Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Summary

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Abstract

Dendritische Zellen (DCs) sind leistungsfähige Verarbeitung und verinnerlichten exogene Antigene auf großen Histocompatibility-Klasse (MHC) zu präsentieren ich Moleküle auch bekannt als Kreuz-Präsentation (CP). CP spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Stimulation der naiven CD8⁺ T Zellen und Gedächtnis CD8⁺ T-Zellen für infektiöse und Tumor Immunität sondern auch bei der Inaktivierung von selbsttätige naive T-Zellen durch T-Zell-Anergie oder T-Zell-Löschung. Wenn auch der kritischen molekularen Mechanismus der CP geklärt werden noch, gibt es sammeln Hinweise darauf, dass exogene Antigene durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau (ERAD) nach dem Export aus nichtklassischen endocytic verarbeitet werden Fächer. Bis vor kurzem waren Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen beschränkt, denn es keine spezifische molekulare Marker als exogene Antigene gab. Die hier beschriebene Methode ist ein neues Protokoll Vesikel Isolierung, die für die Reinigung dieser endocytic Abteilungen ermöglicht. Mit diesem gereinigten Microsome, rekonstituiert wir ERAD-wie Transport, Ubiquitination und Verarbeitung des exogene Antigen in Vitro, was darauf hindeutet, dass das Ubiquitin-Proteasom-System die exogene Antigen nach dem Export aus dieser verarbeitet Handy-Fach. Dieses Protokoll kann weiter auf andere Zelltypen zu klären, den molekularen Mechanismus der CP angewendet werden.

Introduction

Die MHC ich Moleküle auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen, mit kurzen Antigene Peptide abgeleitet endogene Antigene, die durch das Ubiquitin-Proteasom-System in der Zellflüssigkeit¹verarbeitet werden ausgedrückt werden. Nach der Bearbeitung werden Antigene Peptide in das endoplasmatische Retikulum (ER)-Lumen von Peptid-Transporter TAP transportiert. Das ER-Lumen eine Reihe von spezifischen Chaperone unterstützen das Peptid-laden und die korrekte Faltung des MHC ich komplexe. Diese Reihe von Molekülen nennt man die Peptid-laden-Komplex (PLC), darauf hinweist, dass ER ein zentrales Fach für Peptid laden auf MHC ich²

Protocol

1. wachsenden Zellen und Ergänzung der exogene Antigene

1. Prepare bOVA mit einem Biotin-Protein-Kennzeichnung kit nach dem Hersteller ' s Protokoll.
   Hinweis: Normalerweise bOVA enthält 2 M Biotin pro 1 M OVA durchschnittlich.
2. Wachsen DC2.4 Zellen RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 55 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) und 10 % fetalen Kälberserum (im folgenden RPMI) bei 37 ° C in 5 % CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator (im folgenden ohne Erwähnung, Zellen sind inkubiert in diesem Zustand). Es ist auch möglich, verwenden Si....

Results

Um den molekularen Mechanismus der CP zu erhellen, ist es notwendig, die zellulare Fächer zu identifizieren, wo exogene Antigene ERAD-wie Transport und Verarbeitung unterzogen werden. Während Beobachtungen durch immunofluorescent Mikroskopie oder durch Elektronenmikroskopie der zelluläre Fach wo exogene Antigene^{16,17,18,19angesammelt.......}

Discussion

In früheren Studien von CP eingearbeitete exogene Antigene in den geschützten Bereich des späten Endosom oder ER durch immunofluorescent Mikroskopie^16,30,31,32angesammelt. Es wird geschätzt, dass ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen in diesen spezialisierten Bereichen ER oder späten Endosom durchgeführt werden, wie das zelluläre Fach von Saccharose oder Iodixanol Dichte Gr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco von life technologies	11875-093
fötales Rinderserum	Equitech bio	SFB30
Natriumpyruvat	gibco von life technologies	11360-070
MEM nicht-essentielle Aminosäuren	gibco von life technologies	11140-050
HEPES	gibco von life technologies	15630-080
2-Mercaptoethanol	Gibco von life technologies	21985-023
L-Glutamin	gibco von life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco von life technologies	15140-122
DMEM	gibco von life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-Protein Etikettierkit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnologie	201270
Lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce Homogenisator	IUCHI	131703
Proteasehemmer Cocktails	SIGMA	P8340
Iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetische Kügelchen	New England Biolabs	201270
Kontrolle magnetische Kügelchen	Chemagen	M-PVA012
magnetisches Gestell	BD Biosciences	552311
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Silberfärbekits	Cosmo bio	423413
Retikulozyten Lysat	Promega
Flaggenmarkiertes Ubiquitin	SIGMA	U5382
Anti-Ovalbumin (OVA,Maus)	Antikörper Shop	HYB 094-06
Ant-Multi-Ubiquitin (Maus)	MBL	D058−
Anti-Flag (Maus)	SIGMA	F3165
Trypsin	SIGMA	85450C