En metode til at skabe og levende billede forskellige humaniserede knoglemarv niske i mus er præsenteret. Baseret på den støttende niche, der er skabt af humane mesenkymceller, frembringer tilsætningen af humane endotelceller dannelsen af humane fartøjer, mens tilsætningen af rhBMP-2 inducerer dannelsen af humant mu kimært modent knoglevæv.
Humane hæmatopoietiske stamceller (HSCs) befinder sig i knoglemarv (BM) niche, et indviklet multifaktorialt netværk af komponenter, der producerer cytokiner, vækstfaktorer og ekstracellulær matrix. HSCs evne til at forblive hvilende, selvfornyende eller differentiere og erhverve mutationer og blive maligne afhænger af de komplekse interaktioner, de etablerer med forskellige stromale komponenter. For at observere crosstalk mellem humane HSC'er og den humane BM niche i fysiologiske og patologiske forhold, designet vi en protokol til ektopisk model og billedet en humaniseret BM niche i immunodeficiente mus. Vi viser, at brugen af forskellige cellulære komponenter muliggør dannelsen af humaniserede strukturer og muligheden for at opretholde langvarig humant hæmatopoietisk engraftment. Ved brug af to-foton mikroskopi kan vi live-image disse strukturer in situ ved single-cell-opløsningen, hvilket giver et kraftigt nyt værktøj til den funktionelle karakterisering af den humane BM mMikrovirksomhed og dets rolle i reguleringen af normal og malign hæmatopoiesis.
Cell-skæbnebeslutninger observeret i stamcellekamre er tæt reguleret af både indre og ekstrinsiske faktorer. Især er det nu almindeligt anerkendt, at BM mikromiljøet spiller en afgørende rolle i styringen af omskifteren i HSCs fra en hvilende til en aktiv tilstand, såvel som i deres selvfornyelses- eller differentierings skæbnebeslutning 1 . Endvidere viser nylige resultater, at hæmatologiske maligniteter påvirker BM-mikromiljøets funktion og peger på eksistensen af aktiv kryds mellem de to rum 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . På trods af de seneste fremskridt er der fortsat mange vigtige spørgsmål om, hvordan aktiviteten af specifikke BM-niche-komponenter bidrager til HSC-adfærd og malign transformation.
BM mikromiljøet er meget heterogent Enous og kompleks blanding af mange forskellige celletyper, hver med specialiserede funktioner. Den rigelige endoteliale (EC) og vaskulære komponent regulerer næringsstof- og metabolittenes omsætning, indgangen og udgangen af forskellige celler til og fra BM og flere HSC-funktioner 7 , 8 . Mesenkymale stromaceller (MSC'er), en heterogen population af udifferentierede stamceller og forfædre begået gennem tre forskellige linjer ( dvs. osteogen, chondrogen, en adipogen) er en anden grundlæggende komponent i BM nicheen. Disse MSC'er lokaliseres både i centrale områder af BM og i nærheden af endosteal regionen. De kan være forbundet med vaskulære strukturer og er impliceret i reguleringen af HSC-funktion 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,"> 14 , 15 .
Mange rapporter tyder på, at HSC'er bor på forskellige bestemte steder inden for margenen, og at deres funktion kan afhænge af deres præcise lokalisering. Det meste af den nuværende viden om HSCs og deres interaktion med BM mikromiljø stammer fra murine studier 1 . Anvendelsen af xenograft-modeller har udvidet denne viden til humane normale og ondartede HSC'er, engrafting inden for murine BM af immunodeficiente mus 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om dette repræsenterer en gyldig model, frembyder den stadig mange udfordringer, såsom behovet for at betinge modtagermusen i de fleste tilfælde for at tillade humant HSC-homing og engraftment eller cross-species barrieren og dens dårligt forstået indflydelse på cellecelleinteraktioner og funktioner.
Anvendelsen af neutraliserende antistoffer og genetisk modificerede mus sammen med xenotransplantation har været medvirkende til at fremhæve den komplekse dialog, som menneskelige HSC'er etablerer med deres mikro-miljøer. Introduktionen og udviklingen af intravital to-foton-konfokalmikroskopi har flyttet disse undersøgelser et skridt fremad, hvilket giver mulighed for direkte, høj opløsning og dynamisk billeddannelse af knoglemarv 19 , 20 , 21 , 22 og giver et stærkt værktøj til funktionelle Karakterisering af BM mikromiljøet og dets rolle i regulering af HSC-funktionen. For at omgå nogle af de problemer, der opstår i klassiske xenotransplantationsmodeller, er begrebet engineering en humaniseret BM struktur blevet fremhævet. Sammenlægning af biomaterialer og celleimplantationskoncepter har rapporter vist muligheden for at efterligne den humane knoglemPil mikromiljø i heterotopområderne 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dette åbner mulighed for at anvende bioengineering i musemodeller til at studere human normal og malign hæmatopoiesis 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , tumorigenese og metastase 40 , 41 , 42 , 43 , 44 .
Baseret på tidligere erfaringer inden for knoglevævsteknik og in vivo- billeddannelse 19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 beskriver vi en protokol til bioengineer og levende image-organotype humane BM-væv. Disse strukturer stammer fra implantationen af humane BM-afledte stromaceller i kollagenbaserede stilladser subkutant podet i immunodeficiente mus. I en tidligere rapport viste vi, at menneskelige MSC'er sikrer dannelsen af et humant mikromiljø, der er tilstrækkeligt til engraftment af humane hæmatopoietiske celler 45 . Herudover beskriver vi, hvordan co-implantering af anden human BM-cellulær komponentS, såsom humane endotelceller (hEC) og / eller cytokiner, der er vigtige for knogledannelse ( f.eks. HBMP2), samarbejder med hMSC'er for at generere forskellige humaniserede mikromiljøer, som kan levendegøres in situ .
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
I denne protokol beskrev vi en metode til at generere forskellige humaniserede mikromiljøer i mus og visualisere deres arkitektur via to-foton mikroskopi og histologi. De angivne repræsentative data viser gennemførligheden af tilgangen ved anvendelse af forskellige stromaceller til manipulering af humaniserede væv. Protokollen har specifikke anvendelser til undersøgelsen af humane hæmatopoietiske celler og næseafledte celler fra knoglemarv under normale og patologiske forhold. Disse applikationer indbefatter undersøgelsen af klonal evolution, lægemiddel screening og krydsning mellem humane HSC'er og stromale komponenter. I det fremvoksende område af vævsteknik er der blevet foreslået flere alternative tilgange. Tilnærmelser til noten omfatter udviklingen af 3D humaniserede BM strukturer in vitro 55 , 56 , 57 ,S = "xref"> 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 og det ortopotopiske implantat af humaniserede BM-stilladser i mus 64 . Vores tilgang har den fordel at kombinere både kompleksiteten af in vivo- systemet med den let anatomiske tilgængelighed af det humaniserede vævstransplantat.
Modifikationer og fejlfinding:
En kilde til variabilitet i denne protokol kan findes i udvælgelsen af celler, der anvendes til udsåning af stilladserne. I vores arbejde brugte vi BM-afledte hMSC'er. Imidlertid kan mesenkymceller opnås fra flere væv, som kan vise særprægede egenskaber afhængigt af oprindelsen. Derfor kan anvendelsen af hMSC'er afledt fra forskellige organer overvejes. Imidlertid bør deres evne til at danne knoglevæv in vivo testes før anvendelse på denne sideRotokol. Denne protokol anvender en kommercielt tilgængelig human endothelcellekilde ( dvs. E4ORF1-transduceret HUVEC). For nylig er brugen af organspecifikke endotelceller til forskellige formål blevet rapporteret 65 , 66 . Desuden kan anvendelsen af primære hEC'er afledt fra BM udgøre en interessant forbedring af protokollen. Derfor kan anvendelsen af forskellige kilder til endotelceller producere forskellige in vivo- resultater.
Vi brugte NSG-immunokompromitterede modtagermus til fordel for implantationen af humaniserede stilladser og for at undgå vævsafvisning. Vi udelukker ikke muligheden for at anvende denne protokol til at konstruere ektopiske knoglemarvvæv i andre musestammer. Faktisk kan rhBMP-2 inducere knogledannelse i forskellige pattedyrsmodeller 47 , 48 , 49 , 50 <sup>, 52 . Forskelle i cellelevedygtighed og langtidstransplantation forventes imidlertid at blive observeret ved anvendelse af forskellige stammer / modeller.
Timingen af stilladsgenvinding kan også være fleksibel, afhængigt af det endelige formål med eksperimentet. I den præsenterede protokol genvinder vi prøver pr. 8-12 uger efter implantation for at vurdere langsigtet hæmatopoietisk engraftment. For at studere tidlige trin i den humane BM nicheformation ( fx osteokondralvævdannelse 47 eller vaskulær udvikling) kan forskellige tidspunkter vælges.
Den levende billedteknik, vi beskrev i denne protokol, er angivet til kortvarig billeddannelse af eksplantater. Anvendelsen af et ækvilibreret kammer til opretholdelse af fysiologisk temperatur, iltspænding og CO 2 -koncentration bør overvejes i tilfælde af langvarig billeddannelse, såsom at studere motilitetsadfærd.
Kritisk stEps i protokollen:
Blandt udfordringerne relateret til protokollen vil vi fremhæve de tekniske færdigheder, der kræves for nogle trin. Mesenkymale og endotelceller bør anvendes ved lavcellepassagetal; Ellers vil de ikke være i stand til at understøtte humant hæmatopoietisk cellegradering in vivo eller til at deltage i de novo vaskulatur og knogledannelse in vivo . Vi anbefaler brug af hMSC'er og hEC'er i passager 1 – 5. Stilladsforberedelse og cellesædningstrin kræver grundlæggende cellekulturevner og kendskab til egenskaberne hos de specifikke celler, der anvendes i proceduren. Operationsprotokollen er ret ligetil, men kræver nogle øvelser. Vedligeholdelse af et aseptisk miljø for at undgå forurening af de implanterede stilladser i immunodeficiente mus er afgørende for at sikre eksperimentets succes. Prøveeksplanter og levende billeddannelse kræver kirurgisk praksis (især til brug af microdrill) og viden omMikroskop system. Endelig kræver prøvebehandling og histologi grundlæggende kendskab til de teknikker, der skal anvendes.
Begrænsninger af teknikken:
Den tilgang, vi beskriver giver mulighed for visualisering af levende humane hæmatopoietiske celler, der spiser et humaniseret knoglemarvsmiljømiljø, hvor humane endotelceller danner vaskulære strukturer og mesenkymceller, der danner knoglemarv / knoglemarvplads. Da vævet dannes in vivo , vil den endelige konstruerede stillads stadig være kimær (human og murin). Dette problem bør tages i betragtning, da det kimære væv måske ikke fuldt ud efterligner humant knoglemarvskompleksitet og miljø.
Stilladserne implanterede har en begrænset størrelse (vi forsøgte maksimalt 6,6 x 7,5 x 7 mm), og de kan derfor være vært for et begrænset antal celler til xenotransplantation. Det absolutte antal genvundne celler vil også være begrænset; Således skal antallet af implanterede stilladserBeregnes som en funktion af antallet af celler, der kræves til eksperimentet.
Den billeddannelsesapplikation, vi beskrev, er særlig nyttig til observation af store områder af levende væv i dybder på 150-200 μm fra overfladen uden at forstyrre arkitekturen og beskadige cellerne. Derfor tillader det ikke visualisering af hele stilladset. Hvis en fuldstændig scanning af vævet er påkrævet, ville standard immunofluorescensfremgangsmåder være mere passende.
Fremtidige applikationer:
Den fremtidige retning af denne bioengineerede model ville være at øge kompleksiteten af de humane komponenter i vævet. Kendskabet til og karakteriseringen af den humane BM niche har udviklet sig i de seneste år 67 , og den beskrevne protokol kan være en interessant platform til at studere funktionen af disse nye cellulære komponenter og opløselige faktorer, såvel som deres rolle i at støtte normal / malignAnt HSCs.
Desuden giver billedteknikken potentialet til intravital billeddannelse af stilladserne i longitudinale undersøgelser, hvilket ville kræve tekniske forbedringer ved billeddannelsen af stilladserne i levende bedøvede mus med genopretning efter kirurgi. Denne tilgang ville kræve yderligere skridt og er i øjeblikket under undersøgelse i laboratoriet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker personalet i kernefaciliteterne på Francis Crick Institute (Biologisk Forskningsfacilitet, In Vivo Imaging and Experimental Histopathology) og Yolanda Saavedra-Torres og Mercedes Sanchez-Garzon, dyrlægerne hos Crick og LRI, for deres værdifulde hjælp. Vi er taknemmelige for Dr. W. Gray for kritisk læsning af manuskriptet. DP blev støttet af et ikke-klinisk stipendium fra EHA. Dette arbejde blev støttet af The Francis Crick Institute, der modtager sin kernefinansiering fra Cancer Research UK (FC001045), Det Forenede Kongerige Medical Research Council (FC001045) og Welcome Trust (FC001045).
Ficoll-Paque | Ge Healthcare | 17-1440-03 | |
Cd34 positive selection Kit | Stemcell | 18056 | Store a 4°C. |
Magnet | Stemcell | 18000 | |
Anti-human CD3 antibody, clone OKT-3 | Bioxcell | BE0001-2 | Store at 4°C. Used for T cell depletion in primary AML samples. |
Cytokines (IL3, G-CSF, and TPO) | PeproTech | 200-03, 300-23 and 300-18 | For doing the stock: Dilute each one of the cytokines in 100μL of water and mix them. Add 200μL, do alicuots of 45μL and Store at -20°C. |
DMSO | Sigma | D4540 | |
FBS | Life technologies | 10270106 | Heat-inactivate at 56°C during 30 minutes, do aliquots and freeze down. Warm in 37°C water bath before use. |
MEM-α | Invitrogen | 32571-028 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Myelocult H5100 | corning | 5100 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
199 | Gibco | 41150-020 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC-FBS, Heat-inactivated | Gibco | 12662-029 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
P/S | Sigma-Aldrich | P0781 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
ECGS | Millipore | 02-102 | Dilute in culture media and use 0.22 mm filter. |
HEPES | Sigma-Aldrich | S1558-50ML | Store at 4°C. |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | Store at 4°C. |
Glutamine | Gibco | 25030 | Store at -20°C. |
Collagen 1 coated cell culture plate | corning | 354505 | |
Trypsin-EDTA solution | Thermo-Fisher | 25200056 | Store at -20°C. Warm in 37°C water bath before use. |
hMSC | Lonza | PT-2501 | Alternatively, hMSCs we also kindly provided by Dr. Dosquet (University Paris Diderot, Paris) from human bone marrow obtained during orthopaedic surgery under ethical approval 10-038 from IRB00006477. |
VeraVec HUVEC endothelial cells | Angiocrine bioscience | hVera101 | |
Human hematopoietic cells | Umbilical Cord blood or primary Acute Myeloid Leukemia (AML) samples were obtained from the Royal London Hospital (London, UK) after informed consent and protocol of use was approved by the East London Ethical Committee and carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. | ||
Gelfoam, Size 12-7mm | Pfizer | 00009-0315-08 | |
PBS | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Surgical material | Multiple | Sterile forceps, tweezers and sharp scissors. | |
Sterile tissues | Heat-sterilize paper tissues. | ||
1 ml Syringe with needle of 25G | Terumo | SS+01H25161 | |
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3473 or 3471 | |
BMP2 | Noricum | rhBMP-2 | Dilute at 5 mg/ml in acetic acid 50 mM and store at 4 °C. |
Thrombin | Sigma | T9010 | Dilute in CaCl2 2%, 500 mL per vial, and store at 4 °C. |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | Dilute at 4 mg/100 mL in PBS. Store at -20C. Warm before use. |
Tissue-culture dishes 35 mm x 10 mm | Falcon | 353001 | |
U-Botton 96 well plate | Falcon | 353077 | |
NSG mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NSG mice were a kind gift from Dr Leonard Shultz (The Jackson Laboratory). |
Chlorhexidine | G9 | Dilute 1:10 before use | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl | 5 mg/g of mouse |
Buprenorphine | Alstoe | Vetergesic | 0.1 mg/g of mouse body weight |
Isoflurane | Abbott | B506 | Induction of anaesthesia 2%, maintenance 1% |
Trimmer | Wella | Contura HS61 | |
Surgical glue | 3M | Vetbond | |
carbomer (polyacrylic acid) as Ophthalmic gel | Novartis | Viscotears Liquid Gel | |
Human Normal Immunoglobulin | Gammaplex | 10g vial | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before infusion of specific antibody. |
NT-QTracker | Invitrogen | Q21021MP | Vessel-pooling agent. Administrate 15 ml/mouse intravenously 5 min before imaging. |
AF488-hCD45 | Biolegend | 304017 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
FITC-hCD31 | BD Pharmigen | 555445 | 100 ml/mouse intravenously, 30 min before imaging. |
Super glue | Loctite | Super Glue | |
Micro-Drill Kit | IDEAL – Fisher Scientific | NC9010016 | |
Microsurgical microscope | No specific brand/company is adviced. | ||
LSM 710 NLO | Zeiss | Upright confocal microscope with motorized stage, two-photon laser and 20x 1.0 NA water immersion lens. Alternatively, a microscope with similar specifications could be used. | |
MaiTai “High Performance” fully automated 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser with DeepSee dispersion compensation | Spectra-Physics | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32294 | |
Osteosoft | Millipore | 1.01728.1000 | |
Polysine slices | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
Antigen unmasking solution | Vector | H-3300 | Store at 4 °C. Dilute 1:100 in H2O for working solution. |
Triton 100x | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A96470 | Store at 4 °C. |
Normal Goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | Store at 4 °C. |
Endomucin Antibody | Santa Cruz | sc-65495 | Store at 4 °C. |
hVimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Store at 4 °C. |
hCD31 antibody | DAKO | M0823 | Store at 4 °C. |
hCD45 antibody | DAKO | M0701 | Store at 4 °C. |
ADRP (Perilipin2) | antibodies-online | ABIN283918 | Store at 4 °C. |
Goat anti mouse secondary antibodies | Invitrogen | A11029 or A11005 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rabbit secondary antibodies | Invitrogen | A11037 or A11008 | Store at 4 °C. |
Goat anti Rat secondary antibodies | Invitrogen | A11007 or A21247 | Store at 4 °C. |
Sudan Black | Sigma | S2380 | Prepare a stock of 1% sudan black in ethanol 70%. Store at RT. Prepare working solution of 0.1% sudan black in ethanol 70% and filter using filter-paper before use. |
DAPI | Sigma | D8417 | Prepare stock in H20 at 100 mg/mg. Store at 4 °C. |
Fluorescent mounting media | Dako | S3023 | Add DAPI before use (1:400 from DAPI stock). |
Cover glass | VWR | 631-0147 |