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Methodenartikel

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

7.6K Ansichten

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DOI:

10.3791/55942

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15. Dezember 2017

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1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.

Zusammenfassung

Murine Modellen der Erkrankung sind unverzichtbar für die wissenschaftliche Forschung. Jedoch sind viele diagnostische Hilfsmittel wie Endoskopie oder computertomographischen Bildgebung nicht routinemäßig in Tiermodellen eingesetzt. Konventionellen experimentellen Messwerte verlassen sich oft auf post-mortem und ex-Vivo Analysen, die intra-individuelle Nachuntersuchungen zu verhindern und erhöhen Sie die Anzahl der Studie Tiere benötigt. Fluoreszenz-vermittelten Tomographie ermöglicht eine nicht-invasive, sich wiederholende, quantitative, dreidimensionale Beurteilung der fluoreszierende Sonden. Es ist sehr empfindlich und ermöglicht den Einsatz von molekularen Entscheidungsträger, die für die spezifische Erkennung und Charakterisierung von unterschiedliche molekulare Targets ermöglicht. Insbesondere stellen gezielte Sonden ein innovatives Tool für die Analyse der Genexpression Aktivierung und Protein in Entzündung, Autoimmun-Krankheit, Infektion, arterielle Verschlusskrankheit, Zellwanderung, Tumorgenese usw.dar. In diesem Artikel bieten wir schrittweise Anleitungen auf dieser anspruchsvollen imaging-Technologie für die in-Vivo -Erkennung und Charakterisierung von Entzündungen (z.B. F4/80-Positive Makrophagen eindringen) in einer weit verbreiteten Mausmodell der Darm-Entzündung. Diese Technik kann auch in anderen Forschungsbereichen wie immun Zelle oder Stammzell-Tracking verwendet werden.

Einleitung

Tiermodelle sind weit verbreitet in der wissenschaftlichen Forschung, und viele nicht-invasiven Verfahren existieren, um Monitor Krankheitsaktivität und Vitalität, wie z. B. die Quantifizierung der Gewichtsveränderungen oder die Analyse von Blut, Urin und Kot. Diese sind jedoch nur indirekte Surrogatparameter, die auch interindividuelle Variabilität unterliegen. Sie müssen häufig durch post-mortem Analyse der Gewebeprobe, die serielle Beobachtung zu sich wiederholenden Zeitpunkten verhindert ergänzt werden und direkte Beobachtung der physiologische oder pathologische Prozesse in Vivo. Raffinierte kleine Tier bildgebende Verfahren entstanden einschließlich cross-sectional Imaging, optische Bildgebung und Endoskopie, ermöglicht die direkte Visualisierung dieser Prozesse und ermöglicht auch für sich wiederholende Analysen der gleichen Tiere1 , , 2 , 3. Darüber hinaus die Möglichkeit, die verschiedenen Stadien der Krankheit im gleichen Tier wiederholt überwachen könnte verringern die Zahl der Tiere notwendig, die aus Sicht der Tierethik wünschenswert sein könnte.

Verschiedene optische bildgebende Techniken existieren für die in Vivo Fluoreszenz-Bildgebung. Ursprünglich war konfokale Bildgebung eingesetzt, um die Oberfläche und Untergrund fluoreszierende Veranstaltungen4,5zu studieren. Jedoch vor kurzem, wurden tomographische Systeme, die für quantitative dreidimensionale Gewebe Bewertungen ermöglichen entwickelten6. Dies wurde durch die Entwicklung von fluoreszierenden Sonden erreicht, die Licht in das Nah-Infrarot (NIR) Spektrum, mit geringen Absorption, empfindliche Detektoren und monochromatischen Lichtquellen7emittieren. Während traditionelle Querschnitts-bildgebende Verfahren wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), setzen vor allem auf physikalische Parameter und Morphologie visualisieren, kann optische Bildgebung zusätzliche Informationen bereitstellen auf die zugrunde liegenden molekularen Prozesse Sonden mit endogenen oder exogenen fluoreszierende8.

Fortschritte in der Molekularbiologie haben dazu beigetragen, um die Generation der intelligente und gezielte fluoreszierenden molekularen Sonden für eine steigende Anzahl von Zielen zu erleichtern. Zum Beispiel können Rezeptor-vermittelte Aufnahme und Verteilung in einem bestimmten Zielgebiet mit Carbocyanine Derivat-markierten Antikörpern9visualisiert werden. Die Fülle an verfügbaren Antikörper, die als spezifische Tracer in sonst unzugänglichen Bereichen des Körpers funktionieren bezeichnet werden kann, bietet noch nie dagewesene Einblicke in die molekularen und zellulären Prozesse in Modellen der Tumorgenese und Neurodegenerative, Herz-Kreislauf-, immunologische und entzündliche Krankheiten7.

In dieser Studie beschreiben wir die Verwendung der Fluoreszenz-vermittelten Tomographie in einem Mausmodell der Kolitis. Dextran Natriumsulfat (DSS)-induzierte Kolitis ist eine chemisch induzierten Maus Standardmodell der Darmentzündung, die entzündliche Darm-Krankheit (IBD)10ähnelt. Es ist besonders nützlich, um den Beitrag des angeborenen Immunsystems zur Entwicklung der Darm Entzündung11zu bewerten. Da die Rekrutierung, Aktivierung und Infiltration von Monozyten und Makrophagen entscheidende Schritte in der Pathogenese der IBD vertreten, sind Visualisierung ihrer Einstellung und die Kinetik der Infiltration unerlässlich, um Überwachung, z. B. die Wirkung von mögliche therapeutische Substanzen in einem präklinischen Einstellung12. Wir beschreiben die Induktion der DSS Kolitis und demonstrieren die Tomographie-vermittelten Charakterisierung von Makrophagen Eindringen in die Darm-Schleimhaut mit molekularen Fluoreszenz-Tomographie für die spezifische Visualisierung des Markers Monocyte/Makrophagen F4/80 13. Darüber hinaus illustrieren wir Hilfs- und ergänzende Verfahren, z. B. Antikörper Kennzeichnung; der experimentelle Aufbau; und Analyse und Interpretation der erhaltenen Bilder, in Korrelation mit herkömmlichen Anzeigen wie Krankheit Aktivität Indizes, flow Cytometry und histologische Analyse und Immunohistochemistry. Wir diskutieren Einschränkungen dieser Technik und Vergleiche mit anderen bildgebenden Verfahren.

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Protokoll

Alle Tierversuche stimmten der Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt Und dieser (LANUV) Nordrhein-Westfalen nach dem deutschen Gesetz über Tier (Tierschutzgesetz).

(1) Materialien und Versuchsaufbau

  1. Pflege der Tiere.
    1. Verwenden Sie aufeinander abgestimmt von Geschlecht und Alter Mäuse DSS-anfälligen Sorte (z.B. C57BL/6) bei 20-25 g Körpergewicht.
    2. Planen Sie mindestens fünf oder mehr Mäuse pro Versuchsgruppe und Haus der Mäuse nach lokalen Tierpflege Richtlinien.
    3. Geben Sie ein standard Nagetier Chow, Ernährung und autoklaviert Trinkwasser Ad Libitum.
    4. Entfernen Sie den standard Chow und ersetzen Sie es mit Luzerne-freie Chow mindestens drei Tage vor dem Scannen um endoluminale Auto-Fluoreszenz zu reduzieren.
  2. Induktion von akuten DSS-induzierten Kolitis.
    1. Lösen Sie 2 g des DSS (Molekulargewicht ~ 40.000 Da) in 100 mL autoklaviert Trinkwasser um 2 % (w/V Lösung) zu erhalten.
    2. Füllen Sie die Trinkwasser Versorgung der Mäuse ausschließlich mit der DSS-Lösung und schätzen Sie 5 mL Flüssigkeit pro Maus pro Tag zu. Bereitstellen Sie die gleichen Trinkwasser ohne DSS, die Mäuse10.
      Hinweis: Überwachen Sie die Mäusen täglich bis zum Ende des Experiments. Die Mäuse, die größer als 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren oder werden sterbenden, einschläfern (d. h. dauerhaft gebeugt Haltung, verminderte Bewegung, Atmung gearbeitet, deutlich Mantel errichten) nach lokalen Vorschriften auf Tier Wohlfahrt.
  3. Vorbereitung der Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.
    1. Beschriften Sie den gewünschten Antikörper (z. B. Ratte Anti-Maus F4/80) mit Fluoreszenz-Farbstoff (z. B. Cyanine7, λErregung: 750 nm, λEmission: 776 nm) wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Dialyse gereinigte Antikörper in einer entsprechenden Dialysemembran (Porengröße < 50-100 kDa) gegen 1 L 0,15 M Natriumchlorid für mindestens 2 Stunden oder über Nacht.
      1. Den Antikörper auf 1 L von 0,1 M Nahco33 übertragen und Dialyse für mindestens 2 h.
      2. Die erforderliche Menge an fluoreszierenden Farbstoff in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen (10,8 µL/mg des Antikörpers) und der Antikörper-Projektmappe hinzufügen. Verwenden der Fluoreszenzfarbstoff in 20-fold Molaren Überschuß ein Farbstoff-Protein-Verhältnis von 1:3 zu erreichen.
      3. Brüten im Dunkeln bei 4 ° C für 1 h entfernen unmarkierten Antikörper durch Dialyse gegen 1 L 0,15 M Natrium oder mithilfe einer PD-10 Entsalzung Spalte und in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für in-Vivo -Anwendung zu beheben.
      4. Bestimmen Sie die endgültige Antikörperkonzentration und Kennzeichnung Verhältnis durch Spektralphotometrie.
      5. Messen Sie die Proteinkonzentration bei einer Aufnahme von 250-330 nm und prüfen Sie, zusätzliche Absorption durch den Farbstoff. Korrigieren Sie die maximale Absorption bei 280 nm (Protein) um 11 % der maximalen Absorption bei 750 nm (nächster Schritt) für die Bezeichnung Cyanine7.
      6. Eine Verdünnung der Verbindung (in der Regel 01:10) bei 250-800 nm zu messen und extrahieren Sie die Konzentration der Cyanine7 bei 750 nm.
      7. Bestimmen Sie die Farbstoff-Protein-Verhältnis als: Farbstoff/Antikörper = maximale Absorption bei 750 nm / 200.000 / (maximale Absorption bei 280 nm - 0,11 x max Absorption bei 750 nm) / 170.000.
      8. Aufzubewahren Sie die Antikörperlösung bei 4 ° C und schützen Sie es vor Licht, Bleichen vor der Injektion zu vermeiden.
    2. Ladevolumen der notwendigen Antikörper-Lösung in eine sterile Spritze unmittelbar vor der Injektion und Schild aus Licht bis es verwendet wird.
    3. Bestimmen Sie den optimalen Zeitpunkt der Sonde Injektion und den Scanvorgang, je nach Tracer Pharmakokinetik.
    4. Betäuben Sie die Mäuse, die mit 1,5-2,5 % inhaliert Isofluran in Sauerstoff zu oder sie sicher in einer dedizierten Restrainer für die Rute Vene Einspritzung der beschriftete Antikörper.
    5. Für Full-length Antikörper injizieren der beschriftete Antikörper mindestens 24 h vor dem Scannen, z. B. für Anti-Maus F4/80 Makrophagen Visualisierung in murinen Kolitis. Mäuse intravenös zu injizieren (i.v.) über das Heck Vene mit beschriftete Antikörper in Höhe 2,0 Nmol des Farbstoffes.
    6. Verwendung beschriftet ebenso unspezifische Antikörper (z. B. Ratte IgG oder einer anderen Isotype entspricht dem Primärantikörper Erbe) als Isotype Kontrolle in Dosen entsprechen, die von der Sonde.
      Hinweis: Die Ergebnisse der in-Vivo scannt nach Injektion der Steuerung Verbindung als Referenz für die Auslegung der speziellen Sonde Bilddaten dienen kann.
    7. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer um zu rasieren, das Fell der Tiere in der Bauchregion, helle Reflexion und Absorption zu minimieren.

2. technische Ausstattung

  1. Verwenden Sie ein Veterinär Fluoreszenz-vermittelten Tomographie (FMT) Gerät für kleine Tier Fluoreszenz ( Abbildung 4).
  2. Erstellen Sie eine neue Studie für jedes Projekt durch Klicken auf die "neue Studie"-Taste und die Studie Beschreibung der relevanten Tracer, einschließlich der bildgebenden Parameter und Dosen für zukünftige Referenz enthalten.
  3. Im Rahmen dieser Studie erstellen Lerngruppen entsprechend der jeweiligen Studiendesign (z. B. für die spezifischen Tracer und unspezifischen Isotype Kontrolle) durch Klicken auf die "neue Studiengruppe" Taste. Rüsten Sie jede Studiengruppe mit der jeweiligen Anzahl von Tieren.
  4. Das System für die Tracer-Konstrukte zu kalibrieren.
    1. Führen Sie die Kalibrierung für jede Charge von Tracern zu normalisieren die Variation in der Kennzeichnung und quantitative Messung von OI-Daten ermöglichen.
    2. Befolgen Sie das Instrument des Herstellers Anleitung zur Kalibrierung von jedem einzelnen System; nach der Auswahl von "Hinzufügen neuer Tracer" wird das System einen Leitfaden durch die einzelnen Schritte bieten. Bieten Sie die Verdünnung der angewandten Antikörper-Lösung und die berechnete absolute Konzentration der Tracer in der Sonde.
    3. Verwenden Sie für FMT eine Nachahmung von Gewebe Phantom der definierten Dicke und Absorption Eigenschaften (ähnlich wichtige Gewebe) und füllen Sie ihn mit einem bestimmten Volumen der Antikörper-Lösung verwendet. Messen Sie dies auf dem FMT-Gerät.
      Hinweis: Das System wird die Referenzmessung der mitgelieferten Sonde, zusammen mit der vorgegebenen Konzentration verwenden, um absolute Tracer Konzentrationen von zukünftigen in Vivo Messungen zu berechnen.
  5. Verwenden Sie eine beheizbaren Prüfung Kassette mit einer Temperatur von 42 ° C.
    Hinweis: Dies verhindert die Mäuse hypothermen während der Untersuchung.

3. Tier Anästhesie

  1. Verwenden Sie einen kontinuierlichen Fluss von 1,5-2 % Vol % Isofluran ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) und 1,5 L O2/min um die Mäuse zu betäuben.
Verwenden Sie speziell entwickelte Inhalation Systeme für Nagetier Anästhesie (Isofluran Vaporizer) einfach die Narkose tiefe Steuern und Personal minimieren.
  • Platzieren Sie den Mauszeiger in der Kammer dicht Induktion und schalten Sie den Verdampfer Isoflurane Versorgung (100 % (V/V), 5 Vol-% Sauerstoff, 3 L/min). Überwachen Sie die Maus bis Liegerad und bewusstlos ist.
  • Legen Sie es in der Prüfung-Kassette für Tomographie mit kontinuierlichen Isofluran Inhalation über Bugnase bei einer Dosis von 100 % V/V, 1,5 Vol% Sauerstoff, 1,5 L/min, Bewegungsartefakte während der Untersuchung zu minimieren. Gelten Sie für Verfahren, die länger als 5 min Augensalbe für die Maus Augen Hornhaut Schaden zu verhindern.
  • Bewerten Sie Narkose Tiefe durch die Überprüfung der Reflexe. Legen Sie die Maus auf den Rücken; Wenn Anästhesie ausreicht, sollte die Maus nicht umdrehen. Klemmen Sie die Maus sanft zwischen seinen Zehen; Wenn Anästhesie ausreicht, wird das Bein nicht zurückgezogen (chirurgische Toleranz) sein.

    • (4) Fluoreszenz-vermittelten Tomographie Scan

    Hinweis: Passen die folgenden Details, die speziell für die FMT-Systematik in diesem Studie (siehe die Tabelle der Materialien) für alternative Fluoreszenz Reflexion imaging-Geräte oder FMT-Systeme, je nach Bedarf.

    1. Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf dem Rücken in der Prüfung-Kassette.
    2. Führen Sie den Scanvorgang.
      1. Setzen Sie die Kassette in das Abbildungssystem und schließen Sie es sofort, um kontinuierliche Anästhesie zu gewährleisten. Wählen Sie die entsprechende Probe aus der Studiengruppe, die zuvor erstellte. Wählen Sie die verabreichte Tracer aus dem Dropdown-Menü um sicherzustellen, dass die Werte für Tracerkonzentration richtig berechnet werden.
      2. Fluoreszenzbild Reflexion bei der entsprechenden Wellenlänge zu erwerben (720 nm für Cyanine7) für Scan Planung und Gliederung der Scan-Bereich durch Anklicken des Buttons "Bild holen".
      3. Sehen Sie, dass das Scan-Feld als Overlay auf Reflexion Fluoreszenzbild erscheint. Anpassen, um die Region von Interesse (z. B. Darm oder Bauch), Luft oder Bereiche der restlichen Fell zu vermeiden. Je nach Bildziel Anzahl der Bild Datenpunkte im Scan-Bereich durch Auswahl aus dem groben auf mittlerer und feiner Auflösung der Scan-Bereich im Menü auf der rechten Seite.
        Hinweis: Denken Sie daran, dass ein Feinscan Feld bessere räumlichen Auflösung auf Kosten deutlich längere Scanzeiten bieten könnte.
      4. Daten/Bildaufnahme bei der ausgewählten Wellenlänge zu starten, indem Sie auf "Scannen".
        Hinweis: Die Scan-Zeit für eine mittelfeine Scan des gesamten Abdomens werden rund 5 min; in dieser Zeit jeden Datenpunkt wird separat von der Erregung Laser beleuchtet, und die daraus resultierende Fluoreszenz aufgezeichnet.
      5. Das Tier aus der bildgebenden Kassette am Ende des Scans und lassen Sie das Tier wieder vollständig, bevor sie zurück in den Käfig platziert.
      6. Das FMT zu wiederholen, falls notwendig, zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments (z. B. Tage 0, 5 und 9-10 (Ende des Experiments)), aber die Anhäufung von Antikörper im Körper, was die Fluoreszenz Hintergrundsignal betrachten.

    5. Post-scan

    1. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem separaten Käfig auf einem Papiertuch unter einem Rotlicht-Wärmelampe und überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Unbehagen oder Stress bis zur endgültigen Genesung. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in seinem jeweiligen Käfig wenn ganz wach.
    2. Die Mäuse am Ende des Experiments durch die Lieferung von CO2 an den Isolator bei einer Dosis von 100 % (V/V), 100 Vol% und 3 L/min einschläfern. Nicht vorab füllen Sie die Kammer mit CO2, als eine plötzliche Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CO2 not verursachen dürfte. Überprüfen Sie Tod, nachdem die Maus durch einen anschließenden sekundären Modus der Sterbehilfe wie schnelle zervikale Dislokation atmen aufgehört hat.
    3. Explant Dickdarm durch abdominale Laparotomie und führen einen ex-Vivo -Scan der explantierten Doppelpunkt, wie in Schritten 4.2.1 - 4.2.4 erläutert. Öffnen Sie jedem Doppelpunkt längs mit chirurgischen Metzenbaumschere und spülen Sie gründlich mit Kochsalzlösung vor bereitet sie für die weitere Analyse.
    4. Verwenden Sie ein Skalpell schneiden ein 0,5-cm-Fragment aus dem distalen Dickdarm und sofort in eine Kryo 1,5-mL-Tube statt. Frieren Sie in flüssigem Stickstoff und Store bei-70 ° C bis zur weiteren Verwendung (z.B.Myeloperoxidase (MPO) Messungen ein).
    5. Verwenden Sie einen Holzstab und die restlichen längs eröffnete Doppelpunkt aus dem distalen proximalen Ende mit der Schleimhaut nach außen ("Swiss Roll-Technik"), für histologische Analysen aufrollen. Legen Sie die Vorbereitung in ein Fixiermittel (siehe die Tabelle der Materialien) und bei-80 ° C14einfrieren.

    6. Daten Rekonstruktion und Interpretation

    1. Verwenden der Rekonstruktions-Werkzeug für die jeweilige Software zur Abbilderstellung 3D-Karten der Fluoreszenz-Verteilung aus der rohen Bilddaten zu erstellen; Scans zu Rekonstruktions-Werkzeug, wenn beim Scannen automatisch hinzukommen, die Funktion "zur Rekonstruktion Warteschlange hinzufügen" ausgewählt ist.
      1. Andernfalls wählen Sie die Scans aus dem Dropdown-Menü unter der jeweiligen Studie und Studiengruppe, mit der rechten Maustaste des Scans, und wählen Sie "add to Wiederaufbau."
    2. Zur weiteren Analyse laden Sie ein Datensatzes in der Analyse-Software. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü in der oberen Leiste die jeweilige Studie und wählen Sie dann aus dem Menü auf der rechten Seite der Study Group und das einzelne Tier; alle Scans durchgeführt für dieses Tier werden angezeigt. Wählen Sie den richtigen Scan und klicken Sie auf "laden".
      Hinweis: Die 3D-Rekonstruktion der Tracerverteilung wird als Überlagerung der ursprünglich erworbenen Fluoreszenzbild Reflexion auf der linken Seite angezeigt. Das Modell kann gedreht und vergrößert für einfachere Analyse.
    3. Brennpunkte der unspezifischen Label Akkumulation (z. B. Leber oder Urin Blase) auf rekonstruierten 3D-Karten zu identifizieren und unterscheiden von Zielgeweben (z. B. Darm oder Darm).
    4. Wählen Sie in der oberen Leiste die ROI-Form am besten geeignet für das Ziel. Label Zielgewebe wie Regionen von Interesse (ROI) indem man den jeweiligen Messwerkzeuge in der Analyse-Software; die Software liefert eine Fluoreszenzintensität für den ROI, sowie (Pico) molare Mengen des Tracers, die für der Scan kalibriert wurde.
    5. Wählen Sie den Gesamtbetrag der Tracer in die entsprechenden ROI, normalisiert die ROI-Größe, als das am besten geeignete Äquivalent zur Beurteilung der Krankheitsaktivität im Zusammenhang mit entzündlichen Infiltrat (Histologie).
      Hinweis: Weitere Features des ROI können gegebenenfalls als repräsentativ für das jeweilige Modell gewählt werden.

    7.Ex-Vivo Analysen

    1. Hämatoxylin und Eosin Färbung und Immunfluoreszenz-Färbung.
      1. Deparaffinize Abschnitte, indem man sie in 70 % igem Ethanol (EtOH) für 2 min; anschließend mit destilliertem Wasser abspülen. Färben mit Hämatoxylin Lösung für 5 min und anschließend mit warmem Leitungswasser für 10 min spülen.
      2. Mit destilliertem Wasser spülen Sie ab, Gegenfärbung mit Eosin-Lösung für 2 min, und wieder mit destilliertem Wasser abspülen.
      3. Ort in 70 % EtOH, 96 % EtOH, 99 % EtOH und Xylol (2 Mal) für 2 min pro zu entwässern und die Abschnitte zu löschen. Mit harzigen Eindeckmedium montieren.
    2. Immunfluoreszenz-Färbung.
      1. Verwenden Sie die zuvor erhaltenen Gewebeschnitte ("Swiss-Roll") für Immunfluoreszenz-Färbung und bereiten Sie Cryo-Schnitt Abschnitte von 7 µm.
      2. Blockieren Sie Aceton fixiert und gefrorenen Doppelpunkt Abschnitte in 5,0 % Ratte Serum für 10 min zu und inkubieren Sie über Nacht mit verdünnter (1/500 V/V) biotinylierte primäre Ratte Anti-Maus F4/80 Antikörper. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) und inkubieren Sie mit Streptavidin-FITC (1: 100 V/V) in PBS/BSA (0,1 % w/V) über Nacht bei 4 ° C.
      3. Waschen Sie die Abschnitte in TBS und Flecken mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1: 1000 V/V) Kontrast zu erzielen. Fluoreszenzbilder unter einem confocal Mikroskop analysieren (siehe die Tabelle der Materialien; 40 X Vergrößerung; Filter Cube N2.1 mit Erregung Filter 515-560) und zählen die F4/80-positiven Zellen pro Hochleistungs-Feld.
        Hinweis: Verwenden Sie Antikörper Klon und Format beim in-Vivo FMT und post-mortem Histologie Analysen wie Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz-Färbung, je nachdem das beabsichtigte Ziel zu kombinieren. Für die Erkennung von F4/80-Positive Makrophagen in Vivo und ex Vivowurden unterschiedliche Formate verwendet.
    3. MPO-Messungen im Dickdarm Proben.
      1. Verwendung bezogen frisch, PBS gespült Doppelpunkt Proben oder aufgetauten Probe für MPO Messungen. Wiegen alle Proben und homogenisieren des Gewebes in Lyse Puffer im ELISA kit (siehe die Tabelle der Materialien), bei einem Volumen von 20 µL der Lyse Puffer pro mg des Gewebes.
      2. Beschallen für 15 s (Ultraschall-Frequenz: 20 kHz, Leistung: 70 W) und Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 200 x g und 4 ° C.
      3. Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA kit (siehe die Tabelle der Materialien) laut Hersteller Beschreibung. Führen Sie den Test in Duplikate.

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    Ergebnisse

    Bewertung der Colitis:

    DSS-induzierte Kolitis ist eine chemisch induzierten Mausmodell der Darmentzündung, die ähnelt menschlichen IBD und führt zu Gewichtsverlust, rektale Blutungen, oberflächliche Ulzeration und Schleimhaut Schaden anfällig Mäuse15. Es ist besonders nützlich, um den Beitrag des angeborenen Immunsystems zur Entwicklung der Darmentzündung10,

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    Diskussion

    Obwohl medizinische bildgebende Verfahren in den letzten Jahren rasant entwickelt haben, sind wir noch in unsere Fähigkeit, entzündliche Prozesse oder Tumoren sowie andere Krankheiten in ihren frühesten Stadien der Entwicklung erkennen begrenzt. Dies ist jedoch entscheidend zum Verständnis Tumorwachstum, Invasion, oder Metastasen Entwicklung und zelluläre Prozesse bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen und degenerative, Herz-Kreislauf- und immunologischen Erkrankungen. Herkömmliche bildgebende Verfahren basie...

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    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    Wir danken Frau Sonja Dufentester, Frau Elke Weber und Frau Klaudia Niepagenkämper für die hervorragende technische Unterstützung.

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    ReagentsAlfalfa-freie
    DiätHarlan Laboritories, Madison, USA2014
    Bepanthen AugensalbeBayer, Leverkusen, Deutschland80469764
    Dextransulfat-Natrium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SchwedenDB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandE 4382
    Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, DeutschlandB506
    Hämatoxylin                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandHHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek Compound                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Niederlande4583Fixiermittel für histologische Analysen
    Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBSLonza, Verviers, Belgien4629
    Natriumchlorid 0,9%Braun, Melsungen, Deutschland12211095.05.0411
    NatriumbicarbonatpulverSigma Aldrich Deisenhofen, DeutschlandS5761
    StandarddiätAltromin, Lage, Deutschland1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Niederlande4566
    Hämoccult (Guajakpapiertest)Beckmann Coulter, Deutschland3060
    Biotin Ratten-Anti-Maus Anti-F4/80 AntikörperSerotec, Oxford, UKMCA497B
    Biotin Ratten-Anti-Maus Anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland553125
    Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, DeutschlandS-11225Anregungs-/Emissionsmaximum:  556/573nm
    Anti-CD11b-Ratten-Anti-Maus-Antikörper TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
    Gereinigter Anti-Maus-Antikörper F4/80BioLegend, London, UK123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandD9542
    FITC-konjugierter Anti-Ly6C-Ratten-Anti-Maus-AntikörperBD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland553104
    FACS-PufferBD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare  Europa, Freiburg, DeutschlandPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, DeutschlandK 6631B
    Cy5.5 markierter Anti-Maus F4/80 AntikörperBioLegend, London, UK123127gebrauchsfertig markierte Antikörper (alternativ)
    Anti-Maus F4/80 Antigen PerCP-Cyanin5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80gebrauchsfertig markierte Antikörper (alternativ)
    DMSO (Dimethylsulfoxid)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland67-68-5
    IsofluranSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland792632
    EthanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland64-17-5
    Rinderserumalbumine (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandA4612
    Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandSRE0032
    Name<>UnternehmenKatalognummerKommentare
    Ausrüstung
    FACS Calibur Durchflusszytometrie-SystemBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Deutschland
    FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAin FMT2000
      35578 Wetzlar, Deutschland DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, DeutschlandHD 2070Ultraschall-Homogenisator
    Einweg-Skalpell Nr. 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandZ692395-10EA
    Metzenbaum Schere 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Deutschland22398330
    Luer-Lock-Spritze 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandZ248010
    SpritzennadelnSigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandZ192368 
    Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgien352070
    Leica DMLB Fluoreszenzmikroskop enthalten, Leica,

    Referenzen

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
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