Kombinieren von Raman Imaging und multivariater Analyse zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in der Pflanzenzellwand

Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, ein allgemeines Verfahren zur Visualisierung von Lignin, Cellulose und Hemicellulose in Pflanzenzellwänden unter Verwendung von Raman-Bildgebung und multivariater Analyse vorzustellen.

Abstract

Die Anwendung der Raman-Bildgebung zur Pflanzen-Biomasse nimmt zu, da sie räumliche und kompositorische Informationen über wässrige Lösungen anbieten kann. Die Analyse erfordert in der Regel keine umfangreiche Probenvorbereitung; Strukturelle und chemische Informationen können ohne Etikettierung erhalten werden. Jedoch enthält jedes Raman-Bild Tausende von Spektren; Dies wirft Schwierigkeiten auf, wenn man versteckte Informationen extrahiert, vor allem für Komponenten mit ähnlichen chemischen Strukturen. Diese Arbeit führt eine multivariate Analyse ein, um dieses Problem zu lösen. Das Protokoll stellt eine allgemeine Methode zur Visualisierung der Hauptkomponenten, einschließlich Lignin, Cellulose und Hemicellulose, innerhalb der Pflanzenzellwand dar. In diesem Protokoll werden Verfahren zur Probenvorbereitung, spektrale Erfassung und Datenverarbeitung beschrieben. Es ist sehr abhängig von der Bedienerfertigkeit bei der Probenvorbereitung und der Datenanalyse. Mit diesem Ansatz kann eine Raman-Untersuchung von einem nicht-spezialisierten Benutzer durchgeführt werden, um hig zu erwerbenH-Qualitätsdaten und aussagekräftige Ergebnisse für die Pflanzenzellwandanalyse.

Introduction

Pflanzenbiomasse ist die am häufigsten vorkommende erneuerbare Ressource auf der Erde; besteht hauptsächlich aus Lignin, Zellulose und Hemizellulose; und gilt als attraktive Quelle für Bioenergie und biobasierte Chemikalien¹. Leider kann es dem Abbau widerstehen und der pflanzlichen Zellwand hydrolytische Stabilität oder strukturelle Robustheit verleihen. Diese Beständigkeit ist auf die zugängliche Oberfläche, die Größe der Biomassepartikel, den Polymerisationsgrad, die Zellulosekristallinität und das schützende Lignin^{2 zurückzuführen}. Ein umfassendes Verständnis der strukturellen und chemischen Beschaffenheit der pflanzlichen Zellwand ist daher sowohl aus Sicht der Pflanzenbiologie und -chemie als auch aus Sicht der kommerziellen Nutzung von Bedeutung. Gängige nasschemische Analysen wie Chromatographie, Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie liefern nur durchschnittliche Daten zur Zusammensetzung der gemessenen Probe. Darüber hinaus sind diese Methoden invasiv und zerstören die ursprüngliche Struktur des Pflanzengewebes³.

Die Raman-Bildgebungstechnik ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zerstörungsfreien Visualisierung von räumlich aufgelösten chemischen Informationen⁴. Es verwendet ein Laserlicht, um eine inelastische Streuung mit einem Photon zu verursachen, und beruht auf Änderungen der Polarisierbarkeit, die sich aus den molekularen Schwingungen ergeben. In diesem Fall verursacht Wasser eine schwache Raman-Streuung, wodurch dieser Ansatz für In-situ-Untersuchungen biologischer Proben geeignet ist⁵. Die Anwendung der Raman-Bildgebungstechnik auf die pflanzliche Zellwand kann die Struktur und Zusammensetzung der pflanzlichen Zellwände in ihrem nativen Zustand aufklären, mit einer Auflösung auf der Skala der einzelnen Zelle und sogar der Zellwandschichten⁶. Eine typische Raman-Imaging-Analyse einer pflanzlichen Zellwand besteht im Allgemeinen aus drei Schritten: 1) Probenvorbereitung, 2) spektrale Erfassung und 3) Datenverarbeitung.

Obwohl einer der Hauptvorteile der Raman-Bildgebung die Möglichkeit ist, markierungsfreie und zerstörungsfreie Spektren mit minimaler Probenvorbereitung zu erzielen, ist dennoch eine physikalische Probenschnittung erforderlich, um die interessierende Oberfläche zu belichten. Dieser Vorgang sollte sorgfältig durchgeführt werden, um eine ebene Oberfläche zu erhalten, da die Technik von der Beibehaltung des optischen Fokus abhängt⁷. Die spektrale Erfassung erfordert ein Gleichgewicht zwischen Bildqualität und langen Erfassungszeiten⁸. Die Datenverarbeitung zielt darauf ab, die chemische Information effektiv aus den Bilddaten zu extrahieren, insbesondere für die Komponenten mit ähnlichen chemischen Strukturen, wie Cellulose und Hemicellulose. Aufgrund der starken spektralen Überlappung sind die genauen Spektren schwer zu erkennen. In diesem Fall ist die multivariate Analyse ein einfacher Ansatz, um die verborgenen strukturellen und chemischen Informationen effektiv aufzudecken⁹. In dieser Arbeit wird ein allgemeines Protokoll vorgestellt, das die Verwendung von Raman-Bildgebung zur Visualisierung der Hauptkomponenten in pflanzlichen Zellwänden, einschließlich Lignin, Cellulose und Hemicellulose, beschreibt.

Protocol

1. Probenvorbereitung

1. Schneiden Sie einen kleinen Gewebeblock (ca. 3 mm x 3 mm x 5 mm) aus der Pflanzenprobe ( zB Pappelstiel).
2. Tauchen Sie das Gewebe 30 Minuten lang in kochendes deionisiertes Wasser ein. Sofort 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf deionisiertes Wasser übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gewebe auf den Boden des Behälters sinkt, was darauf hinweist, dass die Luft im Gewebe entfernt wurde und dass sich das Gewebe erweicht hat.
   Hinweis: Für die Proben, die vor diesem Schritt nach unten sinken, wiederholen Sie diesen Zyklus im Allgemeinen 3-5 mal.
3. Vorbereitung von 20, 50, 70, 90% (v / v) Aliquoten von Polyethylenglykol (PEG) in deionisiertem Wasser sowie reinem PEG und halten die Lösungen bei 65 ° C.
4. Inkubieren Sie das Gewebe in einer Reihe von abgestuften PEG-Bädern, um das Wasser zu verdrängen und lassen Sie das PEG infiltrieren.
   Hinweis: In der Regel wird PEG mit einem Molekulargewicht 2.000 (PEG2000) zum Einbetten verwendet.
   1. Verarbeiten Sie das Gewebe mit gPEG in einem Trockenofen wie folgt: (a) 20% PEG für 1 h, (b) 50% PEG für 1,5 h, (c) 70% PEG für 2 h, (d) 90% PEG für 2 h und (E) 100% PEG für 10 h.
5. Vorwärmen einer Kassette bei 65 ° C in einem Ofen. Gießen Sie den PEG mit dem Block in die Kassette und legen Sie den Gewebeblock in eine gewünschte Position mit vorgewärmten Pinzetten oder Nadeln.
6. Langsam die Kassette abkühlen und das Gewebe bei RT bis zum Gebrauch aufbewahren.
7. Den PEG-Block, der das Zielgewebe enthält, in einen kleinen Block (ca. 1 cm x 1 cm x 2 cm) mit einer scharfen Rasierklinge zerlegen und auf das Mikrotom aufbringen.
8. Schneiden Sie dünne Abschnitte aus dem PEG-Block (typischerweise 3-10 μm).
9. Spülen Sie den Abschnitt mit deionisiertem Wasser in einem Uhrglas 10 mal, um das PEG aus dem Gewebe zu entfernen.
10. Tauchen Sie die Sektionen mit Toluol / Ethanol (2: 1, v / v) für 6 h ein, um die Extrakte zu entfernen. Die Reaktionsflüssigkeit wird durch Mischen von 65 ml entionisiertem Wasser, 0,5 ml Essigsäure und 0,6 g Natriumchlorid zubereitetRitus in einem Becher Einen Teil und 3 ml Reaktionsflüssigkeit in eine 5 ml Durchstechflasche geben. Schrauben Sie auf die Oberseite der Durchstechflasche.
11. Die Durchstechflasche im Wasserbad bei 75 ° C für 2 h erhitzen, um das Lignin des Gewebes zu entfernen. Spülen Sie den Abschnitt mit deionisiertem Wasser in einem Uhrglas 10 mal aus.
12. Den unbehandelten / delignenten Abschnitt auf einen Glasmikroskop-Objektträger übertragen. Füllen Sie den Abschnitt sorgfältig mit Pinsel oder Nadeln. Das extra entionisierte Wasser mit Seidenpapier entfernen.
13. Tauchen Sie den Abschnitt in D ₂ O ein. Bedecken Sie die Probe mit einem Glasdeckel. Den Deckel mit Nagellack abdichten, um die Verdampfung des D ₂ O zu verhindern.

2. Spektrale Erfassung

1. Öffnen Sie die Instrumentensoftware des konfokalen Raman-Mikroskops. Schalten Sie den Laser ein (Wellenlänge = 532 nm), fokussieren Sie auf die Oberfläche des kristallinen Siliziums mit einem 100fachen Mikroskopobjektiv und klicken Sie auf die Kalibriertaste, um das Instrument zu kalibrieren.
2. Gerät einschaltenZum optischen Mikroskop-Modus und schalten Sie die Mikroskop-Lampe ein. Montieren Sie den Mikroskop-Objektträger auf der Bühne, wobei der Deckel dem Objektiv zugewandt ist.
3. Sehen Sie die Probe mit einem 20X-Mikroskop-Objektiv an und suchen Sie den interessanten Bereich. Das Tauchöl auf das Deckglas auftragen und auf das Immersionsmikroskopobjektiv wechseln (60X, numerische Blende NA = 1.35). Konzentriere dich auf die Oberfläche der Probe.
4. Schalten Sie das Gerät in den Raman-Testmodus und schalten Sie die Mikroskoplampe aus.
5. Wählen Sie einen Mapping-Bereich mit einem rechteckigen Werkzeug. Ändern Sie die Schrittgröße, um die Anzahl der erhaltenen Spektren zu bestimmen.
   Hinweis: Beachten Sie die Schrittweite (meist größer als der durch die numerische Apertur des Objektivs berechnete Spotdurchmesser, theoretisch 1,22λ / NA). Größen darunter führen zu Überabtastungen.
6. Stellen Sie die optimalen Spektralparameter ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und die spektrale Qualität in einer geeigneten Erfassungszeit (im Allgemeinen <8 h) zu erhaltenNding auf die Eignung der Probe. Im Allgemeinen werden die Bildgebungsparameter in die Instrumentensoftware wie folgt eingegeben: Laser (532 nm), Filter (100%), Loch (300), Schlitz (100), Spektrometer (1.840 cm ^-1 ), Rillen (1200t), Objektiv ( 60X Öl) und Erfassungszeit (2 s).
7. Speichern Sie die Spektraldaten vor der Datenverarbeitung und konvertieren sie in ein universelles Format ( zB TXT-Dateien).

3. Datenanalyse

1. Laden Sie die Spektraldaten (TXT-Dateien) in die Datenanalyse-Software ( zB Matlab). Wenden Sie eine Rauschunterdrückung auf den Datensatz an, um das SNR zu verbessern ( zB der Savitzsky-Golay-Algorithmus oder der Wavelet-Algorithmus)
2. Verwenden Sie unbehandelte Proben, um die Bilder von Lignin und Polysacchariden herzustellen. Für die Lignin-Bildgebung betrachten wir den spektralen Peak um 1.600 cm ^-1 aufgrund der aromatischen Ring-symmetrischen Streckschwingungen. Für die Polysaccharid-Bildgebung (einschließlich Cellulose und Hemicellulose) verwenden Sie den Spektralpeak aRund 2,889 cm ^-1 wegen der CH- und CH2-Strecken.
3. Verwenden Sie delignifizierte Proben, um die Bilder von Cellulose und Hemicellulose zu erzeugen. Führen Sie eine selbstmodellierende Kurvenauflösung (SMCR) auf den erworbenen Spektren durch, um die Spektren von Cellulose und Hemicellulose zu unterscheiden und ihre Verteilungen abzubilden.
4. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Clusteranalyse auf die erfassten Daten durch, um die Raman-Spektren von verschiedenen Zellwandschichten zu unterscheiden.

Results

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über ein typisches Mikro-Raman-System für die Raman-Bildgebung einer Pflanzenzellwand. Als Beispiel haben die ursprünglichen Raman-Spektren der Pappel ( Populus nigra L.) signifikante Baseline-Drifts und Spikes (Abbildung 2a ). Nach Durchführung des automatischen Vorverarbeitungsverfahrens für den Raman-Bilddatensatz (APRI) werden diese beiden spektralen Verunreinigungen erfolgreich ent...

Discussion

Die Pflanzenzellwand ist ein Verbundwerkstoff, der in mehrere Schichten organisiert ist, darunter Zell-Ecke (CC), Sekundärwand (SW, mit den S1-, S2- und S3-Schichten) und zusammengesetzte mittlere Lamellen (CML, mittlere Lamellen plus die angrenzende Primär- Wand), was es schwierig macht, bei der Probenvorbereitung eine ebene Oberfläche zu erhalten. So müssen Pflanzenproben, vor allem Gras, die eine kompliziertere Struktur als Holz haben, oft verfestigt werden, um eine Feinschnittung zu ermöglichen. PEG ist eine ideale ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikrotom	Thermo Scientific	Microm HM430
Konfokales Raman-Mikroskop	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040