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Methodenartikel

Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/55913

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12. Juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) war eine der Methoden der Wahl, um angereicherte Populationen von Säugetier-Hoden-Keimzellen zu isolieren. Derzeit ermöglicht es die Unterscheidung von bis zu 9 murinen Keimzellpopulationen mit hoher Ausbeute und Reinheit. Diese hochauflösende Diskriminierung und Reinigung ist durch einzigartige Veränderungen der Chromatinstruktur und -menge in der gesamten Spermatogenese möglich. Diese Muster können durch Durchflusszytometrie von männlichen Keimzellen erfasst werden, die mit fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen wie Hoechst-33342 (Hoechst) gefärbt sind. Hierin ist eine detaillierte Beschreibung eines kürzlich entwickelten Protokolls zur Isolierung von Hodenzellen von Säugetieren. Kurz gesagt werden Einzelzellsuspensionen aus dem Hodengewebe durch mechanische Dissoziation erzeugt, mit Hoechst und Propidiumjodid (PI) doppelt gefärbt und durch Durchflusszytometrie verarbeitet. Eine serielle Gating-Strategie, einschließlich der Auswahl von lebenden Zellen (PI-negativ) mit unterschiedlichem DNA-Gehalt (Hoechst-Intensität), iS verwendet während der FACS-Sortierung, um bis zu 5 Keimzelltypen zu unterscheiden. Hierbei handelt es sich um entsprechende durchschnittliche Reinheiten (bestimmt durch mikroskopische Auswertung): Spermatogonien (66%), primäre (71%) und sekundäre (85%) Spermatozyten und Spermatiden (90%), weiter getrennt in runde (93%) und verlängert (87%) Subpopulationen. Die Ausführung des gesamten Workflows ist einfach, ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Zelltypen mit der entsprechenden FACS-Maschine und kann in weniger als 2 h durchgeführt werden. Da eine reduzierte Verarbeitungszeit entscheidend für die Erhaltung der Physiologie von ex vivo- Zellen ist, eignet sich diese Methode ideal für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Studien der männlichen Keimzellbiologie. Darüber hinaus eliminiert ein standardisiertes Protokoll für die Multispezies-Reinigung von Säugetierkeimzellen methodische Quellen von Variablen und ermöglicht es, einen einzelnen Satz von Reagenzien für verschiedene Tiermodelle zu verwenden.

Einleitung

Angesichts des Mangels an In-vitro- System, das für die Spermatogenese-Progression repräsentativ ist, und die Anwesenheit einer großen zellulären Heterogenität im Hoden, erforschen die Studien der männlichen Keimzellbiologie robuste Techniken, um angereicherte Populationen spezifischer Zelltypen zu isolieren. Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde zu diesem Zweck 1 , 2 , 3 , 4 , 5 weit verbreitet , da sie eine hohe Ausbeute und Reinheit liefert und andere Isolationsverfahren in der Anzahl der Keimzelltypen übertrifft, die sie identifizieren können Wählen Sie 6 , 7 , 8 . Das Prinzip der Durchflusszytometrieanalyse basiert auf der Erkennung von Differenzlichtmustern nach der Laserstrahlanregung einzelner Zellen. Als eine Zelle durch den Laser geht es reflektiert / streut LichtIn allen Winkeln, proportional zur Zellgröße (Vorwärtsstreuung, FSC) und zur intrazellulären Komplexität (Seitenstreuung, SSC). Siehe Ormerod 9 für detaillierte Informationen zur Durchflusszytometrie.

Männliche Keimzellen unterliegen spezifischen Modifikationen des DNA-Gehalts, der Chromatinstruktur, der Größe und der Form in verschiedenen Stadien der Spermatogenese. So können unterschiedliche Zellpopulationen identifiziert und durch Kombination von Lichtstreuung und DNA-Färbung mit Fluoreszenzfarbstoffen 10 , 11 getrennt werden . Hierzu können mehrere Farbstoffe verwendet werden (siehe Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 ), wie zB Hoechst-33342 (Hoechst), die häufig in der Durchflusszytometrieanalyse von Hodenzellen für die letzten zehn Jahre 1 , 2 , 4 , 10 verwendet wurde , 12 AufN Anregung mit UV-Licht, Hoechst emittiert blaue Fluoreszenz proportional zum zellulären DNA-Gehalt, während weit rote Fluoreszenz die Variabilität der Chromatinstruktur und der Verdichtung 1 , 13 , 14 widerspiegelt. Als Ergebnis zeigen männliche Keimzellen in verschiedenen Stufen der Differenzierung spezifische Muster während FACS von Hoechst-gefärbten Einzelzellsuspensionen (Ho-FACS, 1 , 12 ). Interessanterweise ist die Intensität der Hoechst-Blau-Fluoreszenz aufgrund eines Mechanismus des Farbstoff-Efflux, der nur während des Spermatogonialstadiums aktiv ist, nicht proportional zum Chromatingehalt in diesen Zellen, und sie gruppieren sich als Seitenpopulation während Ho-FACS 15 . Darüber hinaus ermöglicht die Kombination von Hoechst-Färbung mit dem nicht-permeierenden Farbstoff Propidiumjodid (PI) den Anwendern, lebende (PI-negative) von toten (PI-positiven) Zellen während FACS 1 , 2 , 10 , 12 . Diese Strategie wurde bisher in Durchflusszytometrieanalysen von Hodenkeimzellen verwendet und weitgehend in der Maus optimiert, um bis zu 9 Keimzelltypen, einschließlich Zellen in 4 verschiedenen Stadien der Meiose I 1 , 2 , 4 , 16 zu unterscheiden . Für die Zwecke dieser Arbeit hat Hoechst Färbung drei Hauptvorteile. Zuerst wurde Ho-FACS erfolgreich auf die Isolierung von männlichen Keimzellen im Mausmodell 1 , 2 , 12 und anderen Nagetieren wie Ratte und Meerschweinchen 17 , 18 , 19 angewendet. Zweitens ist Hoechst ein Zell-Permeations-Farbstoff und erfordert keine Membran-Permeabilisierung, so dass es preserVes Zelle Integrität. Schließlich ist keine RNase-Behandlung erforderlich, da Hoechst bevorzugt Poly (d [AT]) DNA-Sequenzen 1 , 20 bindet, was bedeutet, dass RNA konserviert wird und zusätzlich zu DNA und Proteinen für weitere nachgeschaltete molekulare Studien von Keim verwendet werden kann Zelldifferenzierung.

Trotz der Ähnlichkeit der DNA-Ploidie und / oder der Färbbarkeit, die bei Durchflusszytometrie-Analysen von Säugetierarten beobachtet wurde (in Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 untersucht ), gab es in den für die männliche Keimzellisolation durch Durchflusszytometrie beschriebenen Protokolle viel Variabilität. Verschiedene Studien haben spezifische Protokolle für die Gewebe-Dissoziation verwendet und verwendeten unterschiedliche DNA-bindende Farbstoffe (allein oder in Kombination) und FACS-Gating-Strategien in verschiedenen Modellorganismen, hauptsächlich der Maus, Ratte und Meerschweinchen. Daher kann der direkte Vergleich der für verschiedene Arten gesammelten Daten durch Unacco beeinflusst werdenUnzureichende technische Artefakte, die sich aus der Variabilität zwischen den Methoden ergeben. Wichtig ist, dass die markante Konservierung der Chromatin-Dynamik während der Säugetier-Spermatogenese (2N-4N-2N-1N) darauf hindeutet, dass ein standardisiertes Protokoll quer auf eine Vielzahl von Säugetierarten angewendet werden könnte.

Das Ziel dieser Studie war es, einen einzigen Workflow zu entwickeln, der für verschiedene Säugetierarten anwendbar ist, indem er die bisher veröffentlichten Techniken 2 , 20 kombiniert und anpasst. Standardisierung eines Verfahren zur Gewebeverarbeitung wurde durch Durchführen mechanische Dissoziation zu überwinden , die Notwendigkeit für speziesspezifische Anpassungen erforderlich , für die enzymatische Verdauung 5 erreicht. Es ist bemerkenswert, dass eine mechanische Dissoziation von Nagetier-Hodengewebe gezeigt wurde, dass sie besser als die enzymatische Gewebsverdauung 20 und Ho-FACS von Einzelzell-Suspensionen, die durch beide Verfahren erzeugt wurden, ausführenEs vergleichbare Ergebnisse 5 . Als Beweis für das Prinzip beschreibt dieses Protokoll die Einstellungen, die verwendet werden, um bis zu 5 Keimzellpopulationen zu isolieren: Spermatogonie (SPG); Primäre (SPC I) und sekundäre Spermatozyten (SPC II) und Spermatiden (SPD) - rund (rSPD) und verlängert (eSPD). Wichtig ist, dass es einfach im Labor zu implementieren ist, wobei die Hauptanforderungen das System für die Gewebedissoziation und den Zugang zu einem Zellsortierer sind, der mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Dieser Workflow ( Abbildung 1 ) ist schnell und unkompliziert und ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Keimzellpopulationen aus frischem Hodengewebe in weniger als 2 h. Die reduzierte Verarbeitungszeit ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der zellularen Integrität für weitere nachgeschaltete Verfahren. Darüber hinaus deutet die erfolgreiche Aufführung in 5 verschiedenen Spezies darauf hin, dass es in der Säugetier-Clade weitgehend angewendet werden kann. Damit ist es die ideale Methode, um Keimzellen für Vergleichsstudien von männlichen männlichen Fortpflanzungsbiolen zu untersuchenOgy

Dieses Protokoll besteht aus drei Hauptabschnitten, abgesehen von den vorbereitenden Schritten: (1) der mechanischen Dissoziation von Hodengewebe und (2) Färbung von Hodenzellen mit Hoechst und PI, gefolgt von (3) FACS-Sortierung relevanter spermatogener Zellen. Sobald gesammelt, können diese angereicherten Populationen von verschiedenen Säugetier-Hoden-Keimzellen für eine breite Palette von Anwendungen verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt eine "one-size fits all" Dissoziationsmethode, um männliche Keimzellen aus vielen verschiedenen Säugetierarten zu reinigen. Abhängig von der Art der Studie, die die Benutzer mit den isolierten Keimzellen durchführen möchten, können andere Medien oder Puffer verwendet werden. Die folgenden Protokollschritte sind für die Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen aus einem ganzen Mäuse-Testis.

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Protokoll

Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren entsprechen den Bestimmungen des Tierstudienausschusses an der Washington University in St. Louis.

1. Vorbereitungen für das Mechanische Dissoziations-Protokoll

  1. Vornässen einer 50-μm-Einweg-Gewebe-Disaggregationskartusche zur Dissoziation eines ganzen murinen Hodens.
    ANMERKUNG: Diese Einweg-Gewebe-Disaggregationskartusche enthält Mikroklingen, die zum Schneiden von Geweben und einem unbeweglichen Stahlgitter mit etwa 100 sechseckigen Löchern ausgelegt sind. Verschiedene Größen von Mesh für Gewebe Disaggregation Patrone sind verfügbar, um dieses Protokoll auf der Grundlage von Arten und gewünschten Zelltypen anzupassen. 50 μm Patronen wurden für alle in diesem Papier erwähnten Säugetierarten verwendet.
    1. Laden Sie 1 ml eiskaltes Phenol rot frei 1x Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) auf die 50 μm Einweg-Gewebe-Disaggregationspatrone.
      HINWEIS: Phenolrot kann die Erkennung von roten Fluoreszenen beeinträchtigenWährend der FACS.
    2. Aspirieren Sie 1x DMEM aus der Gewebe-Disaggregations-Patrone mit einer Einweg-3-ml-Nadel-freien Spritze aus dem Spritzen-Port.
  2. Schalten Sie das Gewebe-Disaggregationssystem durch Drücken der Taste "ON" ein. Dieses System erfordert keine "Aufwärmzeit".
  3. Vornasse drei 40 μm Einwegfilter mit eiskaltem 1x DMEM. Legen Sie jeden 40 μm Einwegfilter auf ein 50 mL konisches Rohr. Pipette 1 ml 1x DMEM und Durchlauf der Flüssigkeit.
  4. Vorbereitung einer 100 mm x 15 mm Petrischale zur Sammlung von Hodengeweben. 500 μl 1x DMEM auf die Petrischale pipettieren.

2. Vorbereitung des Hodengewebes für das mechanische Dissoziations-Protokoll

  1. Disektion einer männlichen Maus, um vorsichtig frische ganze Hoden oder Hodenfragmente (bei Umgang mit anderen Säugetierarten) mit chirurgischen Scheren und Pinzetten zu entfernen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Gewebe frei von Fett und Nekrose sind. Fr Esh-Hodengewebe erzeugen eine überlegene Einzelzell-Suspensionsqualität als gefrorene Gewebe.
    1. Transfer gesammelte Hoden / Fragmente auf die vorbereitete 100 mm x 15 mm Petrischale mit 500 μl 1x DMEM.
    2. Das Gewebe vorsichtig in 1x DMEM spülen, um rote Blutzellen zu entfernen (falls vorhanden).
  2. Entfernen Sie sorgfältig Tunica albuginea. Die Dicke von Tunica albuginea variiert in verschiedenen Arten.
    1. Ergreife ein Ende von Hoden mit Pinzette.
    2. Punktion das andere Ende der Hoden mit einem Skalpell, während immer noch das eine Ende von Hoden mit Pinzette aus früheren Schritt.
    3. Kratzen Sie Hodenröhrchen mit einem Skalpell, während immer noch das eine Ende von Hoden mit Pinzette aus Schritt 2.2.1.
  3. Schneiden Sie Hoden Tubuli in Stücke von ~ 2-3 mm 3 mit einem Skalpell.

3. Gewinnung von Einzelzell-Suspensionen durch mechanische Dissoziation von Hodengewebe

Ontent "> HINWEIS: Die unten beschriebenen Dissoziationsschritte beziehen sich auf einen erwachsenen Maus-Test. Die Mengen von Hodengeweben aus jugendlichen Mäusen oder nicht-murinen Spezies sollten entsprechend angepasst werden, jugendliche Tiere dürfen nicht alle Stadien von Keimzellen enthalten, einige Säugetierarten haben Hodengewebszusammensetzung ändert sich während der Zuchtperioden im Vergleich zur Nicht-Paarungszeit.

  1. Übertragen Sie die kleinen Hoden-Tubulusstücke auf die vorbenetzte 50 μm-Gewebe-Disaggregationskartusche mit Pinzette und fügen Sie 1 ml 1x DMEM hinzu.
  2. Legen Sie die Gewebe-Disaggregations-Patrone auf das Gewebe-Disaggregationssystem und verarbeiten Sie für 5 min, indem Sie den Knopf von "Standby" in den "Run" -Modus drehen.
  3. Entfernen Sie die Gewebe-Disaggregations-Patrone aus dem Gewebe-Disaggregationssystem und saugen Sie die Zellsuspension mit einer wegwerfbaren 3-ml-Nadel-freien Spritze aus dem Spritzenanschluss.
    1. Aspirieren Sie ein paar Mal, um alle Flüssigkeit aus Gewebe Disaggregation Patrone zu entfernen. NichtAlle 1 ml können aus der Gewebe-Disaggregations-Patrone gewonnen werden.
  4. Führen Sie die aspirierte Zellsuspension durch zwei wegwerfbare, vorvernetzte 40 μm Filter. Filtern Sie zweimal, um alle Zellenaggregate zu entfernen.
    1. Legen Sie einen vorbenetzten 40 μm Filter in ein 50 mL konisches Rohr. Die aspirierten Zellen direkt in die Spritze auf das 40 μm Filter geben. Pipetten-Durchlauf-Einzelzellen-Aufhängung mit Einwegpipette.
    2. Entfernen Sie den gebrauchten, vorbenetzten 40 μm Filter und legen Sie einen weiteren vorberührten 40 μm Filter in das 50-mL konische Rohr. Die gesammelte Einzeller-Suspension auf den sauberen 40 μm-Filter pipettieren.
    3. Sammelt gefilterte Einzelzelle Suspension mit einer sauberen Einwegpipette.
  5. Pipettierte gefilterte Zellsuspension zurück zu der 50 μm Gewebe-Disaggregationskartusche und Verfahren für weitere 5 min in einem Gewebe-Disaggregationssystem.
  6. Erfahre alle Flüssigkeit aus dem Gewebe disaggregatiAuf Patrone

4. Färbung mit Hoechst und Propidiumiodid (PI)

  1. Die zurückgewonnene Zellsuspension aus der 50 μm Gewebe-Disaggregationskartusche auf ein sauberes 1,5 mL-Röhrchen übertragen. Etwa 1-1,5 ml Einzelzell Suspension werden gewonnen.
  2. Teilen Sie die gewonnene Einzelzell-Suspension in vier 1,5 ml- oder 5-ml-Röhrchen.
    1. Für die ersten drei Röhrchen pipettieren Sie 150 μl einzelzellige Suspension und Pipettenrest einzelzelliger Suspension in das letzte der vier Röhrchen (ca. 550 μl Einzelzell Suspension).
      HINWEIS: Die Menge der Einzelzell-Suspension in der letzten Röhre kann je nach der Effizienz der Zellsuspensionsrückgewinnung in Schritt 3.6 variieren.
  3. Setzen Sie das erste Röhrchen der vier Röhren als ungefärbte Kontrolle für die FACS-Sitzung ein.
  4. Bereiten Sie einzelne Farbstoff gefärbte (PI oder Hoechst) Zellsuspensionen als Kontrollen vor. Zugabe von 2,5 μl Hoechst oder 1 μl PI zu jedem Röhrchen (zweiter und thiRd)
  5. Bereiten Sie ein doppelt gebeiztes Rohr vor. Dies wird zum Sammeln von Keimzell-Subpopulationen verwendet. Füge 2,5 μl Hoechst und 1 μl PI zum letzten Röhrchen hinzu.
    HINWEIS: Hoechst hat eine Haltbarkeitsdauer von 2-3 Monaten. Die Verwendung älterer Farbstoffbestände führt zu erheblichen Veränderungen während der FACS-Sitzung.
  6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min im Dunkeln. Legen Sie die Proben in einen Röhrenrotator oder setzen Sie die 1,5 ml Röhrchen alle 5-10 Minuten ein.
  7. Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einem vorberührten 40 μm Sieb und halten Sie die gefilterte Lösung auf Eis und im Dunkeln bis zur FACS-Sitzung.
    HINWEIS: Der Filtrationsschritt ist notwendig, um Zellklumpen für FACS zu verhindern. Zusätzlich kann die Behandlung mit DNase (siehe Abbildung 1 ) oder 2-Naphthol-6,8-disulfonsäure-dikalium-salz (NDA 20 ) zur Begrenzung der Zellverklumung verwendet werden. Verlängerte Wartezeiten beeinflussen das bei FACS detektierte Fluoreszenzsignal und können zu einem erhöhten Zelltod führen.

    5. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Aufbau und Reinigung von Hodenzellen

    1. FACS-Sammelrohre vorbereiten.
      1. 5 ml Polypropylen-Rundbodenrohre oder 1,5 ml Röhrchen mit 400 μl FBS zur Zellkollektion beschichten. Dekant überschüssiges FBS nach dem Beschichten.
      2. FACS-Sammelmedium (1x DMEM + 10% fetales Rinderserum, FBS) zu den Röhrchen hinzufügen: 1 ml für 5 ml Röhrchen oder 100 μl für 1,5 ml Röhrchen.
    2. Setzen Sie geeignete Sortierbedingungen in Zellsortierer und Software ein.
      HINWEIS: Andere Zellsortiermaschinen und Analysesoftware können mit den unten beschriebenen ähnlichen Setup- und Gating-Strategien verwendet werden. Die hier beschriebenen Bedingungen wurden von Gaysinskaya und Bortvin 2 , Geisinger und Rodriguez-Casuriaga 3 , und Getun et al. 4
      1. Laden Sie einen Ultraviolettlaser mit 463/25-nm-Bandpaßfilter, um Hoechst-Blau und 680 nm LP-Bandpassfilter zu detektieren, um Hoechst rot zu detektieren und PI zu detektieren.
      2. Verwenden Sie einen 555DLP dichroitischen Spiegel, um Blau von roter Fluoreszenz zu unterscheiden.
      3. Verwenden Sie eine 70 μm Düse und sortieren Sie Zellen mit einer Geschwindigkeit von 1000-2000 Zellen / Sekunde.
        HINWEIS: Die Sortierleistung wird direkt durch den Durchfluss beeinflusst. Hohe Durchflussraten (> 3500 Ereignisse / s) erhöhen die Geschwindigkeit der Sortierung, führen aber zu einer Kontamination der Populationen. Siehe Referenz 12 für weitere Informationen.
    3. Stellen Sie die Tore mit Kontrollproben ein.
      1. Laden und führen Sie ungefärbte Probe.
      2. Ausschließen von Zelltrümmern auf der Grundlage von FSC vs SSC-Plot-Muster. Zelltrümmer werden im unteren linken Quadranten der Handlung auftauchen. Willkürlich die Schwelle für Zelltrümmer durch den Benutzer oder den Zellsortierer-Techniker einstellen.
      3. Gate auf einzelne Zellen durch Einstellen der Schwelle für FSC und Pulsbreite. Verschiedene Zellsortierer haben unterschiedliche Möglichkeiten, sich zu unterscheidenBeifall singlets Wenn die Pulsbreite die Zeitspiegel reflektiert, die der Laser überquert, haben einzelne Zellen im Vergleich zu mehrzelligen Aggregaten niedrigere Werte. Anpassen der Schwelle auf einem Plot für FSC vs Pulsbreite kann verwendet werden, um für Singlets zu wählen.
      4. Setzen Sie optimale Photomultiplier Röhre (PMT) Spannungen.
      5. Verwenden Sie sowohl ungefärbte als auch einfarbig gefärbte Zellen, um die Schwelle des PI- oder Hoechst-Fluoreszenzsignals festzulegen.
        HINWEIS: Es ist wichtig, die Grundlinien-PTM-Spannungen für die interessierenden Zellen zu optimieren, um für jeden Farbstoff den richtigen Fluoreszenzbereich festzulegen. Dies ist entscheidend für eine optimale Signalerkennung und Empfindlichkeit. Die ungefärbten und einfachgefärbten Kontrollzellen werden verwendet, um eine Reihe von negativ und positiv gefärbten Zellen mit PI- und / oder Hoechst-Farbstoffen zu etablieren und Rauschen in Signalen zu minimieren. Weitere Erläuterungen zur Optimierung der PMT-Spannung mit Kontrollzellen finden Sie unter Gaysinskaya und Bortvin 2
      6. Tor auf lebende ZelleS basierend auf PI-Färbung (PI-negativ) und FSC-Plot. Tote Zellen sind positiv für PI-Fluoreszenz.
      7. Stellen Sie das DNA-Inhalts-Gate ein, indem Sie ein Histogramm von Zellzahlen auf der Grundlage von Hoechst-Blau-Fluoreszenz aufzeichnen. Es sollten 3 Peaks mit zunehmenden Konzentrationen von Hoechst blauer Fluoreszenz auftreten, die haploide (1C), diploide (2C) und tetraploide (4C) Zellen darstellen. Set 3 Tore, eine für jeden Peak.
      8. Beachten Sie mindestens 500.000 Ereignisse auf FSC vs SSC-Plot, bevor Sie auf die Keimzellpopulationen gehen.
    4. Gate verschiedene Keimzellpopulationen.
      1. Load Hoechst / PI gefärbte Probe.
      2. Setzen Sie die ersten 3 Eltern-Tore, die allen Populationen gemeinsam sind.
        1. Ausschließen von Zelltrümmern auf der Basis des FSC vs SSC-Plots. Wähle Einzelstücke basierend auf dem FSC vs Pulsbreiten-Plot. Wähle lebende Zellen, indem du PI-negative Zellen schlägst.
      3. Definieren spermatogonia tor
      4. Plot PI negative Zellen auf der Grundlage von Hoechst blau und rote FluoreszenzIntensitäten. Spermatogonie erscheint als Seitenpopulation (siehe Abbildung 1 ).
      5. Definiere Tore für die verbleibenden Keimzellpopulationen. HINWEIS: Siehe Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2 für visuelle Details.
      6. Plot PI-negativen Zellen in DNA-Content-Gate.
        1. Für Spermatiden Tor der Spitze mit niedrigster Hoechst Fluoreszenz (1C).
        2. Für Spermatozyten II, Tor der Peak mit Zwischen-Hoechst-Fluoreszenz (2C).
        3. Für die Spermatozyten I, Tor der Spitze mit der höchsten Hoechst Fluoreszenz (4C).
      7. Plot Hoechst blaue und rote Fluoreszenzintensität zur Verfeinerung von Spermatozyten und Spermatiden Populationen aus DNA-Content-Toren.
    5. Sammeln Sie die ausgewählten Subpopulationstore in die zuvor vorbereiteten Sammelröhrchen. Jeder Hoden wird durchschnittlich 45 min bis 1,5 h dauern, um etwa 0,5-6,0 x 10 6 Zellen für jede Subpopulation zu sammeln.
      ANMERKUNG: Verlängerte Zell-Exposition gegenüber Hoechst maIch verschiebe die Lage der Populationen mit der Zeit. Aktualisieren Sie die Einstellungen nach 20-30 min FACS. Die maximale Ausbeute für jede Subpopulation wird abhängig von der Effizienz des Dissoziationsschrittes sein.

    6. Mikroskopische Bewertung von gereinigten Zellen

    1. Spin gesammelte Zellen bei 500-600 xg bei 4 ° C für 10 min.
    2. Zellenpellet mit 1 ml eiskalter 1x Phosphatpufferlösung (PBS) oder 1x DMEM erneut suspendieren.
      HINWEIS: Das Re-Suspensionsvolumen kann entsprechend der Anzahl der sortierten Zellen und der gewünschten Endkonzentration eingestellt werden.
    3. 4 & mgr; l gewaschene Zellen auf einen sauberen Glasschieber pipettieren und ein Deckglas legen.
    4. Fixieren Sie die verbleibenden Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und speichern Sie feste Zellen bei 4 ° C in Dunkel für zukünftige Referenz.
      1. 100 μl 4% PFA direkt in die Sammelröhrchen pipettieren.
      2. Die Röhrchen oder Pipetten kurzzeitig vortexen, um eine gute Vermischung der Zellsuspension zu gewährleisten.
    5. Visualisieren Sie die vorbereiteten Folien in einem Mikroskop mit einer UV-Lampe ausgestattet, um Hoechst Fluoreszenz unter einem 63X Ziel zu erkennen. Beziehen Sie sich auf den Ergebnisbereich - Morphologische Auswertung der sortierten Keimzellpopulationen - für weitere Details zur Identifizierung bestimmter Keimzelltypen.

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Ergebnisse

Einzelzelle Suspensionen aus der mechanischen Dissoziation von Hodengewebe

Fig. 2 vergleicht Einzelzellsuspensionen, die durch mechanische Dissoziation von Maus-Hodengewebe unter verschiedenen Bedingungen erhalten werden. Proben, die durch Verarbeiten von frischem Gewebe, ungefärbt ( Fig. 2A ) oder mit Hoechst gefärbt wurden ( Fig. 2B ), zei...

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Diskussion

In Anbetracht der hochkonservierten Chromatin-Dynamik bei der Spermatogenese bei Säugetieren war das Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zu entwickeln, um männliche Keimzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung von verschiedenen Säugetier-Hodengeweben zu isolieren ( Abbildung 1 ). Eines der größten Hindernisse bei der Anwendung eines einzelnen Workflows auf verschiedene Tiermodelle ist die Notwendigkeit von Spezies-spezifischen Anpassungen, insbesondere in Bezug auf Gewebe-Dissoziat...

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Offenlegungen

Alle Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) für Hundehunde; Jason Arand und Dr. Ted Cicero's Labor an der Washington University in St. Louis (WashU) für die Bereitstellung von Ratten-Testes und Brianne Tabers für die Unterstützung der Sammlung; Jared Hartsock und Dr. Salt's Lab bei WashU für die Meerschweinchen-Hoden; Und Dr. Michael Talcott in der Abteilung für Vergleichende Medizin bei WashU für die Mini-Schweine-Hoden. Die Autoren bestätigen auch das Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine und dem Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, für den Einsatz des Siteman Flow Cytometry Core, der mit dem Personal betriebenen Zellsortierdienst ausgestattet war. Das Siteman Cancer Center wird teilweise unterstützt von NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.

Diese Forschung wurde von einem FCT-Doktorandenstipendium [SFRH / BD / 51695/2011 an ACL] finanziert, gewährt von den United States National Institutes of Health [R01HD078641 und R01MH101810 bis DFC] und einem FCT-Forschungsvertrag [IF / 01262/2014 bis AML].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% ParaformaldehydVWR#157104% PFA, Zur Fixierung sortierter Zellen
MedimachineBD Biosciences#340588;System zur Dissoziation der Hoden
1X Dulbecco modifiziertes Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, für die Hodendissoziation
MediconBD Biosciences#340591Disaggregationspatrone für die Hodendissoziation
Fötales RinderserumThermo Scientific#10082139FBS, für FACS-Entnahme
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, für FACS-Färbung
40 & Mikro; m ZellsiebGREINER BIO-ONE#89508-342Für die Hodendissoziation
100x 15 mm PetrischaleFalcon#351029Für die Hodendissektion
5 mL Polypropylen-RundbodenröhrchenFalcon#352063Für die FACS-Entnahme
1,5 mL Eppendorf RöhrchenVWR#20170-650Für die FACS-Entnahme
3 mL Needless SpritzeBD Biosciences#309657Für die Dissoziation des Hodens
50 mL konisches RöhrchenMIDSCIFür die Dissoziation des Hodens 
PropidiumiodidInvitrogen#L7011PI, für FACS-Färbung
MoFlo Legacy-ZellsortiererBeckman Coulter#ML99030Für FACS
Summit ZellsortiersoftwareBeckman Coulter#ML99030Für FACS
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermo Scientific#AM9625PBS, Für die Mikroskopie
Mikroskopischer Objektträger aus GlasFisher Scientific#12-544-4Für die Mikroskopie
GlasdeckglasFisher Scientific#12-548-87Für die Mikroskopie
Einweg-Transferpipette (3 mL)Samco Scientific#225Für die Hodendissoziation
DNase IRoche#10104159001Für die Hodendissoziation
Chirurgische Klinge aus KohlenstoffstahlMiltex#4-111Für die Hodendissektion
Countess automatisierter ZellzählerInvitrogen#C10227Für die automatische
Zellzählung Trypanblau-Lösung (0,4%)Sigma#T8154Für die Viabilitätsfärbung
#C50R

Referenzen

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

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