Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

Zusammenfassung

Hier war die Macht der ein Transposon-vermittelten zufällige einführen eines nicht-kodierende DNA-Elements verwendet, um seine optimale chromosomalen Position zu lösen.

Zusammenfassung

Die optimale chromosomalen Position(en) eines bestimmten DNA-Elements war/waren bestimmt durch Transposon-vermittelten zufällige Einblendung gefolgt von Fitness-Auswahl. In Bakterien kann die Auswirkungen der genetischen Kontext auf die Funktion eines genetischen Elements schwer abzuschätzen sein. Mehrere Mechanismen, einschließlich topologische Effekte, transkriptionelle Interferenz von benachbarten Gene und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung, können die Funktion eines bestimmten genetischen Elements beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt die zufällige Integration eines DNA-Elements in das Chromosom von Escherichia coli und wählen Sie die günstigsten Standorten mit einem einfachen Wachstum Wettbewerb zu experimentieren. Die Methode nutzt eine gut beschriebene Transposon-basiertes System der zufällige Insertion, gepaart mit einer Auswahl an der stärkeren Clone(s) von Wachstum nutzen, ein Verfahren, das auf experimentelle Bedürfnisse leicht einstellbar ist. Die Art der fitteste Clone(s) kann durch ganze Genomsequenzierung auf eine komplexe Multi-klonale Population oder einfach zu Fuß für die schnelle Identifizierung von ausgewählten Klonen gen bestimmt werden. Hier war die nicht-kodierenden DNA-Region DARS2, die die Initiation der Replikation der Chromosomen in E. Colikontrolliert, als Beispiel verwendet. Die Funktion des DARS2 ist bekannt durch Replikation-assoziierten Gen Dosierung beeinträchtigt werden; der engere DARS2 ruft nach der Herkunft der DNA-Replikation, desto aktiver wird es. DARS2 wurde nach dem Zufallsprinzip in das Chromosom ein DARS2eingefügt-Belastung gelöscht. Die daraus resultierende Klone mit einzelnen Einfügungen wurden gebündelt und für Hunderte von Generationen gegeneinander konkurrierten. Schließlich wurden die fittesten Klone gekennzeichnet und festgestellt, dass DARS2 eingefügt in unmittelbarer Nähe zu den Originalschauplätzen der DARS2 enthalten.

Einleitung

Durch seine Lage im Genom kann die Funktion eines genetischen Elements beeinträchtigt werden. In Bakterien ergibt sich somit vor allem vor Störungen durch die Transkription des benachbarten Gene, lokalen DNA Topologie und/oder Replikation-assoziierten Gen Dosierung. Insbesondere die Prozesse der DNA-Replikation und Segregation gesteuert werden, mindestens im Teil, durch nicht-kodierenden chromosomalen Regionen¹und die ordnungsgemäße Funktion dieser Regionen hängt genomische Position/Kontext. In e. coli, Beispiele sind die Dif -Standort, erforderlich für Schwester Chromosom Auflösung²; KOPS-Sequenzen, erforderlich für Chromosom Abtrennung³; Daten, DARS1und DARS2 Regionen, für die ordnungsgemäße chromosomale Replikation Steuerung (unten; ( ⁴). präsentieren wir Ihnen eine Methode, für die zufällige Umzug, Auswahl und Bestimmung der optimalen genetischen Kontext eines bestimmten genetischen Elements, hier veranschaulicht durch das Studium der DARS2 nicht-kodierende Region.

In E. Coli, DnaA ist der Initiator Protein verantwortlich für DNA-Strang Eröffnung um einzelne Replikation HerkunftoriC, und für die Einstellung von der Helikase DnaB^5,6,7. DnaA gehört zu den AAA⁺ (d. h. ATPasen verbunden mit vielfältigen Aktivitäten) Proteine und ATP und ADP zu binden mit ähnlich hohen Affinitäten⁵. Das Niveau der DnaA^ATP peaks bei Einleitung⁸, wo DnaA^ATP bildet ein Multimer auf oriC auslöst, die DNA duplex Öffnung⁹. Nach der Einleitung oriC erfolgt durch einen Mechanismus mit der Bindung des Proteins SeqA Hemimethylated vorübergehend nicht verfügbar für Wiederaufnahme wegen Sequestrierung oriC^10,11. Während der Sequestrierung, sinkt das Niveau der DnaA^ATP durch mindestens zwei Mechanismen: die regulatorischen Inaktivierung der DnaA (RIDA)^12,13 und Daten-abhängige DnaA^ATP Hydrolyse (Gefässwiderstand)^{14 ,15}. RIDA und Gefässwiderstand fördern die Umwandlung von DnaA^ATP zu^ADPDnaA. Vor einer neuen Runde der Initiation, DnaA^ADP wird wieder aktiviert, DnaA^ATP bei bestimmten DnaA-Reaktivierung Sequenzen (DARS): DARS1 und DARS2^16,17. Die chromosomalen Daten, DARS1und DARS2 Regionen sind nicht-kodierende und Handeln in einem Chaperon-Manier zu modulieren, DnaA^ATP/DnaA^ADP fußenden. Diese Regionen außerhalb der Ursprung der Replikation, ermöglichen der Montage von einem komplexen DnaA für entweder die Inaktivierung (Daten, ¹⁴) oder Aktivierung (DARS1 und DARS2; ¹⁷) der DnaA. DARS2 in einer Zelle löschen, ändert nicht Masse Verdoppelung Zeit aber Ergebnisse asynchroner Replikation Einleitung^15,16,18. Jedoch DARS2-mangelhafte Zellen haben eine Fitness Kosten im Vergleich zu einer ansonsten isogenen Wildtyp, während beide kontinuierliches Wachstum Wettbewerb im Reich Medium oder die Einrichtung der Besiedlung im Darm Maus¹⁸. Dies bedeutet, dass bereits geringe Veränderungen Asynchronie/Herkunft Konzentration wirkt sich negativ auf die bakterielle Fitness haben. In E. Coligibt es einen Selektionsdruck auf Chromosom Symmetrie (d. h. zwei fast gleich lang Replikation Arme)¹⁹pflegen. Daten, DARS1und DARS2 Regionen haben den gleichen relativen Abstand zu oriC in alle E. Coli Stämme¹⁸, trotz großen Schwankungen in der Größe von Chromosom sequenziert.

Hier verwenden wir die DARS2 Region von E. Coli als Beispiel für die Identifizierung von der chromosomalen Position(en) optimal für seine Funktion. DARS2 wurde in das Transposon NKBOR und die daraus resultierende NKBOR eingefügt::DARS2 Transposon anschließend nach dem Zufallsprinzip eingefügt in das Genom der MG1655 ΔDARS2. Wir erzeugt somit eine Ansammlung von Zellen, jede besitzen DARS2 platziert an einem anderen Ort auf dem Chromosom. Ein in-vitro- Wettbewerb Experiment, wo alle Zellen in der Auflistung wurden gebündelt und während des kontinuierlichen Wachstums in LB für eine geschätzte 700 Generationen gegeneinander angetreten, wurde durchgeführt. Das Ergebnis des Experiments Wettbewerb wurde überwacht/ermittelt mithilfe von südlicher Fleck, leicht gen zu Fuß und Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS; ( Abbildung 1). Endpunkt-Klone zu Fuss leicht gen gelöst waren gekennzeichnet durch Durchflusszytometrie, Zellzyklus Parameter zu bewerten. In einer durchflusszytometrischen Analyse können die Zellengröße, DNA-Gehalt und Einleitung Synchronität für eine große Anzahl von Zellen gemessen werden. Während der Durchflusszytometrie, ein Strom von Einzelzellen übergibt einen Lichtstrahl der entsprechenden Wellenlänge die gefärbte DNA begeistern die dann gleichzeitig durch Photomultiplier, die sammeln die emittierte Fluoreszenz, ein gewisses Maß an DNA-Gehalt, registriert ist sofern die Zellen sind für DNA gefärbt. Das vorwärts-verstreut Licht ist ein Maß für die Zelle Masse²⁰.

Die in-vitro- Wettbewerb Experiment, das wir hier vorstellen wird verwendet, um Fragen in Bezug auf die Bedeutung der chromosomalen Position und genomische Kontext des genetischen Elements. Die Methode ist neutral und einfach zu bedienen.

Protokoll

1. Sammlung der Bibliothek Transposon

Hinweis: die chromosomale Locus DARS2 wurde in die Mini Tn 10 geklont-basierte Transposon, NKBOR (auf pNKBOR) ²¹, was zu NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR erhalten Sie Online- ²². pNKBOR ist ein R6K-basierte Selbstmord-Vektor, der Initiator Protein π für Replikation ²³ erfordert. Plasmid pJFM1 ist daher in der Lage, in einer E. Coli-Stamm (z. B. Dh5α λ Pir) mit einer chromosomalen Kopie des Gens Pir zu replizieren. Jedoch wenn der Pir-defizienten Wildtyp MG1655 pJFM1 verwandelt, pJFM1 kann nicht replizieren, zur Auswahl von Kanamycin-resistente Klone erzeugt durch die zufällige Einfügungen von NKBOR:: DARS2 in das bakterielle Chromosom. Der Einfachheit halber werden diese als DARS2 Einfügungen bezeichnet. Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Methodik.

1. Bereiten Electrocompetent MG1655 Δ DARS2 von der aktiv wachsenden Zellen in Lysogeny Brühe (LB) bei 37 ° C ²⁴ gewachsen.
2. Electroporate pJFM1 in Electrocompetent MG1655 Δ DARS2, laut Gonzales Et Al. ²⁴
   1. add 1 µg der pJFM1 (in 1 µL Wasser) bis 40 µL Electrocompetent E. Coli MG1655 Δ DARS2 und übertragen Sie diese Mischung auf eine Küvette vorgekühlt, sterilen 0,2 cm Lücke. Legen Sie die Küvette in die Elektroporation Kammer. Electroporate mit 18 kV, 500 Ω und 25 µF; die Zeitkonstante sollte ~5.0 ms, und keine Lichtbögen auftreten sollten.
   2. Schnell die Bakteriensuspension wiederherstellen, indem Sie es in 1 mL vorgewärmten LB Brühe und Transfer zum 15 mL Reagenzglas resuspending.
   3. Lassen die Zellen durch Inkubation unter belüftete Wachstumsbedingungen bei 37 ° C für 30 min, ohne Antibiotika Auswahl wiederherstellen. Die Bakterien auf LB-Agar-Platten ergänzt mit 50µg/mL Kanamycin-Platte und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
3. Zählen die Kolonien aus der Elektroporation: eine Kolonie gilt gleich einem chromosomalen Transposon einfügen.
   Hinweis: Kolonien nach Augenmaß oder mit einer Kolonie Zähler gezählt werden können. Die Anzahl der Kolonien ist umgekehrt proportional zu den durchschnittlichen Abstand zwischen der Transposons befindet sich im Chromosom von jeder Klon.
4. Add 1 mL LB Brühe zu jeder Platte und alle Kolonien abwaschen; 1 mL LB Brühe sollte ausreichen, um ~ 100.000 Kolonien abwaschen. Die Wiederverwendung der gleichen 1 mL LB Brühe, die bakterielle Konzentration zu erhöhen. Bündeln Sie alle Kolonien in der gleichen 50 mL Tube.
5. Wirbel der Röhre und frieren die Start-Material (t = 0). Um es zu fixieren, verrühren Sie 1 mL Zellsuspension mit 1 mL 50 % Glycerin auf Eis. Übertragen Sie die Rohre um Trockeneis für 10 min. Einmal die Kulturen gefroren sind, übertragen Sie sie auf einem-80 ° C Gefrierschrank.
   Hinweis: Eine Zellkonzentration von mindestens 50.000 KBE/mL wird bei diesem Schritt erwartet.

2. Wettbewerb-Experiment in LB

1. Tauwetter Transposon-Bibliothek von-80 ° C auf dem Eis. Mix von pipettieren.
2. Transfer 100 µL der Transposon-Bibliothek zu 10 mL LB im Reagenzglas 15 mL.
3. Wachsen die Zellen, belüftet durch kontinuierliche schütteln (250 u/min), für 8 h bei 37 ° C, stationäre Phase (d. h. OD ₆₀₀ = ~ 4.0). Diese Parameter zu verschiedenen Wachstumsbedingungen wie gewünscht anpassen.
4. Propagieren der Bakterienpopulation durch kontinuierlichen Transfers in frisch vorgewärmte Medium jeder ~ 10 Generationen. Zu diesem Zweck auf 10 mL frisches LB 10 µL der vorherigen stationären Phase Kultur übertragen und wachsen für eine weitere 8 h an der stationären Phase (d. h. OD ₆₀₀ = ~ 4.0).
   Hinweis: Da die Start- und Endzeiten optische Dichte sind die gleichen, 1,000-fold Verdünnung entspricht ~ 10 Generationen von Wachstum (2 ¹⁰ = 1.024). Der Bakterienpopulation kann entweder direkt in frisch vorgewärmte Medium weitergegeben oder gespeichert bei 0-4 ° C (auf Eis) und am Folgetag propagiert. LB wurde hier verwendet, um möglichst viele zelluläre Verdoppelungen in kurzer Zeit wie möglich (Verdopplungszeit in der Nähe von 22 min.) zu gewährleisten.
5. Nach jeweils 100 Generationen des Wettbewerbs sparen fünf 1-mL-Proben bei-80 ° C (wie in Schritt 3.3 beschrieben).
6. Wenn die Fitness-Unterschiede zwischen den Zellen mit einzelnen Transposon Einfügungen klein sein sollen, halten Sie die Dauer des Wettbewerbs lange; hier 700 Generationen (t = 700) dienten.

3. Southern-Blot Analyse, Experiment über Wettkampfzeit zu überwachen

1. bereiten die Sonde für die südlichen Fleck (1-kb-Abschnitt von der NKBOR) durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation mit spezifischen Primer durchführen: NKBOR_Probe_FW : Gatgttggacgagtcggaat und NKBOR_Probe_RV: Cgttacatccctggcttgtt.
   1. Inkubation bei 98 ° C für 30 s für erste Denaturierung. Führen Sie dann 35 Zyklen bei 98 ° C für 10 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 45 s. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung, 72 ° C für 10 min.
      Hinweis: Die Vorlage für die PCR-Reaktion war ein gereinigtes pNKBOR Plasmid ²¹.
   2. Kennzeichnen die resultierende PCR-Fragment mit [α - 32P] dATP mit der zufälligen Primer-System nach Smith ²⁵.
2. Vorbereitung der gesamten zelluläre DNA nach Løbner-Olesen und von Freiesleben ²⁶ für t = 0 und ausgewählten Zeitpunkten bis t = 700 Generationen des Wettbewerbs geschätzt.
3. Verdauen die totale zelluläre DNA mit Pvu I, der schneidet die NKBOR mit der Region von Interesse einmal nur in einer Region nicht durch die Sonde abgedeckt; 1 Einheit der Pvu ich kann verwendet werden, um vollständig verdauen 1 µg Substrat DNA.
   Hinweis: Die Sonde erkennt Fragmente mit einem Teil das Transposon, zusammen mit chromosomaler DNA verschiedener Längen, je nach der Insertionsstelle.
4. Führen einen südlichen Fleck mit einer 0,7 % Agarosegel nach Løbner-Olesen und von Freiesleben ²⁶.

4. Identifikation der fitteste Klone

1. Gebrauch leicht gen gehen, wie von Harrison Et Al. beschrieben ²⁷, DARS2 Einfügung Websites aus einzelnen Klone (isoliert auf LB-Platten) nach 700 geschätzte Generationen des Wettbewerbs zu identifizieren; Weitere Bands auf der Southern-Blot, die weitere Isolate sind erforderlich, um alle Transposon Einfügungen decken.
   1. Isolierung genomischer DNA für PCR-Vorlage. Bakterien auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin verteilen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Wachsen einzelne Kolonien über Nacht in LB Brühe bei 37 ° C und anschließend übertragen 20 µL in 200 µL autoklaviert destilliertes Wasser (oder verwendet DNA Reinigung, wie in Schritt 3.2).
      1. Vortex mischen. Erhitzen Sie die Mischung bei 100 ° C für 10 min und Zentrifuge mit max. Geschwindigkeit für 5 min. die Zelle lysate bei-20 ° C für eine spätere Verwendung speichern.
   2. Design drei verschachtelte Primer zu Tempern in das Transposon Wahl (siehe Abbildung 2 für eine grafische Darstellung der PCR-Strategie).
      Hinweis: Nested Primer entwerfen sollten sicherstellen, dass verschachtelte Primer 3 am nächsten an die bekannten 5 liegt ' Ende das Transposon DNA, gefolgt von Nested Primer 2 und 1. Der Abstand zwischen den Nested Primer 3 und die 5 ' Ende des bekannten tRansposon DNA sollte ausreichend für eine Sequenz durchlesen von der bekannten DNA an die unbekannten DNA (um die spezifische chromosomale Transposon Einstichstelle zu finden). Für NKBOR wurden die folgenden verschachtelten Primer verwendet: pNKBOR_Nested3_RV: Gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: Tcagcaacaccttcttcacg, und pNKBOR_Nested1_RV: Actttctggctggatgatgg. Zufällige Zündkapseln, die mit der Anerkennung-Standorten der bekannten Restriktionsenzyme werden auch benutzt. Um ein Ergebnis zu erzielen, sollte man mindestens zwei verschiedene zufällige Primer verwenden. Die Restriktionsschnittstellen für die Restriktionsenzyme (e.g.,Sau 3AI und Hin dIII) sollte am 3 gefunden werden ' beenden und vorangegangen durch zehn zufällige Basen 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' und 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' sind die Primer mit einer Sau 3AI Website (GATC) und einer Hin-dIII-Website (AAGCTT), bzw., wo N = A, T, G oder c
   3. Einsatz 200 ng genomic DNA in einem 20-µL-PCR-Reaktion. Inkubation bei 98 ° C für 30 s für die ursprünglichen Denaturierung. Führen Sie 25 Zyklen bei 98 ° C für 30 s, 50 ° C für 15 s und 72 ° C für 4 Minuten. Verwenden Sie für die letzte Erweiterung 72 ° C für 10 min. Einsatz Primer Paare bestehend aus Nested Primer 1 und eines zufälligen Primern.
   4. Grundierung Paare bestehend aus Nested Primer 2 und die gleichen zufällige Grundierung aus die zweite Verstärkung, mit 1 µL seine frühere Reaktion als Vorlage verwenden.
   5. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4 mit Primer-Paaren bestehend verschachtelt Primer 3 und der gleichen zufällige Primer.
   6. Führen die Produkte von der endgültigen PCR-Reaktion auf eine 1,5 % Agarosegel und Fleck mit Interkalation Bromid. Schneiden Sie eine Band im Bereich von 100-800 bp und isolieren die DNA mit Hilfe kommerzieller DNA-Gel extrahieren Kit nach Angaben des Herstellers ' s-Richtung. Die DNA in 15 µL Wasser Aufschwemmen.
      Hinweis: Vorsicht. Interkalation Bromid ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
   7. Sequenz die Band isoliert im vorherigen Schritt (Schritt 4.1.6) mit Nested Primer 3 als Sequenzierung Primer, mit Sanger-Sequenzierung bei einem kommerziellen Anbieter.
2. Durchführen WGS.
   1. Durchführen WGS auf die gesamte DNA extrahiert aus ausgewählt Proben während des Wettbewerbs-Experiment, wie beschrieben durch Frimodt-Møller Et Al ⁴.
3. Sequenzierung Analyse.
   1. Align gepaart-Ende liest bis 150 Ns, NKBOR, AF310136.1 1.904 zusammenhängenden … 2.204 mit Bowtie2 ²⁸ mit einem Intervall zwischen Saatgut Teilzeichenfolgen (S, 1, 1,15) und eine maximale Anzahl von mehrdeutige Zeichen (L, 0, 0,9).
   2. Wählen Sie die ausgerichteten liest und dann neu ausrichten, um beide MG1655 Ref | NC_000913.3 und NKBOR gb | AF310136 mit BlastN ²⁹
   3. weisen Umsetzung einsetzen Positionen an Knotenpunkten MG1655-NKBOR.

5. Flow Cytometry

1. Proben für Durchflusszytometrie.
   1. Balance jeder Kultur indem Sie in der exponentiellen Wachstumsphase seit mindestens zehn Generationen beibehalten. Die OD ₆₀₀ zu überprüfen und sicherzustellen, dass es nie mehr 0,3 als.
   2. Erfassen zwei Arten von Flow Proben.
      1. Für RIF-Rundlauf, 1 mL der Kultur auf eine 15 mL-Tube mit 30 µL der RIF-CEF (300 µg/mL Rifampicin und 36 µg/mL Cephalexin in 12,5 mM NaOH gelöst) übertragen. Lassen Sie es bei 37 ° C für mindestens 4 h schütteln.
         Hinweis: Rifampicin blockiert indirekt die Einleitung der Chromosom-Replikation beim laufenden Runden der Replikation weiterhin zur Kündigung zulassen. Cephalexin verhindert die Zellteilung, die Replikation Rundlauf (RIF-Rundlauf) und die Ansammlung von Zellen mit vollständig replizierten Chromosomen führt. Die Anzahl der vollständig replizierten Chromosomen ist gleich der Anzahl der Ursprung zum Zeitpunkt der Behandlung mit Rifampicin und Cephalexin ²⁰.
      2. Für die EXP-Probe, Transfer 1 mL der exponentiell wachsenden Kultur zu einer 1,5-mL-Tube auf Eis.
2. Die Zellen wie folgt zu beheben. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 5 min bei 4 ° c Aufschwemmen das Pellet in 100 µL eiskalte 10 mM Tris pH 7,5 und fügen Sie 1 mL eiskaltes 77 % Ethanol. Die Proben bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
3. Färben die Zellen wie folgt. Ernte 100-300 µL der fixen Zellen durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 15 min. entfernen den Überstand und das Pellet in 130 µL Aufschwemmen " DNA-Färbelösung " (90 µg/mL Mithramycin, 20 µg/mL Interkalation Bromid, 10 mM MgCl ₂ und 10 mM Tris, pH 7,5). Setzen Sie die Proben auf Eis und im Dunkeln; die Proben sind bereit für Flow-Zytometrie-Analyse nach 10 min
   Hinweis: Andere DNA Flecken als Interkalation Bromid und Mithramycin kann auch gebrauchte ^{30 , 31}.
4. Bestimmen den Ursprung pro Zelle, die relative Zelle Masse und relative DNA-Gehalt von Flow-Zytometrie Analyse.
   1. Perform Durchflusszytometrie, wie zuvor beschrieben ³². RIF-Rundlauf und EXP-Proben mit dem Flow Cytometer Hersteller laufen ' Anweisungen des . Verwenden Sie für Mithramycin und Interkalation Bromid-gefärbten Zellen, Erregung Wellenlängen 395 und 440 nm und sammeln die Fluoreszenz über 565 nm.
      1. Die relative Zelle Masse und relative DNA-Gehalt bestimmen die EXP-Proben, Single-Parameter nach vorne-Licht Streuung im Vergleich zu Zelle Nummer Histogramme und Fluoreszenzintensität im Vergleich zu Zelle Nummer Histogramme für mindestens 30.000 Veranstaltungen zu erhalten ausführen entspricht das Mobilfunksignal.
      2. Einsatz vorwärts verstreut einzelne Parameter Lichtverteilung messen die durchschnittliche Relative Zell-Messe
         Hinweis: Nach vorne verteilt Licht ist ein Maß für die durchschnittliche Zelle Masse ²⁰.
      3. Verwendung Fluoreszenz Intensitätsverteilungen Single-Parameter zur Messung der durchschnittlichen DNS Inhalt ²⁰.
      4. Erhalten die DNA-Konzentration als das Verhältnis der durchschnittlichen DNA-Gehalt auf die durchschnittliche Zelle Masse ²⁰.
   2. Bestimmen Sie die Anzahl der Ursprünge pro Zelle.
      1. Run RIF-Rundlauf Proben zu Single-Parameter Fluoreszenzintensität versus Zelle Nummer Histogramme für mindestens 30.000 Veranstaltungen entspricht das Mobilfunksignal.
      2. Verwendung Fluoreszenz Intensitätsverteilungen Single-Parameter zu bestimmen, die Zahl der Chromosomen in jeder Zelle ²⁰.
5. Asynchronie-Index (Ai) zu berechnen.
   1. Berechnen die Ai, wie durch Løbner-Olesen Et Al. beschrieben ³², mit Hilfe der Fluoreszenz einzelner Parameter Intensitätsverteilungen der RIF-Rundlauf Proben und die Formel Ki = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), wo fx ist der Bruchteil Zellen mit x Anzahl der vollständig replizierten Chromosomen. Einweihungen als asynchrone betrachten A > 0.1.

Ergebnisse

Ein südlicher Fleck wurde getan, um sicherzustellen, dass DARS2 das Chromosom in der Transposon-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip verteilt wurde (t = 0) und, die die stärksten Klonen würde im Laufe der Zeit beibehalten. Der Southern Blot erfolgte auf DNA extrahiert aus dem anfänglichen Transposon-Pool (bei t = 0) und alle geschätzten 100 aus 700 Generationen des Wettbewerbs (Abbildung 3). Hier war die totale zelluläre DNA aus jeden Zeitpunkt verdaut...

Diskussion

Die hier verwendete Methodik nutzt State-of-the-Art Techniken, eine schwierige Frage in Bezug auf die optimale genomische Position eines genetischen Elements zu beantworten. Die zufällige Aufnahme des genetischen Elements (vermittelt durch das Transposon) ermöglicht die schnelle und einfache Sammlung von Tausenden von Klone, die dann vorgenommen werden kann, wählen für die optimale Position des untersuchten genetischen Elements gegeneinander antreten (d.h. der fitteste Klon).

Hier wur...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Autoklavierte Mili-Q Wasser		Keine
Elektroporationsküvetten, 0,1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulser Elektroporationssystem	Bio-Rad	165-2100
LB Bouillon	Thermo Fisher Scientific	12780029
LB Agar, Pulver (Lennox L Agar)	Thermo Fisher Scientific	22700025
Glycerin	Thermo Fisher Scientific	17904
Fisherbrand  Petrischalen aus Kunststoff	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50mL Konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc  Kryoröhren	Sigma-Aldrich	V7634
Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase (2 U/&mikro; L)	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 & Mikro; Ci	PerkinElmer	DNA-Markierungskit
	Thermo Fisher Scientific	AM1455
Spektralphotometer  SF/MBV/03.32	Pharmacia
Hermle Zentrifuge      SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich Zentrifuge  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorftubes 1,5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorftubes 2,0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
Natriumchlorid	Merck	6404
96% Ethanol	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
Phenol Ultra Pure	BRL	5509UA
Chloroform	Merck	2445
Ribonuklease A Typ II A	Sigma-Aldrich	R5000
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Merck	13760
Lysozym	Sigma-Aldrich	L 6876
Isopropanol	Sigma-Aldrich	405-7
0,5M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
Kanamycinsulfat	Sigma-Aldrich	10106801001
PvuI (10 U/µ L)	Thermo Fisher Scientific	ER0621
Ultrareine Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500
(6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tris-Borat-EDTA-Puffer	Sigma-Aldrich	T4415
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E7637
Salzsäure	Sigma-Aldrich	433160
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	71687
Whatman  3MM	Papiere Sigma-Aldrich	WHA3030931
SSC Buffer 20x mal; Konzentrat	Sigma-Aldrich	S6639
Amersham Hybond-N+	GE Healthcare	RPN119B
Ficoll  400	Sigma-Aldrich	F8016
Polyvinylpyrrolidon	Sigma-Aldrich	PVP40
Rinderserumalbumin - Fraktion V	Sigma-Aldrich	85040C
Desoxyribonukleinsäure-Natriumsalz aus Lachshoden	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak   BioMax   Lichtfilm	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute   Gel-Extraktionskit	Sigma-Aldrich	NA1111
GenElute   PCR-Aufreinigungskit	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  Thermocycler	Bio-Rad
SmartSpec Plus Spektralphotometer	Bio-Rad
Rifampicin	Serva	34514.01
Cephalexin	Sigma-Aldrich	C4895
Mithramycin	Serva	29803.02
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	246964
Apogee A10 Instrument	Apogee