Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Summary

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Abstract

As células estaminais hematopoiéticas humanas (HSCs) residem no nicho da medula óssea (BM), uma rede intrincada e multifatorial de componentes que produzem citoquinas, fatores de crescimento e matriz extracelular. A capacidade de HSCs para permanecer quiescente, auto-renovar ou diferenciar, e adquirir mutações e tornar-se maligno depende das interações complexas que eles estabelecem com diferentes componentes do estômago. Para observar a crosstalk entre HSCs humanos e o nicho de BM humano em condições fisiológicas e patológicas, elaboramos um protocolo para modelar ectopicamente e imagem de um nicho de BM humanizado em camundongos imunodeficientes. Mostramos que o uso de diferentes componentes celulares permite a formação de estruturas humanizadas e a oportunidade de sustentar o enxerto hematopoiético humano a longo prazo. Usando o microscópio de dois fótons, podemos viver a imagem dessas estruturas in situ com a resolução de célula única, fornecendo uma nova e poderosa ferramenta para a caracterização funcional do BM humanoIcroambiente e seu papel na regulação da hematopoiese normal e maligna.

Introduction

As decisões do destino das células observadas nos compartimentos das células estaminais são rigorosamente reguladas por fatores intrínsecos e extrínsecos. Em particular, agora é amplamente reconhecido que o microambismo do BM desempenha um papel fundamental no controle da mudança em HSCs de um estado quiescente para um estado ativo, bem como em sua decisão de destino de auto-renovação ou diferenciação ¹ . Além disso, descobertas recentes indicam que as neoplasias hematológicas afetam a função do microambiente BM, apontando para a existência de crosstalk ativo entre os dois compartimentos ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Apesar dos avanços recentes, muitas questões-chave continuam a ser sobre como a atividade de componentes específicos do nicho de BM contribuem para o comportamento de HSC e para a transformação maligna.

O microambiente do BM é um heterogêneo Mistura eneous e complexa de muitos tipos de células diferentes, cada uma com funções especializadas. O abundante componente endotelial (EC) e vascular regulamentações de nutrientes e metabolitos, a entrada e a saída de diferentes células para e do BM, e várias funções de HSC ^{7 , 8} . As células do estroma mesenquimatosas (MSCs), uma população heterogênea de células estaminais indiferenciadas e progenitores comprometidos através de três linhagens diferentes ( ie osteogênicas, condrogênicas e adipogênicas) são outro componente fundamental do nicho BM. Esses MSCs localizam ambas nas áreas centrais do BM e na proximidade da região endosteal. Eles podem estar associados a estruturas vasculares e estão implicados na regulação da função HSC ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,}"> 14 ^{, 15} .

Muitos relatórios sugerem que HSCs residem em vários sites definidos dentro da medula e que sua função pode depender de sua localização precisa. A maioria dos conhecimentos atuais sobre HSCs e sua interação com o microambiente BM derivam de estudos murinos ¹ . O uso de modelos de xenoenxerto ampliou esse conhecimento para HSCs normais e malignos humanos, injerindo dentro da BM murina de camundongos imunodeficientes ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} . Embora isso represente um modelo válido, ele ainda apresenta muitos desafios, como a necessidade de condicionar o mouse receptor na maioria dos casos para permitir o acesso e o enxerto HSC humano ou a barreira das espécies cruzadas e sua influência mal compreendida nas interações célula-célula e funções.

O uso de anticorpos neutralizantes e ratos geneticamente modificados, juntamente com o xenotransplante, tem sido fundamental para destacar o diálogo complexo que os HSCs humanos estabelecem com seus microambientes. A introdução eo desenvolvimento da microscopia confocal intravital de dois fótons movimentou esses estudos um passo adiante, permitindo a imagem direta, de alta resolução e dinâmica da medula óssea ^{19 , 20 , 21 , 22} e fornece uma ferramenta poderosa para o funcionamento Caracterização do microambiente BM e seu papel na regulação da função HSC. A fim de contornar alguns dos problemas que surgem nos modelos clássicos de xenotransplante, o conceito de engenharia de uma estrutura BM humanizada foi trazido à tona. Combinando biomateriais e conceitos de implantação celular, os relatórios mostraram a viabilidade de imitar o osso humano mMicroambiente de flecha em regiões heterotópicas ^{23 , 24 , 25 , 26 , 27} . Isso abre a possibilidade de usar a bioengenharia em modelos de ratos para estudar hematopoiese normal e maligna humana ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39} , tumorigênese e metástases ^{40 , 41 , 42 , 43, 44.}

Com base na experiência anterior na engenharia de tecidos ósseos e imagens in vivo ^{19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52} , descrevemos um protocolo para bioengenharia e tecidos organotípicos de BM organiograficos de imagem ao vivo. Essas estruturas são originárias da implantação de células de estroma derivadas de BM humanas em andaimes à base de colágeno subcutaneamente enxertados em camundongos imunodeficientes. Em um relatório anterior, demonstramos que os MSCs humanos asseguram a formação de um microambiente humano adequado para o enxerto de células hematopoiéticas humanas ⁴⁵ . Além disso, aqui descrevemos como a co-implantação de outro componente celular BM humanoS, como células endoteliais humanas (hEC) e / ou citocinas importantes para a formação óssea ( por exemplo, hBMP2), cooperam com hMSCs para gerar diferentes microambientes humanizados, que podem ser filmados ao vivo in situ .

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados sob a PPL 70/8904, aprovado pelo Ministério do Interior do Reino Unido e de acordo com as diretrizes do Cancer Research UK. O uso de amostras de sangue de cordão umbilical humano (UCB) e leucemia mielóide aguda humana primária (AML) foi aprovado pelo Comitê Ético de East London após o consentimento e foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque.

1. Bioengenharia de andaimes à base de colagénio com células hematopoiéticas humanas e estromal

NOTA: Todo o protocolo deve ser realizado em condições estéreis e com material estéril. O meio de cultura celular 1 corresponde ao meio hMSC (MEM-a, P / S e 10% hMSC-FBS); O meio de cultura celular 2 corresponde ao meio CE (M199, 20% de FBS, P / S, 10 mM de HEPES, 50 μg / mL de heparina, 2 mM de glutamina e 50 μg / mL de ECGS) e o meio de cultura de células 3 corresponde ao meio de células hematopoiéticas (H5100 E P / S).

1. Prepare o sangue do cordão umbilical mCélulas ononucleares (CB-MNCs) ou AML primária (MTC de medula óssea ou sangue periférico) usando um gradiente de densidade Ficoll-Paque, de acordo com protocolos bem estabelecidos ⁵³ .
   1. Para AML, esvazie as células T usando o anticorpo OKT.3. Incubar 4 μg de OKT.3 por 1 x 10 ⁶ AML MNCs durante 30 min à temperatura ambiente antes de lavar as células em PBS. Se necessário, criopreserve as MNCs em FBS com 10% de DMSO a 2 x 10 ⁸ células por mL.
2. Preparar culturas de células de hMSC (cultura 1) e CE (meio de cultura 2). Placa de células hMSC (ver Tabela de Materiais ) em frascos de cultura celular regulares em meio hMSC. CE de placa (veja a Tabela de Materiais ) sobre superfícies revestidas com colágeno 1 em meio CE.
3. Com 85-90% de confluência celular, remova o meio, lave duas vezes com PBS e adicione solução de tripsina-EDTA (20 μL por cm ² ).
   1. Após 5 min, verifique se as células estão separadas. Recupere as células diluyendo 1:3 com meio de cultura de células. Centrifugar a 300 xg durante 5 min e voltar a suspender no meio correspondente para cada tipo de célula e contar as células usando uma câmara de Neubauer.
   2. Use células em 2 x 10 ⁶ - 10 ⁷ células por mL. Se ambos os tipos de células precisam ser usados ​​em conjunto, misture as suspensões hMSC e EC em uma proporção de 1: 1.
4. Transfira a suspensão celular para uma seringa de insulina.
5. Usando um bisturi, corte o andaime inicial da esponja de gelatina esterilizada ( por exemplo, gelfoam) (20 mm x 60 mm x 7 mm) em 24 peças de tamanho similar (6,6 mm x 7,5 mm x 7 mm, Figura 1A e B ).
6. Reconstitua os andaimes de gelatina por imersão em PBS (5 min).
7. Um a um, coloque suavemente os andaimes sobre um tecido estéril para remover o excesso de PBS. Transfira os andaimes para um poço de uma placa de 24 poços (superfície de fixação ultra baixa) e use a seringa para injetar 50 μL contendo 10 células ⁵ - 10 ⁶ (hMSC alUm ou em combinação com hEC; Figura 1C ).
8. Repita o passo 1.7 com cada andaime até que todos os andaimes necessários sejam semeados com células estromadas.
9. Incubar durante 1 h dentro de uma incubadora de cultura de células (37 ° C e CO ₂ 5%).
10. Encha cada poço com 3 mL de meio de cultura celular 1 ( Figura 1D ) e retorne os andaimes para uma incubadora de cultura de células (37 ° C e CO ₂ 5%) para incubação durante a noite. Use o meio de cultura de células 2 se as CE forem usadas nos andaimes.
11. Destilar CB-MNCs e isolar células CD34 ⁺ deles seguindo um protocolo apropriado de kit de seção CD34 ⁺ . Suspenda as células CD34 ⁺ selecionadas no meio 3 e conte-as em uma câmara de Neubauer.
    NOTA: Aqui, as células foram usadas em uma concentração de 2 x 10 ⁶ células por mL.
    1. Se forem utilizadas amostras primárias derivadas do paciente com AML, descongelar as células, diluí-las 1:10 em FBS, centrifugá-las por 5 min a 300Xg, ressuspender as células em PBS-2% de FBS, adicionar anticorpo anti-CD3 humano (2 a 4 μg por 10 ⁶ células) e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg e ressuspender em meio celular hematopoiético suplementado com citocinas (20 ng / mL de fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), 20 ng / mL de IL-3 e 20 ng / mL de trombopoietina (TPO)). .
12. Repita as etapas 1.7 - 1.9, mas neste caso, sinta 1 x 10 ⁵ células hematopoiéticas humanas em vez de componentes estromais, como acima.
    1. Encha o poço com 3 mL de meio de cultura de células 3 ( Figura 1D ) e retorne os andaimes para uma incubadora de cultura de células (37 ° C e CO ₂ 5%) para incubação durante a noite. Use uma mistura 1: 1 de meios de cultura de células 2 e 3 Se ECs forem usados ​​nos andaimes.
13. Para apenas os andaimes portadores de proteína-2 morfogenética dos ossos humanos recombinantes (rhBMP-2), coloque suavemente os andaimes um a um sobre um tecido estéril para remover o excesso de PBS. Transfira os andaimes para um poço de uma placa de 96 poços ( Figura 1E ) e adicione 5 μL de rhBMP-2, cobrindo completamente o andaime.
    1. Adicione 20 μL de trombina seguido de 20 μL de fibrinogênio, cobrindo completamente o andaime cada vez ( Figura 1F ). Repita o procedimento para cada andaime até que todos os andaimes necessários sejam tratados e, em seguida, incubar durante 5 a 10 min a 37 ° C. Verifique se a coagulação se formou com sucesso.

2. Implantação cirúrgica de andaimes Bioengineered

NOTA: Aqui, foram usados ​​machos ou fêmeas, ratos de NSG de 6- a 12 semanas de idade. Como os animais são imunodeficientes, todos os procedimentos devem ser feitos em condições estéreis. Os passos 2.10 - 2.13 estão relacionados a estratégias de sobrevivência e cuidados pós-cirúrgicos.

1. 60 - 120 min antes da cirurgia, administrar por via subcutânea analgésicos (carprofen, 5 mg / kg de peso corporal / mouse).
2. Induzir anestesia em uma câmara com 0,5% de isoflurano e 2 L / min O ₂ . Os ratos devem ser monitorados continuamente durante o procedimento. Transfira o animal para a área cirúrgica em posição propensa para ter acesso fácil às costas. Mantenha o animal sob anestesia usando um cone do nariz fornecendo 1,5% de isoflurano e 2 L / min O ₂ . Mantenha o mouse sob anestesia durante o procedimento cirúrgico e verifique frequentemente o estado animal.
3. Enquanto estiver sob anestesia, use gel oftálmico nos olhos do mouse para evitar a secura e mantenha o mouse a 37 ° C.
4. Raspar a área cirúrgica na parte de trás do mouse usando um aparador elétrico. Para esterilizar a pele, mergulhe uma ponta de algodão em clorexidina diluída (diluída 1:10 em PBS) e use esta ponta para limpar a superfície da pele. Repita este procedimento duas vezes.
5. Usando fórceps esterilizados e um bisturi (ou tesoura), faça uma incisão total da pele de 0,5 a 0,7 cm antes do posterior. Use a pinça inseridaSob o tecido subcutâneo para fazer um bolso.
6. Insira o andaime subcutaneamente, certificando-se de que ele é colocado profundamente no bolso ( Figura 1G e H ). Feche a incisão com cola cirúrgica ( Figura 1I e J ).
7. Para tratar a dor pós-cirúrgica, administrar por via subcutânea buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal).
8. Durante a recuperação, coloque o animal do lado em uma gaiola pré-aquecida e monitore a recuperação até observar o comportamento normal.
9. Diluir medicação para dor em água (carprofen, 0,1 mg / mL de água) e fornecer aos animais como água potável durante 4 dias após a cirurgia.
10. Verifique o animal e a ferida frequentemente durante o período pós-operatório de 48 horas para possíveis efeitos adversos.

3. Tratamentos de mouse, Eutanásia e Recuperação de amostra para imagens

NOTA: A análise dos andaimes é realizada entre8 e 24 semanas após a implantação.

1. 60 min antes da imagem, manter o rato implantado quente numa caixa de aquecimento a 37 ° C e administrar por via intravenosa 100 μL de imunoglobulina humana para bloquear locais inespecíficos.
2. 30 minutos antes da imagem, administrar por via intravenosa 10 μg (por rato) de anticorpos específicos para rotular as células de interesse.
3. 5 minutos antes da imagem, administrar por via intravenosa 15 μL (diluído em 100 μL de PBS) de agente de associação de vasos marcado com fluoróforo de 655 nm (655-VPA) para visualizar estruturas vasculares.
4. Eutanizar o mouse através da deslocação cervical.
5. Usando tesoura afiada, faça uma incisão longitudinal da pele na parte de trás do mouse, perto do local de implantação original.
6. Com a ajuda de pinças e tesouras, separe cuidadosamente a pele da bolsa subcutânea onde o andaime foi implantado.
7. Segure o andaime com pinças e explante-o suavemente da pele cortando a membrana residualE um tecido que envolve o andaime com uma tesoura. Veja exemplos de andaimes a serem recuperados na Figura 2 .
8. Proteja o andaime com cola adesiva de ação rápida em uma placa de imagem (uma placa de Petri de 35 mm x 10 mm) e encha com solução salina (PBS) à temperatura ambiente.
9. Para os andaimes BMP, antes de preencher a placa com PBS, use uma microdrill cirúrgica para diluir a superfície óssea sob microscópio microscópico; Isso permite a visualização de fluoróforos e a captura de imagens de alta resolução. Use as rebarbas de 1,2 ou 1,6 mm, dependendo do tamanho do andaime.
   NOTA: O usuário perceberá quanto fazer perfuração dependendo da espessura do osso. Em geral, à medida que os andaimes BMP são vascularizados, o osso mudará de cor um pouco e se tornará mais vermelho ao aproximar-se da espessura correta para a imagem.
10. Insira a placa no palco do microscópio confocal.

4. Imagens ao vivo usando Microsc de dois fotõesOpy

NOTA: Ao usar detectores não-descodificados (NDD), use sempre o controle deslizante NDD para imagens para direcionar a fluorescência para NDD. A configuração do microscópio é fornecida na Figura 3 .

1. Ligue o microscópio e o computador, comece o software clicando em "Iniciar sistema" e vá para o modo "Aquisição".
2. Marque a caixa "Mostrar ferramentas manuais". No menu "Laser", acenda "on" o laser de dois fótons e permita que ele se aqueça e se estabilize.
3. No menu "Imaging Setup", ativar simultaneamente "Channel Mode" e "Switch track every Frame". No menu "Light Path", selecione "Non Descanted" e "Main Beher Splitter MBS 760+". Marque para ativar os quatro NDDs e configure a configuração conforme ilustrado na Figura 3 .
   NOTA: Com esta configuração, o sinal de colágeno de estruturas ósseas (segundoGeração harmônica, SHG) é coletada em 380 a 485 nm, células endotélias humanas FITC-hCD31 + e células hematopoiéticas humanas AF488-hCD45 + a 500-550 nm e 655-VPA a 640 - 690 nm.
4. No menu "Canais", ajuste o "comprimento de onda do laser" para 890 nm e a potência para 50%. Defina o "Ganho (Mestre)" para 500-600, o "Deslocamento Digital" para 0 e o "Ganho Digital" para 15 para cada canal. Ajuste esses valores uma vez que a aquisição tenha começado.
5. No "Modo de aquisição", configure os parâmetros necessários para obter imagens de alta resolução sem danificar o tecido e branquear os fluoróforos. Defina "Modo de digitalização" para "Quadro", "Tamanho da moldura" para "x512 y512," Passo de linha "para 1," Velocidade "para 9," Número de média "para 8," Profundidade do bit "para" 8 bits "," Modo "para" linha "," Direção "para" bidirecional "e" Método "para" significar ".
   1. Defina o "ZoOm "para 1 para a varredura inicial da imagem, e aumentá-la, se necessário, para se concentrar em áreas específicas.
6. Coloque a placa que contém o andaime no palco do microscópio sob a lente de imersão em água 20X, 1,0 NA e abaixe a lente até que ela toque a solução salina. Define o foco da lente no andaime usando as ocículas do microscópio, usando uma lâmpada como fonte de luz.
7. Ative o menu "Z-stack", selecione a função "Primeiro / Último" e defina o intervalo desejado entre duas fatias sub-seqüenciais ( por exemplo, pilha Z de 2 μm). Mantenha os intervalos constantes dentro da pilha Z.
8. Selecione "Live" para criar uma imagem ao vivo da amostra e ajuste o "Ganho Digital" e "Deslocamento Digital" para uma exposição ideal. Para visualizar múltiplos canais ao mesmo tempo, selecione a função "Divisão".
9. No menu "Etapa", enquanto estiver no modo "Live", digitalize a imagem e "Marcar" regiões de interEst (ROI), como a localização de células hematopoiéticas humanas e estruturas vasculares. Quando a varredura da amostra estiver completa, mude para o primeiro ROI para iniciar a imagem.
10. No modo "Live", defina a parte superior e inferior da pilha 3D Z em torno da área de interesse usando as funções "Set first" e "Set last". Uma vez terminado, defina o centro, "C." Comece a aquisição do ROI com o botão "start experiment". Veja exemplos de imagens na Figura 4 , Figura 5 e Figura 6 .
11. Uma vez concluída a aquisição, salve a imagem na pasta designada. Mude para o próximo ROI e repita o passo 4.10. Uma vez que a experiência esteja completa, remova a placa de imagem do microscópio, remova cuidadosamente a amostra da placa e limpe qualquer cola residual.
12. Prepare a amostra para a próxima técnica de análise.

5. Processo de amostraG para histologia e imunossinção

NOTA: As amostras são processadas de acordo com o protocolo descrito nas técnicas de laboratório geral da JoVE ⁵⁴ descrevendo os processos de fixação, incorporação e seccionamento da amostra. As amostras formadoras de osso devem ser tratadas durante 7 dias em um agente de decalcificação baseado em EDTA entre os processos de fixação e incorporação. A solução de bloqueio / permeabilização é tampão de 10 mM de PBS pH 7,4 com 1% de Triton X-100, albumina de soro de bovino a 1% (BSA) e 10% de soro de cabra normal (NGS).

1. Coloque as fatias em xileno durante 10 minutos), o xileno, durante 5 min, 100% de etanol durante 5 minutos, 70% de etanol durante 5 minutos, 50% de etanol durante 5 minutos, e H ₂ O durante 5 min.
2. Transfira as fatias para uma solução de trabalho anti-antígeno baseada em citrato.
3. Cozinhe as fatias por 15 min e deixe esfriar à temperatura ambiente.
4. Lave as fatias em solução 10 mM de PBS a pH 7,4 com 1% de Triton X-100 (5 min, 3 vezes).
5. Transfira o samPara a solução de bloqueio / permeabilização e incubar durante 30 min.
6. Adicionar anticorpo primário diluído em solução de bloqueio / permeabilização e incubar durante a noite a 4 ° C.
7. Lave as fatias em solução 10 mM de PBS a pH 7,4 com 1% de Triton X-100 (5 min, 3 vezes).
8. Adicione o anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio / permeabilização durante 1 h no escuro à temperatura ambiente.
9. Lavar com H ₂ O (5 min, 3 vezes).
10. Para reduzir a fluorescência do fundo, mergulhe as fatias na solução de trabalho do Sudão nobre por 10 min, no escuro e à temperatura ambiente.
11. Lave as fatias em H ₂ O (5 min, 3 vezes).
12. Monte as fatias usando meio de montagem fluorescente com DAPI (0,5 μg / mL).
13. Armazene as fatias a 4 ° C e verifique se o meio de montagem está seco antes de realizar imagens fluorescentes. Veja imagens de exemplo na Figura 7 .

Results

Na Figura 1 , são mostradas imagens representativas dos processos de implantação de células de andaimes e implantação. Na Figura 1C , note que as células são injetadas diretamente no andaime. Na Figura 1G , note que uma incisão é feita na parte de trás do mouse, onde o bolso subcutâneo é criado e o andaime é implantado. A Figura 2 mostra a morfologia bruta de diferentes andaimes implantados em ratos NSG e recuperados após 8 semanas. Observe a leve vascularização em andaimes semeados com hMSC ( Figura 2A ). A co-criação de ECs humanas com hMSCs no andaime permite a formação de vasculatura mais relevante em andaimes ( Figura 2B ). Finalmente, a presença de rhBMP-2 induz a formação óssea. Os andaimes recuperados são maiores neste caso, e são constituídos porTecido semelhante ao dos ossos.

A Figura 3 mostra a configuração de configuração do canal no microscópio para imagens ao vivo com NDD (detalhes na legenda da figura). A Figura 4 e o Vídeo 1 mostram células hematopoiéticas humanas em andaimes revestidos com hMSC. Os andaimes foram explantados 8 semanas após a implantação e após a inoculação intravenosa do anticorpo AF488-hCD45 e 655-VPA. Este procedimento permite a visualização de células hematopoiéticas humanas implantadas e a estrutura vascular por microscopia confocal de dois fótons. Neste caso, as imagens mostram vasos sanguíneos (655-VPA) em andaimes e o enxerto a longo prazo de células hematopoiéticas humanas (AF488-hCD45) no parênquima de andaime. A Figura 5 e o Vídeo 2 correspondem a andaimes humanos semeados com hECs e HMSCs. 8 semanas após a cirurgia, os andaimes foram explantados após a administração intravenosaA inoculação do anticorpo FITC-hCD31 e 655-VPA, e as imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de dois fótons, conforme mencionado anteriormente. As imagens mostram a participação de hECs na formação de vasos no andaime, resultando em uma vasculatura quimérica murino-humana.

A Figura 6A mostra dados representativos da abordagem utilizada para estimular a formação óssea em andaimes MSC. Semelhante às figuras anteriores, 8 semanas após a implantação, a inoculação intravenosa de 655-VPA foi realizada, os andaimes foram recuperados e as imagens foram adquiridas com microscopia confocal de dois fótons. Os andaimes estimulados com rhBMP-2 induzem a formação de tecido ósseo, que pode ser visualizado devido ao SHG (cor ciana nas imagens) provido pelo cálcio no osso. As imagens fornecidas também mostram a formação de cavidades e tecido endosteal vascularizado, que se assemelham muito ao tecido endostetal de BM. Na Figura 6B Video 3 , os hECs foram co-implantados com hMSCs. Os andaimes foram recuperados após a inoculação intravenosa de anticorpos FITC-hCD31 e 655-VPA, e as imagens de microscopia confocal de dois fotões mostram a participação de hECs na neovascularização em um andaime formador de osso.

A Figura 7 mostra imagens representativas da histologia, um procedimento realizado para corroborar resultados previamente descritos. As imagens imunofluorescentes mostram a vasculatura do mouse, hECs, hMSCs e células hematopoiéticas humanas enxertadas de longo prazo nas estruturas de andaimes. Os andaimes recuperados de camundongos foram fixados e utilizados para imunofluorescência. Nos andaimes formadores de osso portadores de RhBMP-2 ( Figura 7D- F ), observe a morfologia do tecido, semelhante à medula óssea madura com tecido adiposo. Neste andaime formador de osso, mostramos que hMSCs são fibroblastos, o que indicaria tEles contribuem para o tecido recém formado como células estromais. Mostramos também a expressão do marcador de adipócitos humanos, o que indicaria que os HMSCs também contribuem para a formação de tecido adiposo.

Figura 1. Imagens representativas dos processos de implantação celular e implantação. A) andaime inicial e seu método de corte usando um bisturi. B) 24 peças obtidas do andaime inicial. C) Método de remoção de células de andaimes usando uma seringa. D) andaimes sem células com meio de cultura, pronto para ser implantado. EF) Passos específicos para os andaimes formadores de osso: E) o andaime é transferido para uma placa de 96 poços, u-bottom e F) imagem representativa do método usado para adicionar rhBMP2, trombina e fibrinogênio ao andaime. GJ) Surgi Procedimento de implantação de cal sob anestesia geral: G) ferida criada no implante de pele e cadáver, H) método de implantação e IJ) procedimento de fechamento de ferida usando cola cirúrgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Diferentes Andaimes Recuperados de Ratos. Imagens representativas de andaimes MSC (esquerda), andaimes MSC + EC (meio) e MSC + EC + BMP (andaimes) (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Configuração do canal. A configuração do filtro do microscópio é mostrada. A) Existem quatro módulos detectores NDD: no primeiro módulo, existem dois cubos de filtro; O segundo e o terceiro módulos possuem um cubo de filtro cada; E o último módulo não tem cubo (não usado). O primeiro tubo fotomultiplicador (PMT) é para o canal distante (640 - 690 nm), refletindo os comprimentos de onda inferiores; Os seguintes são 380 - 485 nm, 500 - 550 nm e 555 - 625 nm (a ordem é sempre dos comprimentos de onda mais baixos para maiores). B) As emissões de fluoróforos detectáveis ​​com as configurações acima (codificadas por cores). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Andaime MSC S Permitir a formação de um nicho para células hematopoiéticas humanas. A) e B) reconstruções em 3D de pilhas Z pós-explante, após inoculação intravenosa com AF488-hCD45 (verde), para rotular células hematopoiéticas humanas e 655-VPA (magenta) m para rotular a vasculatura. As barras de escala representam 20 μm em A e B (painéis superiores) e 5 μm em B (painéis inferiores). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1. Os andaimes MSC permitem a formação de um nicho para células hematopoiéticas humanas . Reconstrução 3D de células hematopoiéticas humanas (AF488-hCD45) associadas à vasculatura (655-VPA) no andaime MSC (estruturas de colágeno: SHG, ciano). Cada pilha mede 140 x 140 μm.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Figura 5. ECs humanas participam da formação de embarcações humanizadas em andaimes MSC. Reconstrução 3D de vasculatura (655-VPA) revestida por ECs de origem humana (FITC-hCD31) em mancais MSC + EC. As barras de escala representam 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 2. As CE humanas participam da formação de embarcações humanizadas em andaimes MSC. Reconstrução 3D de CEs humanas (FITC-hCD31) que reveste o va Sculature (655-VPA) em andaimes MSC + EC. Cada pilha mede 240 x 240 μm. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Figura 6. Os andaimes portadores rhBMP-2 têm superfícies de osso e vasculatura humanizada semelhante à medula óssea. A) Reconstrução 3D de andaimes MSC + BMP mostrando a formação de estruturas ósseas (SHG-cyan) e vasculatura (655-VPA). As barras de escala representam 100 μm (esquerda), 70 μm (meio) e 50 μm (direita). B) Reconstrução 3D de andaimes MSC + EC + BMP mostrando vasos humanizados (655-VPA) alinhados com CEs humanos (FITC-hCD31). As barras de escala representam 50 μm (esquerda) e 30 μm (meio e direito).14 / 55914fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 3. Os andaimes portadores rhBMP-2 têm superfícies de osso e vasculatura humanizada semelhante à medula óssea. Reconstrução 3D do andaime MSC + VERA + BMP (osso: SHG, vasos: 655-VPA, ECs humanas: FITC-hCD31). Cada pilha mede 600 x 600 μm. Clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Figura 7. Imagens representativas da imunofluorescência realizada em andaimes fixos. AF) Estudos de imunofluorescência realizados para localizar células humanas implantadas iN andaimes. AC) Andaimes implantados com hECs, hMSCs e hHSCs. DF) andaimes formadores de ossos implantados com hECs, hMSCs e hHSCs. Os canais de cor são os seguintes: AD) CE humana (hCD31) e estrutura vascular do mouse (endomucina, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) e células vasculares do mouse (endomucina, ENDOM), C) células hematopoiéticas humanas (hCD45) E vasculatura do mouse (endomucina, ENDOM) e F) proteína relacionada à diferenciação adiposa humana (HADRP) e vasculatura do mouse (endomucina, ENDOM). As barras de escala representam 10 μm (A e C), 20 μm (B e E) e 40 (D e F) μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Significado do respeito aos métodos existentes:

Neste protocolo, descrevemos um método para gerar diferentes microambientes humanizados em camundongos e para visualizar sua arquitetura através de microscopia e histologia de dois fótons. Os dados representativos fornecidos mostram a viabilidade da abordagem, utilizando diferentes células estromadas para engenharia de tecidos humanizados. O protocolo tem aplicações específicas para o estudo de células hematopoiéticas humanas e células derivadas de nódulos da medula óssea em condições normais e patológicas. Essas aplicações incluem o estudo da evolução clonal, triagem de drogas e crosstalk entre HSC humanos e componentes estromais. No campo emergente da engenharia de tecidos, várias abordagens alternativas foram propostas. As abordagens da nota incluem o desenvolvimento de estruturas 3D humanizadas 3D in vitro ^{55 , 56 , 57 ,}S = "xref"> 58 ^{, 59 , 60 , 61 , 62 , 63} e o enxerto ortotópico de andaimes BM humanizados em camundongos ⁶⁴ . Nossa abordagem tem a vantagem de combinar a complexidade do sistema in vivo com a acessibilidade anatômica fácil do enxerto de tecido humanizado.

Modificações e Solução de Problemas:

Uma fonte de variabilidade neste protocolo pode ser encontrada na seleção de células usadas para semear os andaimes. Em nosso trabalho, utilizamos os hMSC derivados do BM. No entanto, as células mesenquimais podem ser obtidas a partir de vários tecidos, o que pode mostrar propriedades distintivas dependendo da origem. Portanto, o uso de hMSCs derivados de diferentes órgãos pode ser considerado. No entanto, a sua capacidade de formar tecido ósseo in vivo deve ser testada antes da utilização nesta pEste protocolo usa uma fonte de células endoteliais humanas comercialmente disponível ( ou seja, HUVEC transduzida com E4ORF1). Recentemente, o uso de células endoteliais específicas de órgãos para diferentes propósitos foi relatado ^{65 , 66} . Além disso, o uso de primarias primárias derivadas do BM poderia representar uma melhoria interessante para o protocolo. Portanto, o uso de diferentes fontes de células endoteliais pode produzir diferentes resultados in vivo .

Utilizamos ratos receptores imunocomprometidos NSG para favorecer a implantação de andaimes humanizados e evitar a rejeição tecidual. Não excluímos a possibilidade de usar este protocolo para engenharia de tecidos ectópicos de medula óssea em outras cepas de mouse. De fato, rhBMP-2 pode induzir a formação óssea em diferentes modelos de mamíferos ^{47 , 48 , 49 , 50 , 52 . No entanto, as diferenças na viabilidade celular e no transplante a longo prazo provavelmente serão observadas usando diferentes cepas / modelos.}

O tempo de recuperação do andaime também pode ser flexível, dependendo do propósito final da experiência. No protocolo apresentado, recuperamos amostras às 8 a 12 semanas após a implantação para avaliar o enxerto hematopoiético de longo prazo. Para estudar os primeiros passos da formação de nicho BM humano ( por exemplo, formação de tecido osteocondral ⁴⁷ ou desenvolvimento vascular), diferentes pontos de tempo podem ser escolhidos.

A técnica de imagem ao vivo que descrevemos neste protocolo é indicada para imagens de curto prazo de explantes. O uso de uma câmara equilibrada para manter a temperatura fisiológica, a tensão do oxigênio e a concentração de CO ₂ deve ser considerado em casos de imagem de longo prazo, como estudar comportamentos de motilidade.

St críticoEps dentro do protocolo:

Entre os desafios relacionados ao protocolo, destacamos as habilidades técnicas necessárias para algumas etapas. As células mesenquimatosas e endoteliais devem ser usadas em números de passagem de células baixas; Caso contrário, eles não serão capazes de suportar o enxerto de células hematopoiéticas humanas in vivo ou participar de formação de novo e formação óssea in vivo . Recomendamos o uso de hMSCs e hECs nas passagens 1 - 5. A preparação do andaime e as etapas de semente celular requerem habilidades básicas de cultura celular e conhecimento das propriedades das células específicas usadas no procedimento. O protocolo de cirurgia é bastante direto, mas requer alguma prática. A manutenção de um ambiente asséptico para evitar a contaminação dos andaimes implantados em camundongos imunodeficientes é crucial para garantir o sucesso do experimento. O explante de amostras e a imagem ao vivo requerem prática cirúrgica (especialmente para o uso da microdrill) e conhecimento daSistema de microscópio. Finalmente, processamento de amostras e histologia exigem conhecimento básico das técnicas a serem utilizadas.

Limitações da técnica:

A abordagem que descrevemos permite a visualização de células hematopoiéticas humanas vivas que semeiam um microambiente humanizado da medula óssea, com células endoteliais humanas formando estruturas vasculares e células mesenquimais formando espaço ósseo / medula óssea. À medida que o tecido é formado in vivo , o andaime de engenharia final ainda será quimérico (humano e murino). Esta questão deve ser levada em consideração, já que o tecido quimérico pode não imitar completamente a complexidade e o meio da medula óssea humana.

Os andaimes implantados têm um tamanho limitado (tentamos um máximo de 6,6 x 7,5 x 7 mm) e, portanto, eles são capazes de hospedar um número limitado de células para o xenotransplante. O número absoluto de células recuperadas também será limitado; Assim, o número de andaimes implantados deveSer calculado como uma função do número de células necessárias para a experiência.

O aplicativo de imagem que descrevemos é particularmente útil para observar grandes áreas de tecido vivo em profundidades de 150-200 μm da superfície sem interromper a arquitetura e danificar as células. Portanto, não permite a visualização de todo o andaime. Se for necessária uma varredura completa do tecido, as abordagens padrão de imunofluorescência seriam mais apropriadas.

Futuras Aplicações:

A direção futura desse modelo de bioengenharia seria aumentar a complexidade dos componentes humanos no tecido. O conhecimento e a caracterização do nicho BM humano progrediram nos últimos anos ⁶⁷ e o protocolo descrito pode ser uma plataforma interessante para estudar a função desses novos componentes celulares e fatores solúveis, bem como seu papel no suporte normal / malignoHSCs formigas.

Além disso, a técnica de imagem fornece o potencial de imagem intravítica dos andaimes em estudos longitudinais, o que exigiria melhorias técnicas na imagem dos andaimes em ratos vivos anestesiados, com recuperação pós-cirúrgica. Esta abordagem exigiria etapas adicionais e está atualmente sob investigação no laboratório.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	Ge Healthcare	17-1440-03
Cd34 Kit de seleção positiva	Stemcell	18056	Armazene um 4°C.
Magnet	Stemcell	18000
Anti-humano CD3 anticorpo, clone OKT-3	Bioxcell	BE0001-2	Armazenar a 4°C. Usado para depleção de células T em amostras primárias de LMA.
Citocinas (IL3, G-CSF e TPO)	PeproTech	200-03, 300-23 e 300-18	Para fazer o estoque: Diluir cada uma das citocinas em 100 μ L de água e misture-os. Adicione 200 μ L, faça alicuots de 45 μ L e armazene a -20 ° C.
DMSO	Sigma	D4540
FBS	Tecnologias de vida	10270106	Inativar o calor em 56 &graus; C durante 30 min, faça alíquotas e congele. Quente em 37 > C banho-maria antes de usar.
MEM-&alfa;	Invitrogen	32571-028	Armazenar a 4 graus C. Quente em 37 graus C banho-maria antes de usar.
Myelocult H5100	corning	5100	Loja em 4 °C. Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
199	Gibco	41150-020	Loja em 4 graus C. Quente em 37 graus C banho-maria antes de usar.
hMSC-FBS, Gibco		12662-029	Armazenar a -20 °C. Quente em 37 °C; C banho-maria antes de usar.
P / S	Sigma-Aldrich	P0781	Loja em -20 ° C. Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar.
ECGS	Millipore	02-102	Diluir em meio de cultura e usar filtro de 0,22 mm.
HEPES	Sigma-Aldrich	S1558-50ML	Loja em 4 ° C.
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149	Loja em 4 ° C.
Glutamina	Gibco	25030	Armazenar a -20 °C.
Placa de cultura celular revestida com colágeno 1	corning	354505
solução de tripsina-EDTA	Thermo-Fisher	25200056	Armazenar a -20 ° C. Quente em 37 ° C; C banho-maria antes de usar.
hMSC	Lonza	PT-2501	Alternativamente, hMSCs também gentilmente cedidos pelo Dr. Dosquet (Universidade Paris Diderot, Paris) de medula óssea humana obtida durante cirurgia ortopédica sob aprovação ética 10-038 de IRB00006477.
Células endoteliais VeraVec HUVEC	Biociência angiocrina	hVera101	Alternativamente, outra fonte de células endoteliais humanas pode ser usada.
		hematopoiéticas humanas	Sangue do cordão umbilical ou leucemia mielóide aguda primária (LMA) amostras foram obtidas do Royal London Hospital (Londres, Reino Unido) após consentimento informado e protocolo de uso aprovado pelo Comitê de Ética do Leste de Londres e realizado de acordo com a Declaração de Helsinque.
Gelfoam, Tamanho 12 - 7mm	Pfizer	00009-0315-08	Fornecedor alternativo: Febelco
PBS	Thermo-Fisher	10010023
Material cirúrgico	Pinças estéreis múltiplas		, pinças e tesouras afiadas.
		estéreis	Esterilize os tecidos de papel por calor.
Seringa de 1 mL com agulha de 25G	Terumo	SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3473 ou 3471
BMP2	Noricum	rhBMP-2	Diluir a 5 mg/mL em ácido acético 50 mM e armazenar a 4 °C.
Trombina	Sigma	T8885	Diluir em CaCl2 2%, 500 mL por frasco e armazenar a 4 °C.
Fibrinogênio	Sigma	F3879	Diluir a 4 mg / 100 mL em PBS. Armazene a -20 ° C. Aqueça antes de usar.
Placas de cultura de tecidos 35 mm x 10 mm	Falcon	353001
U-Botton placa de 96 poços	Camundongos Falcon	353077
NSG	Os	5557	NSG foram um presente gentil do Dr. Leonard Shultz (The Jackson Laboratory).
Clorexidina	G9		Diluir 1:10 antes do uso
Carprofeno	Pfizer	Rimadyl	5 mg/kg de camundongo
Buprenorfina	Alstoe	Vetergesic	0,1 mg/kg de peso corporal do camundongo
Isoflurano	Abbott	B506	Indução de anestesia 2%, manutenção 1%
Trimmer	Wella	Contura HS61
Cola cirúrgica	Carbômero 3M	Vetbond
(ácido poliacrílico) como gel oftálmico	Novartis	Viscotears Gel
Imunoglobulina Humana Normal	Gammaplex	frasco de 10g 100	mL/camundongo por via intravenosa, 30 min antes da infusão de anticorpo específico.
NT-QTracker	Invitrogen	Q21021MP	agente de pooling de vasos. Administre 15 mL / camundongo por via intravenosa 5 min antes da imagem.
AF488-hCD45	Biolegend	304017	100 mL/camundongo por via intravenosa, 30 min antes da imagem.
FITC-hCD31	BD Pharmigen	555445	100 mL/camundongo por via intravenosa, 30 min antes da imagem.
Super cola	Loctite	Super Glue
Micro-Drill Kit	IDEAL - Fisher Scientific	NC9010016
Microscópio			Nenhuma marca/empresa específica é aconselhada.
LSM 710 NLO	Zeiss		Microscópio confocal vertical com platina motorizada, laser de dois fótons e lente de imersão em água 20X 1,0 NA. Alternativamente, um microscópio com especificações semelhantes pode ser usado.
MaiTai " Alto desempenho" totalmente automatizado 1-box 517 mode-locked Ti:Sapphire laser com compensação de dispersão	DeepSee Spectra-Physics
Solução de formalina, tamponado neutro, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Etanol	Sigma-Aldrich	32294
Osteosoft	Millipore	1.01728.1000
Fatias de polisina	Thermo scientific	J2800AMNZ
Solução de desmascaramento de antígeno	Vector	H-3300	Armazenar a 4 °C. Diluir 1:100 em H2O para solução de trabalho.
Triton 100x	Sigma-Aldrich	T9284
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A96470	Armazene em 4 °C.
Soro de cabra normal (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	Armazenar a 4 ° C.
Anticorpo de endomucina	Santa Cruz	sc-65495	Armazenar a 4 °C.
anticorpo de vimentina	Santa Cruz	sc-6260	Armazenar a 4 °C.
anticorpo hCD31	DAKO	M0823	Armazenar a 4 °C.
anticorpo hCD45	DAKO	M0701	Armazene a 4 ° C.
Anticorpos ADRP (Perilipin2)	-online	ABIN283918	Armazenar a 4 °C.
Anticorpos secundários anti-rato caprino	Invitrogen	A11029 ou A11005	Armazenar a 4 °C.
Anticorpos secundários anti-coelho caprino	Invitrogen	A11037 ou A11008	Armazenar a 4 °C.
Anticorpos secundários anti-rato de cabra	Invitrogen	A11007 ou A21247	Armazenar a 4 °C.
Sudão Black	Sigma	S2380	Prepare um estoque de 1% de preto do Sudão em etanol 70%. Armazene em RT. Prepare a solução de trabalho de 0,1% de preto de sudão em etanol 70% e filtre usando papel de filtro antes de usar.
DAPI	Sigma	D8417	Preparar o estoque em H20 a 100 mg/mg. Armazenar a 4 °C.
Mídia de montagem fluorescente	Dako	S3023	Adicione DAPI antes de usar (1:400 do estoque DAPI).
Vidro de cobertura	VWR	631-0147