Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

Jakob Frimodt-Møller; Godefroid Charbon; Karen A. Krogfelt; Anders Løbner-Olesen

doi:10.3791/55946

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Methodenartikel

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

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DOI:

10.3791/55946

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11. September 2017

Jakob Frimodt-Møller¹ , Godefroid Charbon¹ , Karen A. Krogfelt² , Anders Løbner-Olesen¹

¹Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, ²Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.

Zusammenfassung

Die optimale chromosomalen Position(en) eines bestimmten DNA-Elements war/waren bestimmt durch Transposon-vermittelten zufällige Einblendung gefolgt von Fitness-Auswahl. In Bakterien kann die Auswirkungen der genetischen Kontext auf die Funktion eines genetischen Elements schwer abzuschätzen sein. Mehrere Mechanismen, einschließlich topologische Effekte, transkriptionelle Interferenz von benachbarten Gene und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung, können die Funktion eines bestimmten genetischen Elements beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt die zufällige Integration eines DNA-Elements in das Chromosom von Escherichia coli und wählen Sie die günstigsten Standorten mit einem einfachen Wachstum Wettbewerb zu experimentieren. Die Methode nutzt eine gut beschriebene Transposon-basiertes System der zufällige Insertion, gepaart mit einer Auswahl an der stärkeren Clone(s) von Wachstum nutzen, ein Verfahren, das auf experimentelle Bedürfnisse leicht einstellbar ist. Die Art der fitteste Clone(s) kann durch ganze Genomsequenzierung auf eine komplexe Multi-klonale Population oder einfach zu Fuß für die schnelle Identifizierung von ausgewählten Klonen gen bestimmt werden. Hier war die nicht-kodierenden DNA-Region DARS2, die die Initiation der Replikation der Chromosomen in E. Colikontrolliert, als Beispiel verwendet. Die Funktion des DARS2 ist bekannt durch Replikation-assoziierten Gen Dosierung beeinträchtigt werden; der engere DARS2 ruft nach der Herkunft der DNA-Replikation, desto aktiver wird es. DARS2 wurde nach dem Zufallsprinzip in das Chromosom ein DARS2eingefügt-Belastung gelöscht. Die daraus resultierende Klone mit einzelnen Einfügungen wurden gebündelt und für Hunderte von Generationen gegeneinander konkurrierten. Schließlich wurden die fittesten Klone gekennzeichnet und festgestellt, dass DARS2 eingefügt in unmittelbarer Nähe zu den Originalschauplätzen der DARS2 enthalten.

Einleitung

Durch seine Lage im Genom kann die Funktion eines genetischen Elements beeinträchtigt werden. In Bakterien ergibt sich somit vor allem vor Störungen durch die Transkription des benachbarten Gene, lokalen DNA Topologie und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung. Insbesondere die Prozesse der DNA-Replikation und Segregation gesteuert werden, mindestens im Teil, durch nicht-kodierenden chromosomalen Regionen¹und die ordnungsgemäße Funktion dieser Regionen hängt genomische Position/Kontext. In e. coli, Beispiele sind die Dif -Standort, erforderlich für Schwester Chromosom Auflösung²; KOPS-Sequenzen, er....