Diese Arbeit beschreibt die Standardisierung eines Verfahrens, um gereinigte Keimzellpopulationen aus Hodengewebe verschiedener Säugetierarten zu erhalten. Es ist ein einfaches Protokoll, das mechanische Hodendissoziation, Färbung mit Hoechst-33342 und Propidiumjodid und FACS-Sortierung kombiniert, mit breiten Anwendungen in vergleichenden Studien der männlichen Fortpflanzungsbiologie.
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Methodenartikel
Ein standardisierter Ansatz für Multispezies Reinigung von männlichen männlichen Keimzellen durch mechanische Gewebedissoziation und Durchflusszytometrie
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) war eine der Methoden der Wahl, um angereicherte Populationen von Säugetier-Hoden-Keimzellen zu isolieren. Derzeit ermöglicht es die Unterscheidung von bis zu 9 murinen Keimzellpopulationen mit hoher Ausbeute und Reinheit. Diese hochauflösende Diskriminierung und Reinigung ist durch einzigartige Veränderungen der Chromatinstruktur und -menge in der gesamten Spermatogenese möglich. Diese Muster können durch Durchflusszytometrie von männlichen Keimzellen erfasst werden, die mit fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen wie Hoechst-33342 (Hoechst) gefärbt sind. Hierin ist eine detaillierte Beschreibung eines kürzlich entwickelten Protokolls zur Isolierung von Hodenzellen von Säugetieren. Kurz gesagt werden Einzelzellsuspensionen aus dem Hodengewebe durch mechanische Dissoziation erzeugt, mit Hoechst und Propidiumjodid (PI) doppelt gefärbt und durch Durchflusszytometrie verarbeitet. Eine serielle Gating-Strategie, einschließlich der Auswahl von lebenden Zellen (PI-negativ) mit unterschiedlichem DNA-Gehalt (Hoechst-Intensität), iS verwendet während der FACS-Sortierung, um bis zu 5 Keimzelltypen zu unterscheiden. Hierbei handelt es sich um entsprechende durchschnittliche Reinheiten (bestimmt durch mikroskopische Auswertung): Spermatogonien (66%), primäre (71%) und sekundäre (85%) Spermatozyten und Spermatiden (90%), weiter getrennt in runde (93%) und verlängert (87%) Subpopulationen. Die Ausführung des gesamten Workflows ist einfach, ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von 4 Zelltypen mit der entsprechenden FACS-Maschine und kann in weniger als 2 h durchgeführt werden. Da eine reduzierte Verarbeitungszeit entscheidend für die Erhaltung der Physiologie von ex vivo- Zellen ist, eignet sich diese Methode ideal für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Studien der männlichen Keimzellbiologie. Darüber hinaus eliminiert ein standardisiertes Protokoll für die Multispezies-Reinigung von Säugetierkeimzellen methodische Quellen von Variablen und ermöglicht es, einen einzelnen Satz von Reagenzien für verschiedene Tiermodelle zu verwenden.
Einleitung
Angesichts des Mangels an In-vitro- System, das für die Spermatogenese-Progression repräsentativ ist, und die Anwesenheit einer großen zellulären Heterogenität im Hoden, erforschen die Studien der männlichen Keimzellbiologie robuste Techniken, um angereicherte Populationen spezifischer Zelltypen zu isolieren. Die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) wurde zu diesem Zweck 1 , 2 , 3 , 4 , 5 weit verbreitet , da sie eine hohe Ausbeute und Reinheit liefert und andere Isolationsverfahren in der....
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Protokoll
Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren entsprechen den Bestimmungen des Tierstudienausschusses an der Washington University in St. Louis.
1. Vorbereitungen für das Mechanische Dissoziations-Protokoll
- Vornässen einer 50-μm-Einweg-Gewebe-Disaggregationskartusche zur Dissoziation eines ganzen murinen Hodens.
ANMERKUNG: Diese Einweg-Gewebe-Disaggregationskartusche enthält Mikroklingen, die zum Schneiden von Geweben und einem unbeweglichen Stahlgitter mit etwa 100 sechseckigen Löchern ausgelegt sind. Verschiedene Größen von Mesh für Gewebe Disaggregation Patrone sind verfügbar, um dieses Protokoll auf der G....
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Ergebnisse
Einzelzelle Suspensionen aus der mechanischen Dissoziation von Hodengewebe
Fig. 2 vergleicht Einzelzellsuspensionen, die durch mechanische Dissoziation von Maus-Hodengewebe unter verschiedenen Bedingungen erhalten werden. Proben, die durch Verarbeiten von frischem Gewebe, ungefärbt ( Fig. 2A ) oder mit Hoechst gefärbt wurden ( Fig. 2B ), zei.......
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Diskussion
In Anbetracht der hochkonservierten Chromatin-Dynamik bei der Spermatogenese bei Säugetieren war das Ziel dieser Arbeit, ein Protokoll zu entwickeln, um männliche Keimzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung von verschiedenen Säugetier-Hodengeweben zu isolieren ( Abbildung 1 ). Eines der größten Hindernisse bei der Anwendung eines einzelnen Workflows auf verschiedene Tiermodelle ist die Notwendigkeit von Spezies-spezifischen Anpassungen, insbesondere in Bezug auf Gewebe-Dissoziat.......
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Offenlegungen
Alle Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Die Autoren danken dem Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) für Hundehunde; Jason Arand und Dr. Ted Cicero's Labor an der Washington University in St. Louis (WashU) für die Bereitstellung von Ratten-Testes und Brianne Tabers für die Unterstützung der Sammlung; Jared Hartsock und Dr. Salt's Lab bei WashU für die Meerschweinchen-Hoden; Und Dr. Michael Talcott in der Abteilung für Vergleichende Medizin bei WashU für die Mini-Schweine-Hoden. Die Autoren bestätigen auch das Alvin J. Siteman Cancer Center an der Washington University School of Medicine und dem Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, für den Einsatz des Siteman Flow Cytometry Core, der mit dem ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyd | VWR | #15710 | 4% PFA, Zur Fixierung sortierter Zellen |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System zur Dissoziation der Hoden |
| 1X Dulbecco modifiziertes Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, für die Hodendissoziation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregationspatrone für die Hodendissoziation |
| Fötales Rinderserum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, für FACS-Entnahme |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, für FACS-Färbung |
| 40 & Mikro; m Zellsieb | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | Für die Hodendissoziation |
| 100x 15 mm Petrischale | Falcon | #351029 | Für die Hodendissektion |
| 5 mL Polypropylen-Rundbodenröhrchen | Falcon | #352063 | Für die FACS-Entnahme |
| 1,5 mL Eppendorf Röhrchen | VWR | #20170-650 | Für die FACS-Entnahme |
| 3 mL Needless Spritze | BD Biosciences | #309657 | Für die Dissoziation des Hodens |
| 50 mL konisches Röhrchen | MIDSCI | Für die Dissoziation des Hodens | |
| Propidiumiodid | Invitrogen | #L7011 | PI, für FACS-Färbung |
| MoFlo Legacy-Zellsortierer | Beckman Coulter | #ML99030 | Für FACS |
| Summit Zellsortiersoftware | Beckman Coulter | #ML99030 | Für FACS |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, Für die Mikroskopie |
| Mikroskopischer Objektträger aus Glas | Fisher Scientific | #12-544-4 | Für die Mikroskopie |
| Glasdeckglas | Fisher Scientific | #12-548-87 | Für die Mikroskopie |
| Einweg-Transferpipette (3 mL) | Samco Scientific | #225 | Für die Hodendissoziation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | Für die Hodendissoziation |
| Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl | Miltex | #4-111 | Für die Hodendissektion |
| Countess automatisierter Zellzähler | Invitrogen | #C10227 | Für die automatische |
| Zellzählung Trypanblau-Lösung (0,4%) | Sigma | #T8154 | Für die Viabilitätsfärbung |
Referenzen
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
