EIN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.

Zusammenfassung

Um das Überleben zu sichern, müssen die Organismen in der Lage sein, ungünstige Lebensräume zu vermeiden und gleichzeitig eine gleichbleibende Nahrungsquelle zu gewährleisten. Caenorhabditis elegans verändern ihre Lokomotionsmuster bei der Erkennung diverser Umwelteinflüsse und können ihre Abhängigkeit von Verhaltensreaktionen als Reaktion auf Hungerbedingungen modulieren. Nematoden zeigen typischerweise eine verringerte aversive Antwort, wenn sie aus einer Nahrungsmittelquelle für mehr als 30 min entfernt werden. Die Beobachtung von Verhaltensänderungen in Reaktion auf einen sich ändernden Ernährungsstatus kann Einblick in die Mechanismen geben, die den Übergang von einem gut gefütterten in den verhungerten Zustand regeln.

Wir haben einen Assay entwickelt, der die Fähigkeit eines Nematoden misst, eine aversive Barriere ( dh Kupfer) zu überqueren und dann über einen längeren Zeitraum eine Nahrungsquelle zu erreichen. Dieses Protokoll baut auf früheren Arbeiten auf, indem es mehrere Variablen in einer Weise integriert, die eine fortlaufende Datenerfassung ermöglicht, während sich die Organismen zu einemN zunehmend verhungert. Darüber hinaus erlaubt dieser Assay eine erhöhte Probengröße, so dass größere Populationen von Nematoden gleichzeitig ausgewertet werden können.

Organismen, die für die Fähigkeit, Kupfer zu erkennen oder zu reagieren, sofort die chemische Barriere kreuzen, während Wildtyp-Nematoden anfänglich abgestoßen werden. Da Wildtyp-Würmer zunehmend verhungert sind, beginnen sie, die Barriere zu überqueren und die Nahrungsquelle zu erreichen. Wir haben diesen Assay entworfen, um eine Mutante zu bewerten, die nicht in der Lage ist, auf verschiedene Umwelt-Cues zu reagieren, einschließlich der Nahrungsmittelempfindung oder des Nachweises von aversiven Chemikalien. Wenn sie über dieses Protokoll ausgewertet wurden, überquerten die defekten Organismen sofort die Barriere, waren aber auch nicht in der Lage, eine Nahrungsmittelquelle zu detektieren. Daher kreuzen diese Mutanten wiederholt die chemische Barriere, obwohl sie vorübergehend eine Nahrungsquelle erreichen. Dieser Assay kann einfach die Populationen von Würmern testen, um mögliche Wegdefekte im Zusammenhang mit Abneigung und Hunger zu bewerten.

Einleitung

Caenorhabditis elegans wurde als Modell für das Studium der Neurobiologie seit Jahrzehnten aufgrund der relativen Leichtigkeit bei der Analyse der Schaltungen eines Nervensystems aus nur 302 Neuronen ^{1 verwendet} . Vorausgesetzt, dass der Organismus auf die Reaktion auf Umwelt-Cues angewiesen ist, ist ein Großteil des Nervensystems der Regulierung der Integration von Umweltsignalen gewidmet ² . Trotz der Einfachheit seines Nervensystems kann C. elegans verschiedene Umweltsignale erkennen und darauf reagieren, einschließlich Repellents ³ , Lockstoffe ⁴ , Temperatur ⁵ und sogar Feuchtigkeit ⁶ . Ein nicht ordnungsgemäß Umweltsignale integrieren hat zu einer Reihe von Verhaltensstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Säugern Modellsystemen ^{7- 9} verbunden. Mit einer Reihe von verfügbaren neuralen Krankheit Modelle ¹⁰ in C. elegans und die Entwicklung von Nematoden-Pharma-Bildschirmen ¹¹ hat sich dieser Organismus als ein nützliches System für das Studium der Neurobiologie erwiesen. Angesichts der Verfügbarkeit eines abgebildeten Nematoden-Verbundes ¹ und Mutationen für fast jedes Gen im Nematoden-Genom ¹² ist unser Verständnis des Nematoden-Nervensystems und durch die Erweiterung unserer eigenen teilweise durch die Gestaltung von kreativ geeigneten Assays begrenzt.

Eine Reihe von Chemotaxis-Assays wurden in den letzten 40 Jahren entwickelt, um die Nematoden-Ansprechempfindlichkeit auf verschiedene aversive Stimuli ^{3 , 4 , 13 , 14 , 15} zu bewerten. Initiale Experimente waren die Einführung eines akuten Umwelteinflusses, während ein einziger Wurm auf einer Agarplatte durchstreifte= "Xref"> 3 ^{, 14 , 16} . Sofortige Änderungen der Lokomotionsreaktionen wurden aufgezeichnet. Zum Beispiel kann der flüchtige Geruchsstoff Octanol auf ein Haar aufgetragen werden und vor einem Nematoden der Nase geweht ¹⁷ die Einleitung rückwärts Fortbewegung in Wildtyp - Würmern zu stimulieren. Komplexere Assays wurden auch entwickelt, um mehrere Variablen als Mittel zur Bewertung der Verhaltensauswahl zu integrieren ¹⁸ . Eine Variation dieses Assays beinhaltet die Verwendung einer Kupferlösung, um eine aversive Mittellinienbarriere ⁴ zu erzeugen. Ein Lockmittel, nämlich Diacetyl, wurde auf einer Seite der chemischen Barriere mit Würmern, die von der Diacetylquelle weg übertragen wurden, platziert. Würmer defekt für Kupfer aversive Reaktionen sofort über die Barriere, um das Diacetyl zu erreichen, während Wildtyp-Würmer wurden zunächst von der Barriere abgelehnt. Responses wurden erzielt, als Würmer zuerst die Kupferbarriere nähertenOhne langfristige Beobachtungen.

Wenn Würmer ausgewertet werden nach Hungerbedingungen unterzogen, ihre Empfindlichkeit auf Umweltreize ¹⁹ verringert. Wenn das aversive chemische Octanol vor der Nematoden-Nase geweht wird, stimulieren Wildtyp-Organismen die Rückwärtsbewegung innerhalb von 3 - 5 s, wenn sie auf Nahrung sind. Nachdem diese Organismen 10 Minuten aus der Nahrung entfernt worden sind, zeigen sie eine verzögerte Reaktion von 8 - 10 s ²⁰ . So zeigen Nematoden mit erhöhtem Hunger eine verminderte aversive Reaktion auf schädliche Umweltsignale, da die Suche nach Nahrung für das Überleben wesentlich wird. Umgekehrt reagieren Nematoden, die den Neuropeptidrezeptor 9 ( npr-9) überexprimieren , nicht auf Octanol auf oder aus der Nahrung und zeigen eine Unfähigkeit, auf eine Anzahl von aversiven Reizen zu reagieren ²¹ . Diese npr-9 (GF) -Organismen modulieren auch nicht ihre Umkehrfrequenz in Gegenwart von Nahrung, sondern könnenUmgekehrt als Reaktion auf harte Berührungsstimulationen, die darauf hinweisen, dass sie in der Lage sind, Rückwärts-Fortbewegung ^{21 zu machen} . Wir haben auch npr-9 (LF) -Mutanten ausgewertet, da sie eine ungewöhnlich verminderte Umkehrfrequenz aus der Nahrung aufweisen und dennoch ihr Verhalten in Gegenwart von Nahrung modulieren können ²¹ . Die Kopplung des Ernährungszustandes des Wurms mit der Einführung akuter externer Reize hat bei der Aufklärung der Mechanismen unterstützt, mit denen ein lebensmittelbezogener Weg die sensorischen Signalwege ^{22 , 23} weitgehend modulieren kann. Die Anwesenheit von Speisen in der Nematodenumgebung wurde auch verwendet, um Ethanol-Entzugsantworten zu bewerten ²⁴ . In diesem Experiment wurden die Würmer in unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol inkubiert und dann auf eine Agarplatte mit einem Nahrungsmittelfleck, das als "Food-Race Assay" bekannt war, platziert. Der Nahrungsmittelfleck wurde auf eine Kante der Platte gelegt, während die Nematoden wVon der Nahrungsquelle entfernt. Der Ethanolentzug wurde durch Messung der Zeitdauer gemessen, die für die Würmer benötigt wurde, um den Lebensmittelfleck zu erreichen.

Dieser Nährstoff-basierte Kupfer-Aversion-Assay baut auf dem Food-Race-Assay auf, um zusätzliche Umgebungsvariablen, nämlich Nahrung und Kupfer, zu integrieren und dabei Verhaltensänderungen im Laufe der Zeit zu bewerten. Dies ist eine Anpassung eines gemeinnützigen Protokolls in der gesamten C. elegans- Gemeinschaft ⁴ . Dieses Protokoll wurde verwendet, um aversive Reaktionen und die Erkennung von Lebensmitteln über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten ²¹ . Da die Wurmaussetzveranstaltungen nach 30 min Nahrungsdeprivation ^{25 zeigen} , können wir auch beurteilen, wie sich Veränderungen des Ernährungszustands auf Umweltreaktionen auswirken können. Die Bedingungen dieses Assays messen, wie experimentelle Organismen die Reaktionsfähigkeit auf aversive Stimuli im Laufe der Zeit verändern und damit Verhaltensänderungen bewertenOrganismen Fortschritte in Richtung eines ausgehungerten Zustandes (und fortgesetzte Messungen des verlängerten Hungers). Da die npr-9 (GF) Tiere ihr Verhalten nicht als Reaktion auf Nahrung oder viele aversive Cues verändern, haben wir versucht zu erkennen, ob diese Verhaltensdefizite im Kontext des Hungers bestehen würden. Letztlich wurde dieses Assay-Design formuliert, um die npr-9 (GF) -Mutanten spezifisch zu bewerten, sondern kann auch angepasst werden, um auch neue Stämme zu charakterisieren.

Protokoll

1. Vorbereitung von experimentellen Organismen

1. Wählen Sie 10 L4 inszenierte Nematoden pro Stamm 24 h vor Beginn des Assays, um sicherzustellen, dass Organismen junge Erwachsene sind, wenn sie getestet werden. Für jede Mutante oder Kontroll-Nematode getestet, wählen Sie 10 L4s (10 für die Kontrolle und 10 für den Assay).
   1. Halten Sie L4-Organismen unter Verwendung der Standardmethoden ^{26 , 27} für 24 h auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coli seediert wurden. Wenn Organismen während der nachfolgenden Waschschritte verloren gehen, kompensieren Sie durch Erhöhung der Startprobengröße ( dh 20 Würmer anstatt 10).
      Anmerkung: Verhalten ist ein innig variabler Phänotyp. Führen Sie die Methode in dreifacher Ausfertigung für jede Belastung an drei getrennten Tagen durch. Fügen Sie zusätzliche Kontrollstämme und Bedingungen für neuartige Stämme ein, wie im Diskussionsbereich hervorgehoben.
2. Unmittelbar vor dem Test, Transfer experimentelle OrgaNismen zu einer Agarplatte ohne Bakterien und erlauben Nematoden, sich frei für 1 min zu bewegen, um überschüssige Bakterien zu entfernen.
   1. Wenn experimentelle Organismen während des 24 h vor dem Assay Kontamination Bedingungen erlebt haben, verwerfen sie.
3. 1 ml M9 auf die bakterienfreie Platte pipettieren, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen.
4. Zentrifuge bei 3.000 xg für 1 min. Würmer sollten ein Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmpellet zu stören. Füge 1 ml M9 zum Wurm-Pellet hinzu, umschleife die Röhrchen mit der Lösung.
5. Wiederholen Sie Schritte 1.4 drei weitere Male.
   1. Wenn überschüssige Bakterien zunächst mit den Würmern transferiert wurden, wiederholen Sie sich für insgesamt 5 mal. Keine Bakterien sollten auf die Kupfer-Food-Race-Platten übertragen werden. Wenn das Essen auf die Testplatte übertragen wird, wird es eine genaue Datenerfassung beeinträchtigen.
6. Nach der letzten Wäsche, Absaugen Überstand bis 10081, L von M9 und das Wurmpellet bleibt.
   Achtung: Verhungernde Verhaltensweisen werden nach 30 min deutlich. Folglich sollten die Würmer sofort aus der Lösung übertragen werden, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind.

2. Vorbereitung von Testplatten

1. Vorbereiten der Standard-NGM-Agarplatten zwei Tage vor dem Assay.
   1. Wenn die Platten in einer feuchten Umgebung gehalten werden, machen Agarplatten 3 Tage vor dem Test. Alternativ entfernen Sie den Deckel der Platte für 3 - 6 Stunden, um eine ordnungsgemäße Trockenheit zu gewährleisten (wenn in einer sterilen Umgebung).
2. Mit einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite der Platte entlang der äußeren Kante und eine andere, um eine Mittellinie Barriere ( Abbildung 1 ) zu bilden. Die Mittellinienbarriere sollte von jeder Kante der Platte gleich weit entfernt sein. Verwenden Sie ein Lineal, um genaue Messungen zu gewährleisten. Diese Linien dienen als Leitfaden bei der Übertragung von Bakterien und der Kupferlösung. Unter der Vorraussetzung, dassE. coli wird vor der Kupferlösung übertragen, diese Zeilen dienen als Indikatoren.
3. Samenplatte mit 50 μl OP50 E. coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen ( Abbildung 2 ). Die Bakterienkonzentration sollte über die Assays hinweg konsistent bleiben; Jedoch wurde eine kleine Variabilität in Reaktion auf leichte Konzentrationsunterschiede beobachtet.
   1. Benutze die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Vorausgesetzt, dass die Kupferlösung den Rand der Platte bildet und eine Mittelliniensperre bildet, übertragen die Bakterien, so dass die Kupferlösung nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommt.
4. Markieren Sie einen zweiten Satz von Platten und übertragen Sie keine OP50 E. coli zu ihnen ( Abbildung 2 ). Diese Platten dienen zur Bewertung der Negativkontrolle. Diese Platten sollten auch eineMarkierung auf einer Hälfte der Platte, um den ursprünglichen Transferursprung zu bezeichnen.
5. Bakterien trocknen lassen, dann die Platten bei 37 ° C über Nacht inkubieren. Sicherstellen, dass bakterielle Flecken bei der Übertragung auf einen 37 ° C Inkubator oder Raum nicht gestört werden. Übermäßige Störung könnte die Lage oder Form des Nahrungsmittelflecks verändern.

3. Chemotaxis-Assay

1. Frisch eine 0,5 M Kupfer (II) sulfatlösung vor der Teststartzeit vorbereiten. Sofern 125 μl der Lösung pro Platte verwendet werden, wird dieses Volumen abhängig von der Anzahl der verwendeten Testplatten ( z. B. 5 Testplatten, 625 μL) skaliert.
2. 100 μl der Kupfer (II) sulfatlösung am Rand des Agars pipettieren, um eine äußere Kupferbarriere zu erzeugen. Die markierte Unterseite der Platte sollte als Leitfaden dienen.
3. 25 μl der Kupfer (II) sulfatlösung pipettieren, um eine Mittellinienbarriere zu erzeugen.
   1. Stellen Sie sicher, dass sich die Kupfer (II) sulfatlösung ergibtEs kommt nicht mit dem Bakterienfleck in Berührung. Verwenden Sie eine gefleckte Technik als Streifen kann die Fortbewegung aufgrund von Einbuchtungen / Kratzer auf dem Agar beeinflussen.
4. Lassen Sie die Kupferlösung auf die Platte trocknen. Der Zeitraum kann je nach Platten- und Laborbedingungen variieren. Überprüfen Sie alle 5 Minuten nach der Übertragung auf Trockenheit.
   Anmerkung: Die Kupferlösung zeigt eine blaue Tönung und ist leicht zu identifizieren. Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Lösung in der Nähe des Randes der Platte leicht zu tupfen, um die Trockenheit zu erkennen .
5. 20 μl des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte pipettieren.
   1. Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich eingeschlossen waren, entfernen Sie sie, indem Sie mit Halogenkohlenstofföl pflücken, um sicherzustellen, dass keine Bakterien der Platte hinzugefügt werden. Jeder Assay sollte eine konsistente Anzahl von Nematoden während des Assays haben.
      HINWEIS: Wenn zu wenige Würmer transf sindFehlerhaft während der Assays, die Erhöhung der anfänglichen Stichprobengröße wird potenzielle Verluste während der Waschungen und Transfers abschwächen.
6. Entfernen Sie überschüssiges M9 aus der Platte mit einem Laborgewebe. M9 sollte nicht mit der Kupfer (II) sulfatlösung in Berührung kommen.
   Achtung: Sicherstellen, dass die Würmer und die Agaroberfläche bei dieser Ausführung unberührt bleiben. Wenn es zu hart verwendet wird, kann das Laborgewebe Vertiefungen auf die Agaroberfläche der Platte erzeugen und Würmer entfernen. Würmer, die zufällig über KimWipe entfernt wurden, sollten verworfen werden.
7. Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer mit nicht-flüssigen Lokomotionsmustern begonnen haben, starten Sie die Teststoppuhr.
   1. Optimal entfernen Sie die M9-Lösung innerhalb eines min. Der wesentliche Parameter ist die Identifizierung der sinusförmigen Fortbewegung. Würmer locomote anders, z. B. Thrash anstatt sinusförmig, wenn in Flüssigkeit. Starten Sie die Assay Stoppuhr einmal jedes der experimentellen OrgelIsms hört auf zu schlagen
8. Überprüfen Sie alle 30 min.
   1. Für die Assay-Platten mit bakteriellen Patches, positiv Score-Organismen, wenn sie die Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden erreichen. Für die negativen Kontrollplatten, positiv Kerbe Organismen, wenn sie die Barriere überschritten haben.

Ergebnisse

Wir nutzten Wildtyp (N2), npr-9 (tm1652) und einen npr-9- Überexpressionsstamm, dh npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), um Antworten auf Hunger und Kupferabwehr zu bewerten. Wildtyp-Organismen sind in der Lage, die aversive Kupferbarriere zu detektieren und zu reagieren, während npr-9 (GF) -Mutanten keine aversive Antwort auf das Kupfer über den 4 h-Assay ²¹ auslösen. Nach 30 min Ve...

Diskussion

Diese Assay-Konstruktion modifiziert den Nahrungsmittel-Race-Assay ²⁴ , um eine Kupferlösung zu umfassen, um eine aversive Mittellinien-Barriere und um den Rand der Platte zu schaffen, um einen Verlust von Nematoden zu verhindern. Organismen sind auf ihre Fähigkeit, die aversive Barriere zu überqueren und erreichen ein Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden getestet. Im Kontext von npr-9 (GF) haben wir diesen Assay verwendet, um zu bewerten, wie Hungerbedingungen aversive R...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
M9 Lösung [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O auf 1 Liter. Vor der Verwendung autoklavieren, um zu sterilisieren.]			Im Labor hergestellt
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Wasser verwenden, um eine Konzentration von 0,5 M zu erreichen