Methodenartikel

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

DOI:

10.3791/55932

⸱

10. Oktober 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt Standardprotokolle zur Messung der Hyperphosphorylierung Tau, Tau Bindung an Mikrotubuli und Lokalisierung von intrazellulären Tau nach medikamentösen Behandlungen zu messen. Diese Protokolle können wiederholt verwendet werden, für das screening von Drogen oder andere Substanzen, die auf Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli binden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau ist ein neuronalen Protein, das vor allem in Axone lokalisiert. Im Allgemeinen ist Tau für normale neuronalen funktionieren, da es bei der Montage von Mikrotubuli und Stabilisierung beteiligt ist. Neben Neuronen ist in menschlichen Brust-, Prostata-, Magen-, Darm-, und Pankreaskarzinome wo es zeigt fast ähnlichen Struktur und ähnliche Funktionen ausübt, als die neuronalen Tau Tau ausgedrückt. Die Höhe der Tau und die Phosphorylierung kann ändern ihre Funktion als Stabilisator von Mikrotubuli und führte zur Entwicklung der gekoppelten spiralförmigen Filamente in verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer. Ermittlung des Tau und die Mikrotubuli-Bindungseigenschaften Phosphorylierung ist wichtig. Darüber hinaus ist es wichtig bei verschiedenen Krankheiten, untersuchen die intrazelluläre Lokalisation der Tau. Dieses Manuskript Details Standardprotokolle zur Messung der Phosphorylierung von Tau und Tau Bindung an Mikrotubuli in colorectal Krebszellen mit oder ohne Curcumin und LiCI Behandlung. Diese Behandlungen können eingesetzt werden, um Krebs Zellproliferation und Entwicklung zu stoppen. Intrazelluläre Lokalisation der Tau wird mithilfe von Immunohistochemistry und konfokalen Mikroskopie mit geringen Mengen von Antikörpern untersucht. Diese Tests können wiederholt verwendet werden, für das screening von Verbindungen, die Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli Bindung auswirken. Neuer Therapeutika für verschiedene Tauopathies oder Verwandte Anti-Krebs-Agenten können potenziell charakterisiert werden, mit Hilfe dieser Protokolle.

Einleitung

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Tau wurde ursprünglich als hitzebeständig Mikrotubuli-assoziierten Protein identifiziert, das Co gereinigtem Tubulin1war. Tau wird ausschließlich in höheren Eukaryoten2,3,4angegeben. Die Hauptfunktion des Tau ist, Mikrotubuli Montage1,5,6zu kontrollieren. Es trägt auch zur Polymerisation von Mikrotubuli7, axonalen Transport8, Veränderungen der axonalen Durchmesser9, Bildung von Neurom Polarität und Neurodegeneration10. Tau fungiert auch als Protein Gerüst, einige Signalwege zu kontrollieren. Ratte Gehirn Studien deuten darauf hin, dass Tau Neuron-spezifische und dass es in erster Linie in Axone11lokalisiert. Da Tau für Mikrotubuli Polymerisation und neuronale Entwicklung unabdingbar ist, war Tau vermutet, um eine wichtige Rolle in der axonalen Entwicklung in das zentrale Nervensystem; Diese Hypothese wurde später von in Vitro und in Vivo Experimente verifiziert. Neben der Neuronen drückt sich Tau in verschiedenen nicht-neuronale Zellen, einschließlich Leber, Niere und Muskel Zellen12,13. Tau drückt sich auch in menschlichen Brust-, Prostata-, Dickdarm-, Magen-, und pankreatischer Krebs Zelle Linien und Gewebe14,15,16,17,18, 19. Tau findet sich auch in Einbeziehung Körper Myositis als verdrehte Tubulofilaments Einschlusskörperchen20.

Tau kann mehrere post-translationalen Modifikationen vornehmen. Phosphorylierung ist alle post-translationalen Modifikationen die am weitesten verbreitete. Erhöhten Tau Phosphorylierung verringert seine Affinität für Mikrotubuli, schließlich das Zellskelett zu destabilisieren. Fünfundachtzig Phosphorylierung Websites wurden in Tau-Protein isoliert von Hirngewebe menschlichen Alzheimer-Krankheit beschrieben. Dieser Seiten sind 53 % Serin, 41 % Threonin und nur 6 % Tyrosin Rückstände21,22,23. Tau-Phosphorylierung wirkt sich auf die Lokalisierung, Funktion, Bindung, Löslichkeit und seiner Anfälligkeit für andere post-translationalen Modifikationen. Auch Tau Phosphorylierung um mehr als die normale Ausdehnung (oder vollständig gesättigt mit Phosphatgruppen) ist bekannt als Hyperphosphorylierung, die strukturelle und funktionelle Merkmale der Alzheimer-Krankheit24repliziert. Tau unterhält Funktionsfähigkeit des axonalen Mikrotubuli und sorgt für normale neuronale Funktion unter physiologischen Bedingungen. Hyperphosphoryliertem Tau schlägt jedoch fehl, eine gut organisierte Mikrotubuli binden, was neuronaler Verlust wegen Mikrotubuli Demontage beizubehalten. Ein normales Niveau von Tau Phosphorylierung sind erforderlich für die ordnungsgemäße Funktionsweise Tau, aber Tau nicht, normal zu funktionieren, wenn seine charakteristische Phosphorylierung-Ebene verändert wird und wenn es hyperphosphoryliertem25. In der Alzheimer-Krankheit und einigen anderen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen Tau wird hyperphosphoryliertem und bildet die gepaarten spiralförmigen Fäden und neurofibrillären Verschlingungen26,27. Daher sind die Methoden zur Bestimmung von Tau Phosphorylierung und Mikrotubuli binden wichtig.

Colorectal Krebs, eine Alterung verbundenen Krebs ist die dritte am häufigsten diagnostizierte Krebs und der dritte prominente Tod verursacht Krebs für Männer und Frauen28. Darmkrebs ist eine der wichtigsten Tod verursachen Krebserkrankungen in der westlichen Welt29. Weil colorectal Krebs und Alzheimer-Krankheit mit Altern verbunden sind, und beides vor allem in den entwickelten Ländern geschieht, wo die Menschen ähnliche Ernährungsgewohnheiten genießen, können die beiden Krankheiten irgendwie korreliert werden. Darüber hinaus reagieren Tau-Positive und Tau-Negative Krebszellen unterschiedlich auf Chemotherapeutika, z.B., Paclitaxel16.

Curcumin ist eines der wichtigsten Derivate von Curcuma Longa, die indische Gewürz Kurkuma30. Jahrhundertelang haben die asiatische Populationen Kurkuma in ihrer Ernährung auf einer täglichen Basis verbraucht. Curcumin ist zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Darmkrebs, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Mukoviszidose, entzündliche Darm-Krankheit, Arthritis, Hyperlipidämie, Arteriosklerose und ischämischen Herzkrankheiten31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. Lithium auch colorectal Krebszellen zu töten oder zu verhindern, dass ihre Verbreitung39. Lithium kann auch verwendet werden, für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit40 wie es Tau Aggregation verringert und die Hyperphosphorylierung verhindert wie in einem transgenen Maus Modell41,42,43beobachtet, 44.

Dieses Manuskript soll: 1) messen Sie die Gesamt-Tau und Phospho-Tau Ausdruck Niveaus im behandelten Zellen; (2) beschreiben Sie eine Phosphatase Test zur Messung der gesamten Tau Phosphorylierung; (3) Mikrotubuli-Bindung von Tau zu prüfen; und 4) lokalisieren Tau konfokalen Mikroskopie in colorectal Krebs-Zelllinien mit Curcumin oder LiCI behandelt. Ergebnisse zeigen, dass Zelltherapie mit Curcumin, die einen vermeintlich guten Chemotherapeutikum für Darmkrebs und Behandlung mit LiCI reduzieren Ausdruck der beiden total Tau und Tau in colorectal Krebs-Zelllinien phosphoryliert. Diese Behandlungen verursachen auch nukleare Translokation von Tau. Jedoch nicht unerwartet, Curcumin, Bindung von Tau zu Mikrotubuli zu verbessern.

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. fügen Sie 10 µL (1 mM) Phenylmethylsulfonyl Fluorid Lösung, 10 µL Protease-Inhibitor-cocktail-Lösung (1 X 100 X lagermäßig) und 10 µL (1 X 100 X lagermäßig) Phosphatase Inhibitor cocktail Lösung 1 mL 1 X radioimmunoprecipitation (RIPA) Testpuffer komplette RIPA Lyse Puffer vorzubereiten.
  2. Vorbereitung 10 x allgemeine Tubulin Puffer (PEM) Puffer.
    1. Add 800 mM (6,0474 g) Piperazin-N-N ' - Bis - 2-Ethanesulfonic Säure, 10 mM (95,1 mg) Ethylen Glykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-Tetraacetic Säure, 10 mM (51 mg) MgCl 2 und 1,25 M (10 M 3 mL) NaOH in einen 50-mL-Tube , mit 15 mL destilliertem Wasser mischen, und mit einem Wirbel auflösen. Überprüfen Sie den pH-Wert (6,9 sein sollte). Wenn pH > 6.9, entsorgen Sie den Puffer und viel frische remake.
      Hinweis: NaOH sollte unter 1,25 M um sicherzustellen, dass dieser pH-Wert 6,9 nicht Überschwingen. Es ist nicht ratsam, HCl für pH-Wert verwenden > 6.9.
    2. Add NaOH tropfenweise bis pH 6,9 ist. Fügen Sie destilliertes Wasser um bis zu 25 mL 10 X PEM-Puffer zu machen. Zu guter Letzt mit einer Spritze und einem 0,2 µm Spritze Filter filtern Teilen Sie diesen Puffer in Aliquote in 1,5 mL Tuben und Lagerung bei 4 ° c
  3. Prepare 5 x Probenpuffer mit Reduktionsmittel und Farbstoff.
    1. Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25 %) von 50 % Glyzerin, 1 mL (2 %) von 10 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) und 1,2 mL destilliertem Wasser 5 mL 5 x SDS-Probenpuffer ausmachen. Lagerung bei − 20 ° c
      Hinweis: Da Glycerin zähflüssig ist, ist Messung 1,25 mL Glycerin schwierig. 1 mL 100 % Glyzerin wiegt 1,26 g. So wiegen 1,575 g 100 % Glycerin (das entspricht 1,25 mL von 100 % oder 2,5 mL 50 % Glycerin) in einem 15 mL tube zuerst; Mischen Sie gut mit den anderen Komponenten.

2. Zell-Kultur, Behandlung mit Curcumin oder LiCI Behandlung und Untersuchung von Protein-Expression

  1. Add ~ 1 x 10 6 HCT-116 Zellen in 100 mm Gewebekultur Speisen mit der Minimum wesentlichen Medien (MEM) mit 10 % fetalen Rindern ergänzt Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin. Nach einem Tag der Kultivierung, Zellen werden 60-70 % Zusammenfluss erreichen.
    Hinweis: Die Anzahl der benötigten Platten hängt von der Anzahl der nachstehend beschriebenen Behandlungen.
  2. , Wenn Zellen ~ 65 % Zusammenfluss (angenähert mit Mikroskopie) zu erreichen, das MEM ergänzt Medium zu entfernen und serumfreien MEM mit 5 µM, 10 µM und 30 µM Curcumin oder 25 mM, 50 mM und 100 mM LiCI hinzufügen. Inkubation bei 37 ° C für 24 h in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO 2.
  3. 24 h nach der Behandlung der Zellen mit 1 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen und kratzen Sie die Zellen mit einem Schaber Zelle. Übertragung der geschabten Zellen in 1,5 mL Röhrchen Zentrifugieren und Zentrifugieren für 4 min bei 1.800 X g bei 4 ° C Zelle Pellets erhalten.
  4. Lyse der Zellen durch die Aussetzung der Pellets in 100 µL kompletten RIPA Puffer bei 4 ° C für 20 min während regelmäßig Antippen der Rohre. Die Proben kurz beschallen.
  5. Zentrifugieren der Zelle Homogenates in einer Zentrifuge Benchtop bei 22.570 X g für 20 min bei 4 ° c die Überstände auf andere beschrifteten Röhrchen mit einer Pipette übertragen.
  6. Messen die Proteinkonzentration in die Überstände an der Bradford-Test 45 mit kommerziellen Protein-Test-Kits.
  7. Vorbereiten Proben gleich Proteinkonzentration (10 µg Protein/13 µL Probe) der Zelle Lysates mit 4 X SDS Gel-Loading Puffer. 4 x SDS-Gel-laden-Puffer frisch mit 400 mM Dithiothreitol (DTT) vorbereitet.
    Hinweis: In diesem Stadium Proben können gespeichert werden auf − 20 ° C bei Bedarf.
  8. Inkubation die Proben auf einem Heizblock bei 100 ° C für 5 min. Mischen der Proben mit einem Wirbel und warten, bis sie kaltstellen ~ 10-15 min.
  9. Montieren ein Elektrophorese-System.
    1. Last 10 µg Protein (13 µL Probe) pro Bohrloch auf einem 10 % SDS-Polyacrylamid-Gel für Elektrophorese (SDS-PAGE). Laden Sie die Molekulargewicht Leiter auf das Gel einspurig.
      Hinweis: Als Elektrophorese beginnt, löst die Protein-Leiter in Protein-Bands der scheinbaren Molekulargewichten. Diese Bänder verwenden, um die Molekulargewichte der unbekannten Protein Bands schätzen.
    2. Nach dem Laden der Proben, schließen Sie die positiven und negativen Elektroden der Elektrophorese-System an eine Stromquelle, um eine konstante Spannung aufrecht zu erhalten. Zunächst beginnen Sie bei 70 V für 20 min die Proteinproben aus dem Stapel Gel in die Lösung von Gel. Dann erhöhen die Spannung 125 V ca. 70-120 Minuten, bis das Ende des Gels Proben und Protein-Leiter erreichen.
    3. Nach Abschluss der Elektrophorese, das Gel auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran mit einem nassen Elektroblotting System übertragen. Transfer für ~ 100 min bei 100 V. Block die Membran in 4 % Rinderserumalbumin (BSA) blockierende Puffer für 90 min. bei Raumtemperatur von rund 25 ° c
  10. Den Blot markieren, indem Sie auf der Seite mit dem Molekulargewicht Leiter schneiden. Verwenden Sie eine transparente Plastikfolie und ein scharfes Messer zum Schneiden des Blot. Bereiten Sie die Lösungen der primär-Antikörper (Anti-Tau mit 1:5, 000, Anti-Phospho-Tau bei 1:4 000) und über Nacht den Blot in dieser Lösung bei 4 ° C inkubieren.
  11. Nach der Inkubation über Nacht, waschen den Fleck für 7 min viermal in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung-Tween-20 (PBST) Lösung.
  12. Bereiten die relevanten Sekundär-Antikörper-Lösungen (Ziege Anti-Kaninchen oder Anti-Maus IgG bei 1:5 000), und den Fleck in dieser Lösung für 90 min. bei Raumtemperatur ca. 25 ° c zu waschen in PBST viermal, 7 min inkubieren.
  13. Entwicklung den Fleck mit einem Chemilumineszenz-Kit nach Angaben des Herstellers ' s Empfehlungen. Decken Sie den Fleck mit einer durchsichtigen Plastikfolie. Abrufen von Bildern durch eine Chemilumineszenz imaging-System für Chemilumineszenz mit entsprechender Software.

3. Phosphatase-Assay

  1. die Zelle Lysates (aus Schritt 2.5) mit alkalischer Phosphatase in der alkalischen Phosphatase-Puffer zu behandeln.
    1. Beispiele für beide Steuern und behandelte Proben vorbereiten 20 µL mit 20 µg Gesamt-Protein. Fügen Sie das Volumen der Zelle Lysates, die 20 µg Gesamt-Protein, gefolgt von 2 µL alkalische Phosphatase Puffer und 10 µL alkalische Phosphatase enthält. Hinzufügen von destilliertem Wasser auf 20 µL ausmachen.
  2. Die Proben bei 37 ° C inkubieren, 1 h. Stop die Reaktion durch Zugabe von Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) auf eine Endkonzentration von 50 mM oder durch Zugabe von Natrium Orthovanadate (Na 3 VO 4) auf eine Endkonzentration von 10 mM. Die Reaktion kann auch durch Erhitzen bei 75 ° C für 5 min. gestoppt werden
  3. Vor der Bebrütung von Proben mit Phosphatase beendet, Proben der gleichen Konzentration ohne Zugabe von Phosphatase zum Vergleich mit Phosphatase-behandelten Proben vorbereiten.
  4. Add die frisch zubereitete 4 X SDS Gel-Loading Puffer mit 400 mM DVB-t.
  5. Brüten die Proben auf einem Heizblock bei 100 ° C für 5 min. Mix der Proben mit einem Wirbel. Bei Raumtemperatur für cool ~ 10-15 min.
  6. Bauen eine Elektrophorese System für die Ausführung von einer 10 % Polyacrylamid-Gels durch SDS-PAGE.
    1. Last 10 µg Protein (13 µL Probe) pro Bohrloch auf einen 10 % polyacryLamide Gel. Die Molekulargewicht Leiter laden.
    2. Nach dem Laden der Probenmaterials, schließen Sie die positiven und negativen Elektroden der Elektrophorese-System an eine Stromquelle, um eine konstante Spannung aufrecht zu erhalten. Zunächst beginnen Sie bei 70 V für 20 min die Proteinproben aus dem Stapel Gel in die Lösung von Gel. Dann erhöhen die Spannung 125 V und das Gel für ca. 70-120 min laufen, bis das Ende des Gels Proben und Protein-Leiter erreichen.
    3. Nach Abschluss der Elektrophorese, Gel auf einer PVDF-Membran mit einem nassen Elektroblotting System zu übertragen. Transfer für ~ 100 min bei 100 V.
    4. Markieren indem man einen kleinen Schnitt auf der Seite die Molekulargewicht Leiter den Blot. Verwenden Sie eine transparente Plastikfolie und ein scharfes Messer zum Schneiden des Blot.
  7. Blockieren die Membran in 4 % BSA blockierende Puffer für 90 min bei Raumtemperatur.
  8. Inkubieren den Blot in PV-Antikörperlösung (Anti-Tau in der 1:5 000) bei 4 ° C über Nacht. Waschen den Blot in PBST vier Mal für 7 min.
  9. Bereiten Sie die relevanten Sekundär-Antikörper-Lösung (Ziege Anti-Maus IgG bei 1:5 000) und den Fleck für 90 min bei Raumtemperatur inkubieren. Vier Mal für 7 min in PBST waschen.
  10. Entwicklung den Fleck mit einem Chemilumineszenz-Kit nach Angaben des Herstellers ' s Empfehlungen. Den Fleck in eine transparente Plastikfolie abdecken. Abrufen von Bildern durch eine Chemilumineszenz imaging-System für Chemilumineszenz mit entsprechender Software.

4. Mikrotubuli-Bindung Assay

  1. für die Mikrotubuli binden Assay, wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6.
  2. Vorbereiten 1 X (2 mL) PEM-Puffer von 10 X PEM Puffer gespeichert bei 4 ° C durch Zugabe von 20 µM (40 µL) Paclitaxel und 1 mM (20 µL) GTP. Die Mikrotubuli (MT) Bestandsaufnahme von − 80 ° C Gefrierschrank und der E. Coli Tau Arbeit bestand aus − 20 ° C Gefrierschrank.
  3. Bereiten Proben gemäß Tabelle 1.
  4. 30 min. Ultrazentrifugen bei 25 ° C für 60 min bei 100.000 X g bei 37 ° C inkubieren.
  5. Transfer 120 µL Überstände mit ungebundenen Tau, zu reinigen und Röhren beschriftet.
  6. Fügen Sie 120 µL (gleiche Volumen wie überstand) 5 X Puffer zum Pellet mit gebundenen Tau zu probieren und gründlich mischen. Die Lösung um beschriftete Rohre zu reinigen und gründlich mischen.
  7. Messen die Konzentration des Proteins (siehe Punkt 2.6).
    Hinweis: Verwenden Sie während der Vorbereitung der Proben, das Volumen der Lösung (Schritt 4.6) für die Pellets und überstand Probenvorbereitung.
  8. Proben von gleichwertigen Proteinkonzentration vorbereiten und fügen Sie frisch zubereitete 4 x SDS-Gel-laden-Puffer mit DVB-t (400 mM).
    Hinweis: Proben können gespeichert werden, am − 20 ° C in diesem Stadium.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3,5-3.10.
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Probe Name Mikrotubuli benötigt Main Protein benötigt PEM-GTP-PTX
1 HCT-116-Control (6,21 μg/μl) 2 μl 9,66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 HCT-116-Curcumin 10 μM (4,81 μg/μl) 2 μl 16.63 μl (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-Curcumin 20 μM (3,28 μg/μl) 2 μl 30.49 μl (100 μg) 87.51 μl
4 HCT-116-LiCI 25 mM (5,43 μg/μl) 2 μl 18.42 μl (100 μg) 99.58 μl
5 E. Coli Tau 2 μl 1 μl Tau-352 117 μl
6 MT nur 2 μl X 118 μl
120 μl

Tabelle 1: Probenvorbereitung für Mikrotubuli-Bindung Assay.

5. Lokalisierung und Ausdruck der Tau nach Behandlung der Zellen mit Curcumin

  1. einem Deckgläschen mit 70 % Ethanol zu reinigen und trocknen Sie es mit einem Labor-Gewebe. Legen Sie ein einzelnes Deckglas in jede Vertiefung einer Gewebekultur beschrifteten 6-Well-Platte. Die Platte zur biologischen Sicherheit Kabinett und schalten Sie ein UV-Licht für mindestens 3 h
  2. Subkultur der Zellen und säen sie in die entsprechenden Vertiefungen der 6-Well-Platte 2,5 x 10 5 Zellen/Brunnen im empfohlenen Kulturmedium.
  3. Nach ca. 24 h, untersuchen die Zellen mit einem inversen Mikroskop indem Sie 10 X und 40 X Ziele für zelluläre morphologische Veränderungen zu überprüfen. Fotos aufnehmen, wenn nötig.
  4. Spülen die Zellen zweimal mit PBS. Die Zellen in 3,7 % Formaldehyd in einem Inkubator 37 ° C im Dunkeln zu beheben.
    Hinweis: Fixierung durch Formaldehyd bei Raumtemperatur funktioniert gut, auch. Tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung beim Umgang mit Formaldehyd.
  5. Waschen der Zellen mit PBS-Puffer. Zellen im eiskalten Methanol zu beheben − 20 ° C für 15 min. Permeabilize Zellen durch brüten sie in 3 % BSA und 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer auf dem Eis für 10 min. die Zellen mit PBS waschen.
  6. Inkubieren Sie die Zellen in blocking-Puffer (3 % BSA und 0,1 % Tween 20 in PBS-Lösung) für 1 h bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Inkubation für 2 h bei 4 ° C funktioniert gut, auch.
  7. Bereiten Sie die primär-Antikörper (Anti-Tau bei 1: 200) Lösung in 3 % BSA und 0,1 % Tween 20 in PBS (z. B. 2 µL Tau-13 Antikörper in 0,4 mL Puffer).
  8. Schneiden Sie kleine Stücke von einer PVDF Membran so dass die Stücke passen in jede Vertiefung des 6-Well-Platte; sie in Wasser einweichen für 5 min. Ort den Schnitt PVDF in jede Vertiefung.
  9. Fügen Sie 60 µL Primärantikörper Lösung bis zum Schnitt PVDF Stück in jede Vertiefung. Platzieren Sie die Deckgläsern, derart, dass die Zellen der primären Antikörperlösung berühren können. Über Nacht bei 4 ° C in einer dunklen, feuchten Kammer inkubieren. Waschen mit PBS-Puffer viermal.
  10. Bereiten Sie die Sekundär-Antikörper-Lösung (Fluorescein konjugiert 594 Anti-Maus IgG bei 1: 400) in 3 % BSA und 0,1 % Tween 20 in PBS.
  11. Schneiden kleine Stücke einer PVDF-Membran, so dass die Stücke in jede Vertiefung des 6-Well-Platte passen, und sie in Wasser für 5 min. Platz den Schnitt PVDF in jede Vertiefung genießen.
  12. Hinzufügen 80 µL der Sekundär-Antikörper-Lösung für die PVDF-Stücke in der 6-Well-Platte. Das Deckglas zu platzieren, so dass die Zellen, die Sekundär-Antikörper-Lösung berühren können. Inkubieren Sie vier Mal in einer dunklen, feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 2 h mit PBS waschen.
  13. Mount Proben in das Eindeckmittel mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und befestigen Sie den Deckgläsern auf Objektträgern.
    1. Hinzufügen einer Tropfen Eindeckmittel mit DAPI auf Objektträgern. Entfernen Sie die Deckgläsern aus jedem Brunnen und legen Sie sie auf die Glas-Folien mit Eindeckmittel mit DAPI. Stellen Sie sicher, dass die Oberfläche der einzelnen Deckglas mit gefärbten Zellen die Moun berührtTing-Medium auf die entsprechenden Glasobjektträger.
    2. Übernehmen Nagellack rund um jedes Deckglas zu versiegeln und zu lösen auf der Glas-Folien luftdicht. Falls erforderlich, führen Sie diesen Schritt zweimal.
  14. Für 1,5 h bei Raumtemperatur in einer dunklen Kammer inkubieren.
  15. Untersuchen die Folien mit einem konfokalen Mikroskop mit Immersionsöl auf das Deckglas in einem dunklen Raum.

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Ergebnisse

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Ausdruck der gesamten Tau und Phospho-Tau wurde geprüft, nach der Behandlung der Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Curcumin oder LiCI (Abbildung 1). Behandlung der Zellen mit den drei verschiedenen Konzentrationen von Curcumin verringerte Tau Ausdruck; Phospho-Tau Ausdruck erhöht bei der Behandlung mit geringen Konzentration von Curcumin jedoch verringerte sich auf Behandlung von Zellen mit höheren Konzentrationen von Curcumin. Anti-Phospho-Tau (Se...

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Diskussion

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Dieses Manuskript verschiedenen verfahrensrechtliche Voraussetzungen für die Erkennung von insgesamt Tau etabliert und phosphoryliert Tau in colorectal Krebszellen mit Curcumin und LiCI behandelt. Um den Gesamtstatus der Phosphorylierung des Tau in Proteinproben zu beurteilen, wurde eine Phosphatase-Assay beschrieben. Dieser Assay kann möglicherweise verwendet werden, um den Status der Phosphorylierung von jedem Protein untersuchen.

Dieser Test basiert auf dem Prinzip, die Protein bewegt sich ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Forschung wurde durchgeführt im Rahmen des Projekts mit dem Titel "Entwicklung und Industrialisierung von hochwertigen kosmetischen Rohstoffen aus marine Mikroalgen", durch das Ministerium der Ozeane und Fischerei, Korea gefördert und durch einen intramuralen Grant (2Z04930 unterstützt wurde) KIST Gangneung Institute of Naturprodukte.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HCT 116 ZellenATCCCCL-247
MEM (EBSS)HyklonSH30024.01
Fötales Kälberserum (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Lagern bei -20 ° C
Penicillin-StreptomycinHycloneSV30010
Trypsin-EDTA-LösungWelGeneLS 015-01
100 mmSchale Corning430161
6-Well-PlatteCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 Antikörperabcamab19030
Dithiothreitol (DTT)Roche10 708 984 001Lagertemperatur 2– 8 &Grad; C
MikroliterzentrifugenHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Lagertemperatur 2– 8 &Grad; C
CurcuminSigma-Aldrich (Fluka)78246Lagertemperatur 2– 8 &Grad; C
Mikrotubuli (MT)ZytoskelettMT001Bei 4 > lagern; C (getrocknet)
Einbettmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200Bei 4 & Grad lagern; C im Dunkeln
NatriumhydroxidSigma72068
MagnesiumchloridSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Bei -20 & deg lagern; C
DPBSWelGeneLB 001-02
Sonic DismembratorFisher ScientificModel 500
UltrazentrifugeBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Rinderserum Albumin (BSA)SigmaA7906
Molecular ImagerBio-RadChemiDoc XRS+Bei 4 Grad lagern; C
Proteinassay FarbstoffreagenzBio-Rad500-0006
α-tubulin (11H10) Kaninchen mAbZellsignalisierung2125
GAPDH (14C10) Kaninchen mAbZellsignalisierung2118
Anti-Tau (phospho S396) Antikörperabcamab109390
EGTASigmaE3889Raumtemperatur lagern
FastAP Thermosensitive alkalische PhosphataseThermo ScientificEF0651Bei -20 & Grad lagern; C
PMSFSigmaP7626Bei Raumtemperatur lagern
Phosphatase-Inhibitor CocktailZellsignalisierung5870Bei 4 & deg; C
Protease-Inhibitor CocktailZell-Signalgebung5871Bei 4 & deg; C
RIPA PufferSigmaR 0278Lagertemperatur 2– 8 &Grad; C
Tau-352 humanSigmaT 9950Bei -20 > lagern; C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Lager bei ca. 25 > C
PVDF-MembranBio-Rad162-0177
Ziegen-Anti-Maus-IgG-SekundärantikörperThermoFisherA-11005Bei 4 > C im Dunkeln
Konfokale MikroskopieLeica MicrosystemLeica TCS SP5
Natriumdodecylsulfat (SDS)Affymetrix75819
Protein AssayBio-Rad500-0006Bei 4 > C
Bei

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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