine 10-cm-Petrischale mit eiskaltem komplettem HBSS.
      Anmerkung: Von diesem Punkt an halten alle Lösungen, Embryonen und Gehirne auf Eis.
    3. Verwenden Sie ein Stereomikroskop, feine Spitze Pinzette (gerade,11 cm) und ein Paar Vannas Tübingen Spring Scissors (abgewinkelt, Länge: 9,5 cm), um jeden Embryo vom Uterus zu trennen und auf eine andere Petrischale zu bringen, die eiskaltes komplettes HBSS enthält.
    4. Machen Sie einen Einschnitt auf der Höhe des Hirnstamms und schneiden Sie die sagittale Mittellinie. Schälen Sie die Haut und den Knorpel, der das Gehirn bedeckt. Dann schneide den Hirnstamm direkt hinter die Hemisphären und entferne das Gehirn vom Schädel. Übertragen Sie das Gehirn mit einem Mikro-Löffel-Spatel (185 mm x 5 mm) auf eine 12-Well-Platte mit eiskaltem komplettem HBSS. Sammle alle Gehirne aus dem Wurf in der 12-Well-Platte.
    5. Verwenden Sie ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um das Gehirn in der 12-Well-Platte für die Fluoreszenzhelligkeit sowie die Größe der elektroporierten Region zu screenen. Wählen Sie 2 bis 4 Gehirne mit hellen Fluoreszenzsignalen in der vermutlich somatosensorischen Kortex für die weitere Verarbeitung.
    6. Gießen Sie 3% LMP-Agarose-Lösung bei 38 ° C in Abzieh-Einweg-Einbettungsform. EntfernenE Gehirn aus der 12-Well-Platte mit einem Mikro-Löffel Spatel und sorgfältig abtropfen überschüssige komplette HBSS um das Gehirn mit feinen Tissue-Papier.
    7. Legen Sie das Gehirn sanft in die Agarose-Lösung, schieben Sie es auf den Boden der Form, und passt sorgfältig seine Position mit einer 20-Gauge-Nadel. Für koronare Abschnitte orientieren Sie das Gehirn mit den nach oben weisenden Riechbirnen. Halten Sie die Form auf Eis, bis die Agarose-Lösung verfestigt ist und fahren Sie mit dem Abbau des Gehirns fort.
  8. Vibratome Sectioning und Slice Kultur
    1. Den Agaroseblock aus der Form nehmen und auf den Deckel einer sterilen Petrischale legen. Die überschüssige Agarose mit einer sauberen Rasierklinge abschneiden, die etwa 2 bis 3 mm unterhalb der olfaktorischen Glühbirnen und 1 mm Agarose auf den anderen Seiten verlässt. Fixieren Sie den beschnittenen Agaroseblock mit den olfaktorischen Glühbirnen, die nach unten zu einem Probenstadium unter Verwendung von Cyanoacrylatklebstoff zeigen.
      Hinweis: Sterilisieren Sie Instrumente und Geräte mit 70% EthanoL vor dem schneiden.
    2. Übertragen Sie die Probenstufe auf die Schneidkammer eines Vibrationsmesser-Mikrotoms, das eiskaltes komplettes HBSS enthält, und positionieren Sie das Gehirn mit seiner dorsalen Seite in Richtung der Klinge. Schneiden Sie 250 μm dicke Hirnscheiben, die den elektroporierten Bereich mit einer niedrigen bis mäßigen Amplitude von 0,9 mm und einer sehr langsamen Schnittgeschwindigkeit von 0,09-0,12 mm / s enthalten. Üblicherweise werden 4 bis 6 Scheiben mit hellem Fluoreszenzsignal aus jedem erfolgreich elektroporierten Gehirn gewonnen.
    3. Mit einem gebogenen Mikro-Löffel-Spatel und feiner Pinzette, übergeben Sie die Gehirnscheiben sorgfältig mit der umliegenden Agarose zu einer 6-Well-Platte, die eiskaltes komplettes HBSS enthält.
      Achtung: Achten Sie darauf, das Gehirngewebe nicht zu beschädigen, indem Sie nur den Agaroserand um die Sektionen mit der Pinzette während des Transports berühren.
    4. Verarbeiten Sie alle ausgewählten Gehirne wie in den Schritten 2.8.1 beschrieben. Bis 2.8.3.
    5. Befeuchten Sie die Membraneinsätze mit 100 μl komplettem HBSS, bevor Sie das Gehirn slAuf die Membranen, um die Positionierung der Scheiben zu erleichtern. Bis zu 5 Scheiben können auf 1 Membraneinsatz aufgesetzt werden.
    6. Sorgfältig die Scheiben auf die Membranen mit einem gebogenen Mikro-Löffel Spatel und feine Spitze Pinzette übertragen. Ziehen Sie vorsichtig eine Scheibe auf den Spatel, indem Sie nur den Agaroserand mit der Pinzette berühren und die Scheibe vorsichtig von der Spachtel auf die Membran schieben. Positionieren Sie die Scheibe mit Pinzette und fahren Sie fort, die restlichen Scheiben zu übertragen. Entfernen Sie überschüssiges HBSS mit einer Pipette.
      Hinweis: Die Scheiben nicht überlappen.
    7. Mit Hilfe der Pinzette sorgfältig die Membraneinsätze mit den Scheiben in eine 6-Well-Platte mit 1,8 ml Schichtkulturmedium (vgl. Schritt 2.4.1.) Geben und bei 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre bis zum Zeitraffer inkubieren Bildgebung

3. Zeitraffer-Bildgebung

  1. Mikroskop-Setup
    1. Stellen Sie eine Klimakammer auf die Bühne einInvertiertes konfokales Mikroskop auf 37 ° C und 5% Kohlendioxidatmosphäre. Verwenden Sie einen Hybrid-Detektor, um die Laserintensität zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Für eine detaillierte Analyse verwenden Sie einen extra langen Arbeitsabstand 40X Trockenobjektiv mit einer numerischen Blende von 0,6 oder höher.
      Hinweis: Alle Komponenten des Mikroskops müssen vor dem Imaging auf 37 ° C vorgewärmt werden, um eine stabile Fokussierung während des Bildgebungsprozesses zu gewährleisten.
  2. Slice Imaging
    1. Wählen Sie eine Hirnscheibe für die Bildgebung aus der 6-Well-Platte, die die Membraneinsätze enthält, mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
      Achtung: Vermeiden Sie eine längere Belichtungszeit für ultraviolettes Licht, da dies zu einer zellulären Photodamage führen kann.
      Anmerkung: Wählen Sie eine Scheibe mit hellen einzelnen Neuronen im oberen SVZ, die radial zur Pialoberfläche der Scheibe wandern. Feine fluoreszierende Prozesse von radialen Gliazellen, die den gesamten CP überspannen, deuten auf ein intaktes radiales Gliagerüst hin, das verwendet wirdD durch radiales Migrieren von kortikalen Neuronen.
    2. Übertragen Sie den Membraneinsatz mit der für die Zeitraffer-Bildgebung ausgewählten Scheibe in eine Glasbodenschale mit 50 mm Durchmesser, die 2 ml Scheibenkulturmedium mit Hilfe der Pinzette enthält. Legen Sie die Schale in die Klimakammer des konfokalen Mikroskops.
    3. Stellen Sie die Auflösung auf 512 mal 512 Pixel ein und erhöhen Sie die Scan-Geschwindigkeit von 400 Hz auf 700 Hz, um die Bildrate von etwa 1,4 bis etwa 2,5 Frames pro Sekunde zu erhöhen. Verwenden Sie nicht mehr als zwei Mal Mittelwert. Definieren Sie einen Z-Stapel durch den elektroporierten Bereich (üblicherweise 400-100 μm) mit einer Schrittweite von 1,5 μm. Zusammenfassend erlauben diese Einstellungen eine ausreichende Auflösung und Helligkeit des Bildes, während die Photodamage während des Erwerbs niedrig gehalten wird. Starten Sie die Zeitraffer-Serie, indem Sie alle 30 Minuten einen Z-Stack nehmen.
      Anmerkung: Eine längere Belichtung der Scheibe an Laserlicht wird dazu führen, dass die Photodamage die Lebensfähigkeit der Zellen verringert. Stellen Sie die expOsure Zeit zum Laserlicht entsprechend.
    4. Analysieren Sie die Zeitraffer-Serie mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/iij/) oder gleichwertig.

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Ergebnisse

Bisher haben wir gezeigt, dass die genetische Deletion von Bcl11a in der utero- Elektroporation die radiale Migration von spätgeborenen Oberschicht-Projektion Neuronen 10 beeinträchtigt. Die Elektroporation eines DNA-Plasmid-Vektors, der Cre-IRES-GFP enthielt, löschte Bcl11a effizient in bedingten Bcl11a- Flox / Flox- Gehirnen 11 . Als wir E14.5 elektroporierte Gehirne drei Ta...

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Diskussion

Radiale Migration ist ein wichtiger Prozess in der Neocortex-Entwicklung. Mutationen in Genen, die verschiedene Schritte dieses Prozesses beeinflussen, können schwere kortikale Fehlbildungen verursachen, einschließlich Lissencephalie und weiße Substanz Heterotopie 1 , 2 . Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Bcl11a, das in jungen wandernden kortikalen Projektion Neuronen ausgedrückt wird, eine Rolle bei der radialen Migration spielt. Wir haben die konfokale Bildge...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka und Matthias Toberer für hervorragende technische Unterstützung sowie Victor Tarabykin für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von einem Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft an SB (BR-2215) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
IsofluranAbbott Laboratories 506949Forene
6-Well-PlatteCorning351146
12-Well-PlatteCorning351143
nicht resorbierbares chirurgisches NahtmaterialEthiconK890H3/8 Kreis, 13 mm, konische
Spitze Micro Adson PinzetteFine Science Tools11018-12gezahnt, Länge: 12 cm
feine SchereFine Science Tools14063-09abgewinkelt, Länge: 9 cm
Mathieu NadelhalterFine Science Tools12510-14Wolframkarbid, Länge: 14 cm
Pinzette mit feiner SpitzeFine Science Tools11370-40gerade, 11 cm
Vannas Tü bingen FederschereFine Science Tools15005-08abgewinkelt, 9,5 cm
RingzangeFine Science Tools11103-09OD: 3mm, ID, 2,2 mm, Länge: 9 cm
HBSS (10X)Gibco14180046
L-GlutaminGibco25030081
Penicillin/StreptomycinGibco15140122
PferdeserumGibco
BMEGibco41010026
Borosilikatglas KapillarenHarvard Apparatur30-00161,0 OD x 0,58 ID x 100 L mm
AnästhesiesystemHarvard Apparaus72-6471
AnästhesiekammerHarvard Apparaus34-0460
Fluosorber FilterbehälterHarvard Apparaus34-0415
Agarose mit niedrigem SchmelzpunktInvitrogen16520100
VibrationsklingenmikrotomLeicaVT1200 S
Fluoreszenz-StereomikroskopLeicaM205 FA
StereomikroskopLeicaM125
inverses Fluoreszenz-GewebekulturmikroskopLeicaDM IL LED
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopLeicaTCS SP5II
Hybrid-DetektorLeicaHyD
Objektiv, 40x/0,60 NALeica11506201
Mikroskop TemperaturkontrollsystemLife Imaging ServicesCube, Brick & Brick
MilliporePICM0RG50
MikroschleiferNarishigeEG-45verwenden 38° Winkel zum Anfasen
von MikroinjektorParker Hannifin 052-0500-900Picospritzer III
CarprofenPfizer Animal HealthNDC 61106-8507Rimadyl
Emdedding MoldPolysciences18986-1
endotoxinfreies Plasmid Maxi KitQiagen12362
schnell grünSigmaF7252
Laminin SigmaL2020
Poly-L-LysinSigmaP5899
HEPESSigmaH4034
D-GlukoseSigmaG6152
CalciumchloridSigmaC7902
MagensiumsulfatSigmaM2643
NatriumbicarbonatSigmaS6297
Rechteck-ElektroporatorSonidelCUY21EDIT
Pinzette mit 5 mm Platin-ScheibenelektrodenSonidelCUY650P5
MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-97
BoxFilament Sutter InstrumentFB255B2,5 mm x 2,5 mm
MikrolöffelspatelVWR231-0191185 mm x 5 mm
Glasbodenschale, 50 mmWorld Precision InstrumentsNr. FD5040-100
seitlich 26050088 Box-Zellkultur-Einsatz

Referenzen

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  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
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Radiale NeuronenmigrationCortikale NeuronenpolarisationNeocortex EntwicklungAnalyse der MigrationsgeschwindigkeitMessung des AbweichungswinkelsFluoreszenz Stereomikroskopie

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