Methodenartikel

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

DOI:

10.3791/55918

⸱

26. Juli 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Satellitenzellen (SC) sind Muskelstammzellen zwischen der Plasmamembran von Muskelfasern und der umgebenden Basallamina. Sie sind für die Muskelregeneration essentiell. Bei Verletzungen, die häufig in Skelettmuskeln auftreten, werden SCs aktiviert. Sie vermehren sich als Myoblasten und differenzieren, um Muskelläsionen zu reparieren. Unter vielen Ereignissen, die während der Muskeldifferenzierung stattfinden, sind zytosolische Ca 2+ -Signale von großer Bedeutung. Diese Ca 2+ -Signale ergeben sich aus der Ca 2+ - Freisetzung aus internen Ca 2+ - Speichern sowie aus dem Ca 2+ - Eintrag aus dem extrazellulären Raum, insbesondere dem speicherbetriebenen Ca 2+ - Eintrag (SOCE). Dieses Papier beschreibt eine Methodik, die verwendet wird, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus Muskelproben zu erhalten, die nach orthopädischer Chirurgie gesammelt wurden. Das Gewebe wird mechanisch und enzymatisch verdaut, und die Zellen werden amplifiziert und dann nach Durchflusszytometrie nach der Anwesenheit von speci sortiertFische Membranmarker Einmal erhalten, werden menschliche Myoblasten erweitert und verpflichtet, durch die Entfernung von Wachstumsfaktoren aus dem Kulturmedium zu differenzieren. Die Expressionsniveaus spezifischer Transkriptionsfaktoren und in vitro Immunfluoreszenz werden verwendet, um den myogenen Differenzierungsprozess unter Kontrollbedingungen und nach dem Schweigen von Proteinen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind, zu bewerten. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von Fura-2 als ratiometrische Ca 2+ -Sonde, die zuverlässige und reproduzierbare Messungen von SOCE liefert.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die menschlichen Skelettmuskeln bestehen aus Gruppen von kontraktilen, mehrkernigen Muskelfasern, die aus der Fusion von myogenen Vorläuferzellen resultieren. Skelettmuskeln haben die Fähigkeit, nach Verletzung durch die Anwesenheit von SCs, die Skelettmuskel Stammzellen zwischen der Plasmamembran von Myofasern (Sarkolemma) und der Basallamina zu regenerieren. Im unverletzten Muskel sind die SCs meist in einem Ruhezustand. Als Reaktion auf mechanische Beanspruchung oder Verletzung werden die SCs aktiviert (Myoblasten), proliferieren und unterziehen sich entweder der Differenzierung, um neue Myofasern zu bilden oder sich selbst zu erneuern, um den SC-Pool 1 , 2 wieder aufzufüllen. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Techniken entwickelt, um SCs und ihre Nachkommen, die Myoblasten, von Skelettmuskelbiopsien zu isolieren. Mit dem besseren Verständnis der auf diesen Zellen exprimierten Zelloberflächenmarker und der Methodik der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) 3, 4 , 5 ist es nun möglich, reine Populationen menschlicher Myoblasten aus Muskelproben zu isolieren.

Calcium-Signalisierung reguliert Skelettmuskelentwicklung, Homöostase und Regeneration. Insbesondere ist der Ca 2+ Eintrag, die folgenden intrazellulären Speicherentleerung aktiviert, SOCE genannt wird , ist von großer Bedeutung , 6 für diese Prozesse. Bei der Zellstimulation nimmt der Ca 2+ -Pegel im endo / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) ab, was wiederum Plasma-Membran-Ca 2+ -Kanäle aktiviert, die den Eintritt von Ca 2+ zum Nachfüllen des ER / SR 7 ermöglichen . Die beiden Hauptproteine, die an SOCE beteiligt sind, sind das ER / SR Ca 2+ -sensing stromal Interaktionsmolekül 1 (STIM1) Protein und die Plasmamembran Ca 2+ Kanal Orai1. Skelettmuskel drückt diese beiden Proteine, sowie andere Proteine ​​der gleichen Familien (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 und mehrere Ca 2+ -permeable Kanäle der transienten Rezeptorpotential kanonischen (TRPC) Familie 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ Eintritt durch den SOCE-Weg ist von großer Bedeutung für die Muskelbildung / Regeneration 14 . Mutationen von STIM1- oder Orai1-Proteinen haben schädliche Wirkungen auf die Muskelfunktion, was vor allem auf Muskel-Hypotonie 15 führt . Tiermodelle mit SOCE-Beeinträchtigung zeigen auch reduzierte Muskelmasse und Kraft, zusammen mit erhöhter Ermüdbarkeit 6 , 16 , 17 . Wie bereits erwähnt, werden andere STIM- und Orai-Proteine ​​sowie viele TRPC-Kanäle im Skelettmuskel ausgedrückt und ihre jeweiligen Rollen wurden bisher nicht bestimmt. Durch klopfen dBesitzen ihre Ausdrucksstufe, es ist also möglich, ihre Implikationen in SOCE und ihre Rollen während der menschlichen Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen.

Die SOCE-Messung kann mit zwei verschiedenen Ansätzen durchgeführt werden: elektrophysiologische Stromaufnahmen und Ca 2+ -Messungen. Die Elektrophysiologie ist sicherlich eine direktere Methode, da sie den aktuellen Interesse und die damit verbundene elektrophysiologische Signatur misst. Allerdings ist diese Technik sehr schwierig, auf Muskelzellen anzuwenden, vor allem wegen der großen Größe der Muskelzellen und der geringen Größe des endogenen SOCE-Stroms. Die zytosolische Ca 2+ -Bildgebung ist technisch sehr zugänglich, aber die Maßnahme ist indirekt, da das im Cytosol gemessene Ca 2+ -Gehalt sowohl den Eintritt von Ca 2+ als auch das erneute Pumpen aus der Zelle oder in den internen Geschäften widerspiegelt.

Eine Methodik, die die Isolierung von Myoblasten von kleinen Stücken menschlichen Skels beinhaltetEtal Muskel nach enzymatischen Verdauung, Amplifikation und FACS ist in diesem Papier erklärt. Der Prozess der Muskeldifferenzierung und des Immunfluoreszenzprotokolls, um der Expression von Differenzierungsmarkern im Laufe der Zeit zu folgen, sind beschrieben 18 . Schließlich werden die Messung von SOCE und die Rolle der verschiedenen Ionenkanäle in Ca 2+ -Signalisierung und Skelettmuskeldifferenzierung erläutert.

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Protokoll

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Menschliche Muskelproben (Gewebe aus semitendinösen Muskeln) wurden während der orthopädischen Chirurgie bei gesunden Patienten als chirurgischen Abfall gesammelt. Alle Methoden der menschlichen Studie wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften der schweizerischen Regulatory Health Authorities durchgeführt und von der Kommission Cantonale d'Ethique de la Recherche von den Genfer Kantonalbehörden, Schweiz (Protokoll CER n ° 12-259) . Informiert und schriftliche Zustimmungen wurden von allen erwachsenen Fächern, die an der Studie beteiligt waren, erhalten.

1. Isolierung von Myoblasten aus dem menschlichen Skelettmuskel

  1. Während aller Verfahren, halten sterile Bedingungen durch die Arbeit unter einer Ebene II Gewebekultur Haube und mit sterilen Medium und sterilen Puffer.
    Anmerkung: Dieses Verfahren kann auf viele menschliche Skelettmuskeln angewendet werden.

2. Dissoziations-Protokoll

  1. Übertragen Sie Muskelproben (2 - 3 g) in eine sterile 6 cmTeller.
  2. Waschen Sie die Muskelproben mit 5 - 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie die Wäsche.
  3. Entfernen Sie Binde- und Fettgewebe mit einer gebogenen Schere und einer Klemme.
  4. Wiegen Sie die Muskelprobe (siehe Schritt 2.13) und übertragen Sie sie auf eine neue sterile 6 cm Platte.
  5. Füge 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzu.
  6. Mit Scheren, schneiden und zerkleinern das Muskelgewebe in kleine Stücke (weniger als 2 mm).
  7. Mit einer 10 mL serologischen Pipette den gemahlenen Muskel auf eine 200 ml Dissoziationsflasche mit einem Magnetstab übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis 90 ml von 0,05% Trypsin-EDTA mit allen gehackten Muskeln auf die Dissoziationsbox übertragen wurden. Schließen Sie die Dissoziationsflasche und inkubieren bei 37 ° C für 60 min unter leichter Bewegung.
  8. Entfernen Sie die Dissoziationsflasche aus dem Heizbad und stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 10 ml fötalem Kälberserum (FCS, 10% Endvolumen) zur Dissoziationsflasche. Die Mischung mit einer Pipette homogenisieren.
  9. VorbereitungSind zwei 50 mL Röhrchen mit jeweils 70 μm Zellsieb. Führen Sie die Hälfte der Zellsuspension durch das Zellsieb auf jedem Rohr durch Pipettieren auf und ab auf den Filter, bis die Suspension durchläuft.
  10. Die Röhrchen bei 200 xg und 20 ° C für 5 min zentrifugieren; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
  11. Resuspendieren der Zellen mit 10 ml Wachstumsmedium (GM, Tabelle 1 ) und Durchleiten der Zellen durch ein 40 μm-Zellsieb, das auf einem 50 ml-Röhrchen platziert ist. Das Röhrchen bei 200 xg und 20 ° C für 5 min zentrifugieren; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
  12. Resuspendieren der Zellen mit 10 ml GM und Zentrifugieren des Röhrchens bei 200 xg und 20 ° C für 5 min; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
  13. Resuspendieren Sie die Zellen mit 1 ml GM und zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Kammer.
    Hinweis: Normalerweise sollte eine Ausbeute von 3 x 10 5 Zellen pro g Muskel geerntet werden. Die Ausbeute wird berechnet, indem man die Anzahl der Zellen durch das Gewicht des Muskelbiops dividiertSy (Schritt 2.4).
  14. Setzen Sie 2 x 10 5 Zellen in eine sterile 6-cm-Platte mit 4 ml GM und inkubieren bei 37 ° C und 7% CO 2 . Bereiten Sie so viele Platten wie nötig vor.
  15. Ändern Sie den GM nach 3 Tagen.
    Hinweis: Frisch dissoziierte Zellen brauchen Zeit, um an der Kulturplatte zu haften. Darüber hinaus ist die erste myogene Zellverdopplungszeit etwa 50 - 60 h. Nach der ersten Teilung beträgt die Verdopplungszeit ca. 20 h.
  16. Nach 5 - 7 Tagen, wenn Zellen 70 - 80% Konfluenz erreichen (ca. 1,5 x 10 6 Zellen / pro 6 cm Platte), beginnen Antikörperfärbung und Zellsortierung (Schritt 3).

3. Antikörperfärbung und Zellsortierung

  1. Nach einmaligem Spülen mit PBS inkubieren die adhärenten Zellen (in der 6-cm-Platte) mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C und 7% CO 2 für 3 min (oder inkubieren bei 5% CO 2 ). Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ml GM und sammeln Sie die Zellen in 15 ml Röhrchen. Nach der Zentrifugation (200 xg für 5 min), resDie Zellen in 1 ml GM verteilen.
  2. Zähle die Zellen mit einer Neubauer Kammer.
  3. Führen Sie die folgenden Verfahren auf Eis durch.
    Hinweis: Die Vorgehensweise zur Einstellung der korrekten Fluoreszenzkompensation am Zytometer ist unbedingt erforderlich und sollte bei jedem Zytometer ähnlich sein. Die Röhrchen 1 und 2 werden als Negativkontrollen verwendet. Die Röhrchen 3 - 7 dienen zur Einstellung der Kompensation am Zytometer während des ersten Experiments ( Tabelle 2 ). Die endgültige Konzentration, die für jeden Antikörper und seinen entsprechenden Isotyp verwendet wird, sollte derselbe sein (etwa 1 & mgr; g / 10 6 Zellen).
  4. Versand 1 x 10 5 Zellen pro Röhrchen (5-ml-Röhrchen) für Röhrchen 1 - 7 ( Tabelle 2 ). Legen Sie die restliche Zellsuspension in das Rohr 8 für die Zellsortierung.
  5. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml kaltem FACS-Puffer (PBS-5% FCS). Schließen und zentrifugieren die Röhrchen bei 200 xg und 4 ° C für 5 min; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
  6. 200 μl FACS-Puffer pro Röhrchen zugeben. Füge Antikörper gegen th hinzuE Rohr nach Tabelle 2 . Inkubieren auf Eis für 30 min.
  7. Waschen Sie die Zellen: Fügen Sie 1 ml des FACS-Puffers zu jedem Röhrchen hinzu. Schließen und zentrifugieren die Röhrchen bei 200 xg und 4 ° C für 5 min. Absaugen und verwerfen den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  8. Resuspendieren der Zellen in 500 μl FACS-Puffer. Schließen Sie die Röhren und halten Sie sie auf Eis, bis Zellsortierung. Bereiten Sie 4 Röhrchen von 1,5 ml vor, die jeweils 500 μl GM enthalten, was notwendig ist, um die Zellen während der Zellsortierung zu sammeln. Halten Sie sie auf Eis.
  9. Sortieren Sie menschliche Myoblasten durch Durchflusszytometrie ( Abbildung 1 ). Nach dem Ausschluss von CD45-positiven hämatopoetischen Zellen, getrennt CD45-negativen Zellen auf der Basis von CD56-Expression. Dann gib die CD56-positive Population für CD34, CD144 und CD146 (menschliche Myoblasten sind als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-Zellen definiert). Reanalyse einen kleinen Bruchteil der sortierten Zellpopulation, um die Reinheit zu überprüfen.
  10. Pool die Röhren mit menschlichen MyoblaM in einem 15-ml-Röhrchen und waschen Sie sich einmal durch Zugabe von 5 ml GM. Das Röhrchen bei 200 xg und 20 ° C für 5 min zentrifugieren; Aspirieren und den Überstand verwerfen.
  11. Die Zellen in 1 ml GM resuspendieren und die Zellen auf einer unbeschichteten 6-cm-Platte mit 4 ml GM (2 x 10 5 Zellen pro Platte) auftragen. Inkubieren bei 37 ° C und 7% CO 2 .

4. Zellpflege

  1. Ändern Sie die Hälfte des Kulturmediums alle 2 Tage. Entfernen Sie 2 ml alten GM aus der Kulturschale und fügen Sie 2 ml GM hinzu.
    Hinweis: Myoblasten erzeugen Wachstumsfaktoren, die für die Kulturbedingungen von Vorteil sind.
  2. Trypsinize die Zellen, wenn sie 70 - 80% Konfluenz erreichen, um Vordifferenzierung zu vermeiden. Nach einmaligem Spülen mit PBS inkubieren die adhärenten Zellen (in der 6-cm-Platte) mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C und 7% CO 2 für 3 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ml GM und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Nach der Zentrifugation (200 xg für 5 min), resusHängen die Zellen in 1 ml GM.
  3. Zählen Sie die Zellen und bereiten 6 cm Platten mit 2 x 10 5 Zellen pro Platte in 4 ml GM.
  4. Halten Sie menschliche Myoblasten bis zu 6 Passagen oder frieren sie in GM mit 10% DMSO, 1 x 10 6 Zellen pro ml. Gefrieren Sie die Zellen in einer progressiven Gefrierbox (1 ° C / min); Für die Langzeitlagerung legen Sie die Zellen in flüssigen Stickstoff.

5. Transfektion von humanen Myoblasten mit siRNA

Anmerkung: Myoblasten werden mit handelsüblichem Transfektionsreagenz zwei Tage vor der Induktion der Differenzierung transfiziert. Die Wirkung von spezifischer siRNA gegen ein Gen wird immer mit der Wirkung einer Kontroll-siRNA verglichen. SiRNAs sind doppelsträngige RNAs, die auf Eis gehalten und mit Handschuhen manipuliert werden müssen.

  1. Erhalten Sie eine 70 - 80% konfluierende Monolage von menschlichen Myoblasten in einer 6-cm-Platte (ca. 1,5 x 10 6 Zellen).
    Anmerkung: 5 x 10 5 Zellen pro Transfektion werden benötigt, um eine con zu erhaltenFließend Monolayer von transfizierten Myoblasten nach 2 Tagen in GM.
  2. Vorbereiten von Glasdeckgläschen (beschrieben für die Kalziumabbildung in Schritt 7).
  3. Warmes GM, 0,05% Trypsin-EDTA und PBS auf 37 ° C.
  4. Führen Sie alle folgenden Schritte in einer Stufe II Gewebekulturhaube durch, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.
  5. In einem 1,5-ml-Röhrchen werden 500 & mgr; l reduziertes Serummedium, 3 & mgr; l Transfektionsreagenz und 1 & mgr; l siRNA mit 20 & mgr; M versetzt. Mischen Sie vorsichtig und halten Sie bei Raumtemperatur (RT) für 15 - 20 min.
  6. Während dieser Inkubationszeit die Myoblasten zur Transfektion vorbereiten. Nach einmaligem Spülen mit PBS inkubieren die adhärenten Zellen (in der 6-cm-Platte) mit 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA bei 37 ° C und 7% CO 2 für 3 min. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 ml GM und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Nach der Zentrifugation (200 xg für 5 min), resuspendieren die Zellen in 1 ml GM.
  7. Zähle die Zellen mit einer Neubauer Kammer.
  8. 5 x 10 5 Zellen resuspendierenIn 200 μl GM für jede Transfektion ( dh für 2 Transfektionen, Resuspend in 400 μL).
  9. Füge 200 μl der Zellsuspension zu je 500 μl siRNA-transfektiver Mischung hinzu. Pipettieren Sie zweimal auf und ab und inkubieren Sie für 5 min bei RT.
  10. Fügen Sie die 700 μL (Zellen + siRNA-Transfektanten) zu einer 3,5 cm Kulturschale hinzu, die ein Glasdeckel enthält. Füge GM hinzu, um ein Endvolumen von 2 ml zu erhalten.
  11. Nach 24 h bei 37 ° C und 7% CO 2 ersetzen Sie das Medium vollständig mit 2 mL frischem GM. Nach weiteren 24 h ist gewöhnlich eine konfluierende Monolage von transfizierten Zellen vorhanden; Wenn ja, induzieren Sie die Myoblastdifferenzierung, indem Sie den GM mit 2 ml Differenzierungsmedium (DM, Tabelle 1 ) ersetzen.
  12. Führen Sie Kalzium-Imaging-Experimente 24 - 48 h nach der Induktion der Differenzierung oder bei der Proliferation von Myoblasten.
    Anmerkung: Immunfluoreszenz wird gewöhnlich 48 h nach der Induktion der Differenzierung durchgeführt.

6. ImmUnofluoreszenz färbung von differenzierungsmarkierungen

Hinweis: Die Immunfluoreszenzfärbung erfolgt nach 48 h in DM, kann aber auch zu anderen Differenzierungszeiten durchgeführt werden. Myogenin und MEF2 sind Nuklearproteine, die nur in differenzierten Zellen exprimiert werden (vor der Fusion in Myotubes), und ihre Färbung ermöglicht die Beurteilung des Differenzierungsprozesses. Myosin schwere Kette (MyHC) wird nur in Myotubes exprimiert und wird verwendet, um die Myotube Größe und Fusion Index (Anzahl der Kerne in Myotubes / Gesamtzahl der Kerne) zu schätzen.

  1. Nach 48 h in DM die konfluierende Monoschicht der differenzierten Zellen zweimal mit 1 mL PBS bei RT waschen. Machen Sie dies sorgfältig, um das Entfernen der Myotubes zu vermeiden.
  2. Fixieren Sie die Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) für 15 min bei RT. Waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal, für jeweils 5 min.
  3. Permeabilisieren der Zellen mit 1 ml PBS, enthaltend 0,25% Triton X-100 für 45 min und waschen 3 mal mit 1 ml PBS.
  4. Blockieren Sie unsPecific Bindungsstellen durch Inkubieren der Zellen in PBS, ergänzt mit 0,2% Tween-10 und 2% Ziegenserum (Blocklösung) für 30 min bei RT.
  5. Bereiten Sie primäre Antikörper vor, die in Blocklösung verdünnt sind (600 & mgr; l pro 3,5-cm-Platte).
    Anmerkung: Die folgenden primären Antikörper werden verwendet: Maus-Anti-Myogenin (1: 600), Kaninchen-Anti-MEF2 (1: 300) und Maus-Anti-MyHC-Antikörper (MF20, 1: 1.000). Es ist möglich, in der gleichen Blocking-Lösung, Maus Anti-Myosin schwere Kette oder Maus Anti-Myogenin, mit Kaninchen Anti-MEF2 mischen.
  6. Entfernen Sie die Blocklösung und fügen Sie 600 μl primäre Antikörperlösungen pro 3,5-cm-Platte hinzu und inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer.
  7. Die Zellen 3 mal mit 1 ml PBS waschen. 1 Stunde bei RT in einer Dunkelkammer mit 600 μl der in der Blocklösung hergestellten sekundären Antikörper wie folgt inkubieren: Ziegen-anti-Maus Alexa 488 (1: 1000), Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 546 (1: 1000), Und DAPI (1:50, Stammlösung bei 15 μM).
    CAUTION: DAPI ist eine toxische Verbindung, die mit Handschuhen umgehen sollte.
  8. Aspirieren und waschen die Zellen 3 mal mit 1 ml PBS.
  9. Montieren Sie Glasdeckel mit Polyvinylalkohol-Montagemedium mit Antifading-Lösung. Halten Sie sie bei 4 ° C und vor Licht geschützt, bis die Zellen abgebildet sind.

7. Calcium Imaging

  1. Vorherige Kultur, bereiten Glas Deckgläser 25 mm im Durchmesser. Setzen Sie die Deckgläser in 70% Ethanol für 48 h, um jegliches Fett und Schmutz von der Oberfläche zu entfernen, was die Zellhaftung des Deckglases verringert.
  2. Nach dem Spülen der Deckgläser mehrere Male mit Wasser, legen Sie sie wieder in Wasser und sterilisieren sie (autoklaviert).
  3. Setzen Sie ein Deckglas pro 3,5-cm-Kulturplatte und lassen Sie sie trocknen. Bewahren Sie die Petrischalen für weitere Versuche auf oder verwenden Sie sie sofort.
  4. Fügen Sie die transfizierten Myoblasten (5 - 6 x 10 5 Zellen) dem Glasdeckel hinzu.
    Anmerkung: Die Versuche werden 24 - 48 h nach der Induktion von differentiati durchgeführtAuf oder auf vermehrten Myoblasten.
  5. Um die Ca 2+ -Bildgebung durchzuführen, waschen Sie die Zellen 2 mal mit PBS oder direkt mit dem für die Experimente verwendeten Medium (Calcium enthaltendes Medium, Tabelle 3 ). Legen Sie die Zellen mit 2 μM Fura-2 / AM plus 1 μM Pluronsäure für ca. 30 min im Dunkeln bei RT ein.
    Anmerkung: Pluronsäure hilft, Fura-2 zu lösen. Fura-2 / AM und Pluronsäure werden in dem calciumhaltigen Medium gelöst.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal im gleichen Medium, aber ohne Fura-2 / AM und Pluronsäure und lassen Sie sie im Dunkeln für weitere 10 - 15 min, um die Veresterung von Fura-2 / AM zu ermöglichen.
  7. Wenn die Belastungseffizienz von Fura-2 zu niedrig ist, fügen Sie mehr Fura-2 ( zB 4 μM) hinzu und / oder inkubieren Sie die Zellen für eine längere Zeit ( zB 40 min).
  8. Entfernen Sie das Deckglas von der Kulturplatte und installieren Sie es in der Versuchskammer. Füge ~ 1 ml kalziumhaltiges Medium hinzu (abhängig vom Volumen der ExperimenteGeistige Kammer). Installieren Sie es auf der Mikroskopstufe und starten Sie die Aufnahme.
    Anmerkung: Die fluoreszierende Ca 2+ -sensitive Sonde Fura-2 wird abwechselnd bei 340 nm und 380 nm angeregt und das Emissionslicht wird bei 510 nm gesammelt. Da die Fluktuationen der Ca 2+ -Konzentration relativ langsam sind, erwerben sie 1 Verhältnis alle 2 s.
  9. Um SOCE zu aktivieren, wird das folgende klassische Thapsigargin / Ca 2+ Re-Additionsprotokoll verwendet: Die Zellen für 2-3 min in kalziumhaltigem Medium verlassen. Ersetzen Sie das Medium mit einem kalziumfreien Medium für 1-2 min.
    1. Füge 1 μM Thapsigargin hinzu, um die internen Kalziumspeicher abzutragen.
      Anmerkung: Thapsigargin ist ein irreversibler Blocker der sarco-endoplasmatischen Retikulum Ca 2+ ATPase (SERCA) Pumpenaktivität. Nach 8 - 10 min ersetzen Sie schnell das Medium mit dem calciumhaltigen Medium. Ca 2+ wird durch die SOCE-Kanäle in die Zellen gelangen. Warten Sie ca. 5 Minuten, bevor Sie die Experimente beenden.
      ACHTUNG: Thapsigargin ist eine giftige Verbindung, die mit Handschuhen behandelt werden sollte.

8. Ca 2+ -Messanalyse

Hinweis: Führen Sie die Analyse mit der Erfassungssoftware durch.

  1. Öffnen Sie das Experiment. Zeichnen Sie die Region 1 in einem Bereich, in dem es keine Zellen gibt (Hintergrundbereich), und ziehen Sie die anderen Regionen im Zytoplasma der zu analysierenden Zellen (die Regionen können auf jedem Bild gezeichnet werden: die 340 nm, die 380-nm, Oder das Verhältnisbild). Gehen Sie zu "Run experiments"> "Referenzbilder". Unter den 340- und 380-Kanälen wählen Sie "Region 1" und klicken dann auf "Subtrahieren von Hintergrund".
  2. Führen Sie das gesamte Experiment (F4: vorwärts) aus, um sicherzustellen, dass nichts mit dem Hintergrundbereich in Konflikt kommt, wie z. B. ein fluoreszierender Staubfleck, der durch die Hintergrundregion fährt und dass sich die Zellen während der Zeit der Experimente nicht bewegen.
    Hinweis: Die interessierten Regionen sind ausgewähltSollte nicht dunkle Bereiche enthalten; Andernfalls wird der Verhältniswert verrauscht erscheinen, da ein Teil des Hintergrundes in die Messung einbezogen wird.
  3. Klicken Sie auf "Logdaten" und spielen Sie das gesamte Experiment erneut.
    Hinweis: Hiermit wird eine Tabellenkalkulation geöffnet, in der die Zeit und das Verhältnis protokolliert werden. Es ist auch möglich, die einzelnen Wellenlängen von 340 nm und 380 nm zu speichern.
  4. Um Informationen über SOCE zu erhalten, extrahiere die beiden wichtigen Parameter aus dem Experiment: die Amplitude der Ca 2+ -Re-Addition und die Steigung der Ca 2+ -Eingangsphase ( Abbildung 3 ).
  5. Erhalten Sie die Amplitude durch Subtrahieren des Verhältniswerts kurz vor Ca 2+ -Re-Addition von der maximalen Amplitude der Ca 2+ -Hehe. Erhalten Sie die maximale Steigung, indem Sie eine lineare Regression der ersten Sekunden nach Ca 2+ Re-Addition anpassen.
    Anmerkung: Der Bereich unter der Kurve der Thapsigargin-Antwort ist auch ein informativer Parameter für extracT, da es die Menge an freiem Kalzium in der SR gespeichert reflektiert.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach der enzymatischen Dissoziation einer menschlichen Muskelprobe wurden die Zellen in GM amplifiziert. Menschliche Myoblasten, definiert als CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-Zellen, wurden nach FACS erhalten. Myoblasten repräsentierten mehr als 60% der analysierten Population ( Abbildung 1 ). Primäre menschliche Myoblasten wurden repliziert, zu Konfluenz gewachsen und in DM für 48 h kultiviert. Nach der Immunfärbung für die Expression des Transkriptionsfaktors MEF2 und der muskels...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Isolierung und Kultur der menschlichen Myoblasten aus dem erwachsenen Skelettmuskel bietet ein in vitro Modell, um Muskelunterscheidung und Muskelregeneration zu untersuchen. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die Reinigung von hohen Erträgen von menschlichen Myoblasten auf einfache und kostenbegrenzte Weise ermöglicht. Darüber hinaus bietet diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in Bezug auf den Prozentsatz der isolierten Myobla...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Schweizerischen Nationalfonds (Stipendiat 310030-166313), der "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", der "Stiftung Marcel Levaillant" und der "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire" unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Schinken" s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106Los 41G5532K
BSASigmaO5482
FetuinSigmaF3385
EGFCorning354001
DexamethansonSigmaD1756
InsulinSigmaI9278
KreatinSigma27900
PyruvatSigmaP4562
UridinSigmaU3003
GentamycinThermoFisher Scientific15710-049
Trypsin-EDTA 0,05%ThermoFisher Scientific25300-062
70 μ m ZellensiebFalcon352350
40 μ m ZellensiebFalcon352340
Falcon 50  mL RöhrchenFalcon352070
Falcon 15  ml-RöhrchenFalcon352096
Falcon 5  ml-Röhrchen (FACS)Falcon352058
Nährmedium: OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
Transfektant reagnt: RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBSThermoFisher Scientific14190-094
EindeckmediumFluka10981
Maus anti-MyHC *DSHBMF20 konzentrieren
Maus Anti-MyogeninBD Pharmigen556358
Kaninchen Anti-MEF2Santa Cruz BiotechC-21
Ziege Anti-Maus Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
Ziege Anti-Kaninchen Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
Maus Anti-Mensch CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
Maus anti human CD146-PECy7BD Pharmingen562135
Maus anti human CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
Maus anti human CD34-APCBD Pharmingen345804
Maus anti human CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 Maus IgG1kBD Pharmingen557702
PECy7 Maus IgG1kBD Pharmingen557872
PE-CF594 Maus IgG1kBD Pharmingen562292
APC Maus IgG1kBD Pharmingen550854
PE Maus IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542ACHTUNG:  giftige Verbindung
ParaformaldehydFluka762400
Fura-2 AMThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
ThapsigarginSigmaT9033VORSICHT: giftige Verbindung 
Software zur Erfassung der Verhältnisbildgebung: Metafluor 6.3Molecular Device
* : MF 20 wurde von Fischman, D.A. 

Referenzen

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