Method Article

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

DOI:

10.3791/55942

⸱

December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murine Modellen der Erkrankung sind unverzichtbar für die wissenschaftliche Forschung. Jedoch sind viele diagnostische Hilfsmittel wie Endoskopie oder computertomographischen Bildgebung nicht routinemäßig in Tiermodellen eingesetzt. Konventionellen experimentellen Messwerte verlassen sich oft auf post-mortem und ex-Vivo Analysen, die intra-individuelle Nachuntersuchungen zu verhindern und erhöhen Sie die Anzahl der Studie Tiere benötigt. Fluoreszenz-vermittelten Tomographie ermöglicht eine nicht-invasive, sich wiederholende, quantitative, dreidimensionale Beurteilung der fluoreszierende Sonden. Es ist sehr empfindlich und ermöglicht den Einsatz von molekularen Entscheidungsträger, die für die spezifische Erkennung und Charakterisierung von unterschiedliche molekulare Targets ermöglicht. Insbesondere stellen gezielte Sonden ein innovatives Tool für die Analyse der Genexpression Aktivierung und Protein in Entzündung, Autoimmun-Krankheit, Infektion, arterielle Verschlusskrankheit, Zellwanderung, Tumorgenese usw.dar. In diesem Artikel bieten wir schrittweise Anleitungen auf dieser anspruchsvollen imaging-Technologie für die in-Vivo -Erkennung und Charakterisierung von Entzündungen (z.B. F4/80-Positive Makrophagen eindringen) in einer weit verbreiteten Mausmodell der Darm-Entzündung. Diese Technik kann auch in anderen Forschungsbereichen wie immun Zelle oder Stammzell-Tracking verwendet werden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tiermodelle sind weit verbreitet in der wissenschaftlichen Forschung, und viele nicht-invasiven Verfahren existieren, um Monitor Krankheitsaktivität und Vitalität, wie z. B. die Quantifizierung der Gewichtsveränderungen oder die Analyse von Blut, Urin und Kot. Diese sind jedoch nur indirekte Surrogatparameter, die auch interindividuelle Variabilität unterliegen. Sie müssen häufig durch post-mortem Analyse der Gewebeprobe, die serielle Beobachtung zu sich wiederholenden Zeitpunkten verhindert ergänzt werden und direkte Beobachtung der physiologische oder pathologische Prozesse in Vivo. Raffinierte kleine Tier bildgebende Verfahren entstanden einschlie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuche stimmten der Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt Und dieser (LANUV) Nordrhein-Westfalen nach dem deutschen Gesetz über Tier (Tierschutzgesetz).

(1) Materialien und Versuchsaufbau

  1. Pflege der Tiere.
    1. Verwenden Sie aufeinander abgestimmt von Geschlecht und Alter Mäuse DSS-anfälligen Sorte (z.B. C57BL/6) bei 20-25 g Körpergewicht.
    2. Planen Sie mindestens fünf oder mehr Mäuse pro Versuchsgruppe und Haus der Mäuse nach lokalen Tierpflege Richtlinien.
    3. Geben Sie ein standard Nagetier Chow, Ernährung und autoklaviert Trinkwasser Ad Libitum.
    4. En....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bewertung der Colitis:

DSS-induzierte Kolitis ist eine chemisch induzierten Mausmodell der Darmentzündung, die ähnelt menschlichen IBD und führt zu Gewichtsverlust, rektale Blutungen, oberflächliche Ulzeration und Schleimhaut Schaden anfällig Mäuse15. Es ist besonders nützlich, um den Beitrag des angeborenen Immunsystems zur Entwicklung der Darmentzündung10,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obwohl medizinische bildgebende Verfahren in den letzten Jahren rasant entwickelt haben, sind wir noch in unsere Fähigkeit, entzündliche Prozesse oder Tumoren sowie andere Krankheiten in ihren frühesten Stadien der Entwicklung erkennen begrenzt. Dies ist jedoch entscheidend zum Verständnis Tumorwachstum, Invasion, oder Metastasen Entwicklung und zelluläre Prozesse bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen und degenerative, Herz-Kreislauf- und immunologischen Erkrankungen. Herkömmliche bildgebende Verfahren basie.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Frau Sonja Dufentester, Frau Elke Weber und Frau Klaudia Niepagenkämper für die hervorragende technische Unterstützung.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ReagentsAlfalfa-freie
DiätHarlan Laboritories, Madison, USA2014
Bepanthen AugensalbeBayer, Leverkusen, Deutschland80469764
Dextransulfat-Natrium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SchwedenDB001
EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandE 4382
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)                                                 Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandE 9884
Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, DeutschlandB506
Hämatoxylin                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, DeutschlandHHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek Compound                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Niederlande4583Fixiermittel für histologische Analysen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBSLonza, Verviers, Belgien4629
Natriumchlorid 0,9%Braun, Melsungen, Deutschland12211095.05.0411
NatriumbicarbonatpulverSigma Aldrich Deisenhofen, DeutschlandS5761
StandarddiätAltromin, Lage, Deutschland1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Niederlande4566
Hämoccult (Guajakpapiertest)Beckmann Coulter, Deutschland3060
Biotin Ratten-Anti-Maus Anti-F4/80 AntikörperSerotec, Oxford, UKMCA497B
Biotin Ratten-Anti-Maus Anti-GR-1 BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland553125
Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, DeutschlandS-11225Anregungs-/Emissionsmaximum:  556/573nm
Anti-CD11b-Ratten-Anti-Maus-Antikörper TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
Gereinigter Anti-Maus-Antikörper F4/80BioLegend, London, UK123102
DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandD9542
FITC-konjugierter Anti-Ly6C-Ratten-Anti-Maus-AntikörperBD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland553104
FACS-PufferBD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland342003
Cy7 NHS EsterGE Healthcare  Europa, Freiburg, DeutschlandPA17104
MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, DeutschlandK 6631B
Cy5.5 markierter Anti-Maus F4/80 AntikörperBioLegend, London, UK123127gebrauchsfertig markierte Antikörper (alternativ)
Anti-Maus F4/80 Antigen PerCP-Cyanin5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80gebrauchsfertig markierte Antikörper (alternativ)
DMSO (Dimethylsulfoxid)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland67-68-5
IsofluranSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland792632
EthanolSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland64-17-5
Rinderserumalbumine (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandA4612
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandSRE0032
Name<>UnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung
FACS Calibur Durchflusszytometrie-SystemBD Biosciences GmbH, Heidelberg, Deutschland
FMT 2000 In Vivo Imaging SystemPerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
True Quant 3.1 Imaging Analysis SoftwarePerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAin FMT2000
  35578 Wetzlar, Deutschland DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, DeutschlandHD 2070Ultraschall-Homogenisator
Einweg-Skalpell Nr. 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandZ692395-10EA
Metzenbaum Schere 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Deutschland22398330
Luer-Lock-Spritze 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandZ248010
SpritzennadelnSigma-Aldrich, Deisenhoffen, DeutschlandZ192368 
Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgien352070
Leica DMLB Fluoreszenzmikroskop enthalten, Leica,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence mediated TomographyMacrophage DetectionIntestinal InflammationMurine Colitis ModelF4 80 AntibodyNon invasive Imaging3D ReconstructionAntibody TracerDisease Activity MonitoringIn Vivo Tracking

Related Articles