Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Summary

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Abstract

Dendritische Zellen (DCs) sind leistungsfähige Verarbeitung und verinnerlichten exogene Antigene auf großen Histocompatibility-Klasse (MHC) zu präsentieren ich Moleküle auch bekannt als Kreuz-Präsentation (CP). CP spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Stimulation der naiven CD8⁺ T Zellen und Gedächtnis CD8⁺ T-Zellen für infektiöse und Tumor Immunität sondern auch bei der Inaktivierung von selbsttätige naive T-Zellen durch T-Zell-Anergie oder T-Zell-Löschung. Wenn auch der kritischen molekularen Mechanismus der CP geklärt werden noch, gibt es sammeln Hinweise darauf, dass exogene Antigene durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau (ERAD) nach dem Export aus nichtklassischen endocytic verarbeitet werden Fächer. Bis vor kurzem waren Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen beschränkt, denn es keine spezifische molekulare Marker als exogene Antigene gab. Die hier beschriebene Methode ist ein neues Protokoll Vesikel Isolierung, die für die Reinigung dieser endocytic Abteilungen ermöglicht. Mit diesem gereinigten Microsome, rekonstituiert wir ERAD-wie Transport, Ubiquitination und Verarbeitung des exogene Antigen in Vitro, was darauf hindeutet, dass das Ubiquitin-Proteasom-System die exogene Antigen nach dem Export aus dieser verarbeitet Handy-Fach. Dieses Protokoll kann weiter auf andere Zelltypen zu klären, den molekularen Mechanismus der CP angewendet werden.

Introduction

Die MHC ich Moleküle auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen, mit kurzen Antigene Peptide abgeleitet endogene Antigene, die durch das Ubiquitin-Proteasom-System in der Zellflüssigkeit¹verarbeitet werden ausgedrückt werden. Nach der Bearbeitung werden Antigene Peptide in das endoplasmatische Retikulum (ER)-Lumen von Peptid-Transporter TAP transportiert. Das ER-Lumen eine Reihe von spezifischen Chaperone unterstützen das Peptid-laden und die korrekte Faltung des MHC ich komplexe. Diese Reihe von Molekülen nennt man die Peptid-laden-Komplex (PLC), darauf hinweist, dass ER ein zentrales Fach für Peptid laden auf MHC ich². Nach Peptid laden, MHC ich Moleküle an der Zelloberfläche transportiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der adaptiven Immunsystems als selbständige Marker und ermöglicht die CD8⁺ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), Krebszellen oder Krankheitserreger erkennen von Antigenen Peptide aus Nichtselbst Proteine³.

Antigenpräsentierende Zellen (APC), Antigene Peptide aus exogene Antigene sind auch auf MHC habe ich^4,5,6,7,8 über CP, das hauptsächlich getragen wird vorgestellt von DCs^9,10,11. CP ist wichtig sowohl für die Aktivierung von naiven CD8⁺ T Zellen und Gedächtnis CD8⁺ T-Zellen gegen Infektionen und Anti-Tumor CTLs^12,13, und bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz durch die Inaktivierung der selbsttätige naive T-Zellen^14,15. Der CP spielt viele wichtige Rollen in das adaptive Immunsystem jedoch die molekularen Mechanismen der CP müssen noch im Detail beschrieben werden. Frühere Studien der CP ergab, dass exogene Antigene, in der ER und das Endosom lokalisiert wurden und wurden von ERAD, was darauf hindeutet, dass exogene Antigene, die ER für ERAD-wie Verarbeitung und laden^{16 Peptid aus dem Endosom transportiert werden verarbeitet} . Sammeln Beweise deutet jedoch darauf hin, dass das Peptid-Laden von CP durchgeführt wird, nicht in der Notaufnahme sondern im nicht-klassischen endocytic Fächer, die auch Besonderheiten der ER (Abbildung 1)^{17,18 ,19,20,21}. Zur Vermeidung von Abbau der Antigen Peptid Vorläufer von der hohen Aktivität des Aminopeptidase tritt²² im Zytosol, Verarbeitung und Peptid im CP laden im proximalen Bereich dieser nichtklassischen endocytic Abteilungen (Abbildung 1). Obwohl die Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen umstritten sind, gibt es keine bestehende spezifische Moleküle als exogene Antigene in diesem Fach.

ERAD ist ein zellulärer Weg, der speziell fehlgefaltete Proteine aus dem ER entfernt. In dem ERAD Weg fehlgefaltete Proteine Doppelthebel durch die ER-Membran, das Zytoplasma transportiert und verarbeitet von den Ubiquitin-Proteasom System^23,24,25. Beim Transport von großer Molekülen wie Proteinen, durch die Lipid-Bilayer durchlaufen diese Moleküle ein molekularer Apparat namens ein Translocon, wie der Sec61 komplex und Delrin Komplex in die ER²⁶, und die komplexe Tom und Tim Komplex in der Mitochondrien-²⁷. Wenn exogen hinzugefügt Antigene durch die ER-Membran transportiert werden, müssen sie die Lipid-Bilayer im Komplex mit Translocons, wie den Sec61-Komplex eindringen. Die hier beschriebene Methode gereinigt die gezielte Blase durch die Nutzung dieser Membran durchdringen Moleküle als Marker für die endocytic Fächer.

Die hier beschriebene Methode ist ein neues Vesikel-Reinigung-Protokoll mit der DC-ähnliche Zelle Zeile DC2.4²⁸ und biotinylierte Ovalbumin (bOVA) als eine exogene Antigen. Die endocytic Fächer wurden gereinigt, indem Streptavidin (SA)-magnetische Beads, die mit der Membran durchdringen bOVA als Hersteller. In diesem gereinigten Microsome hinzugefügt einige exogen bOVA blieb noch in Bruchteilen Membran aber waren an der Außenseite des Microsome und dann Ubiquitinated transportiert und verarbeitet in-vitro-²⁹. Dieses gereinigte Microsome enthielt nicht nur endocytic Fach-spezifische Proteine, sondern auch ER ansässigen Proteine für ERAD und das Peptid Komplex laden; darauf hindeutet, dass das zelluläre Fach das prospektive endocytic Fach für CP²⁹. Dieses Protokoll ist nicht abhängig von der Art der exogene Antigene und gilt auch für andere DC-Subsets und andere Zelltypen, z. B. Endothelzellen, Makrophagen und B-Zellen, den genaue molekularen Mechanismus der DCs für kompetente CP zu klären.

Protocol

1. wachsenden Zellen und Ergänzung der exogene Antigene

1. Prepare bOVA mit einem Biotin-Protein-Kennzeichnung kit nach dem Hersteller ' s Protokoll.
   Hinweis: Normalerweise bOVA enthält 2 M Biotin pro 1 M OVA durchschnittlich.
2. Wachsen DC2.4 Zellen RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 55 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) und 10 % fetalen Kälberserum (im folgenden RPMI) bei 37 ° C in 5 % CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator (im folgenden ohne Erwähnung, Zellen sind inkubiert in diesem Zustand). Es ist auch möglich, verwenden Sie DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum, 3,7 g/L Nahco3 ₃ (im folgenden DMEM) anstelle von RPMI ergänzt.
3. Einen Tag vor der Reinigung, die Zellen in RPMI bis 1 x 10 ⁵ Zellen/mL in einer Gewebekultur Platte aufgeteilt. Vermeiden Sie die Zellen an einem konfluierende Zustand zu halten. DC2.4 Zellen können exogene Antigene hoch bis semi-konfluierende Zustand zu übernehmen, aber schnell verlieren die Fähigkeit nach einer übermäßigen Zusammenfluss Zustand zu erreichen.
4. Vor der DC2.4 Zellen sind semi-konfluierende, fügen Sie 250 µg/mL bOVA für 1 x 10 ⁶ Zellen/mL und inkubieren Sie für 2-4 h
   Hinweis: Während der nachfolgenden Experimente alle Puffer und Reagenzien sind gehalten bei 4 ° C sofern nicht anders angegeben.

2. Vorbereitung der Microsomen

1. die DC2.4 Zellen durch sanfte Pipettieren von der Gewebe-Platte in ein neues 50 mL konische Röhrchen ernten.
2. Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C und entfernen Sie vorsichtig das Medium mit bOVA durch Aspiration.
3. Die DC2.4 Zellen zweimal mit 40 mL PBS-Puffer (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH ₂ PO ₄) durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands jedesmal durch Absaugen.
4. Aufschwemmen das Pellet in Schritt 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 Volumen Kulturmedium) Homogenisierung Medium (0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails und Übertragung der resuspendierte DC2.4 Zellen in einer eiskalte Dounce-Homogenisator.
5. Stören die resuspendierte DC2.4 Zellen sanft von 10-20 Schläge mit dem eiskalten Dounce-Homogenisator.
   Hinweis: Während der Unterbrechung Schritt Dounce-Homogenisator wird gekühlt auf Eis
6. Übertragen die Zelle gestört Aussetzung zu einem neuen 15 mL konische Schlauch.
7. 10 mL insgesamt 8-9 mL Homogenisierung Medium hinzu und Zentrifugieren die konische Röhre für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c
8. Übertragen den Überstand auf eine neue 15 mL konische Rohr, ungebrochene Zellen und Kerne entfernen und Zentrifugieren die konische Röhre wieder für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c
9. Übertragen den Überstand in ein neues Ultrazentrifugation Rohr und Zentrifuge für 45 Minuten bei 100.000 x g und 4 ° c
10. Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Pellet sorgfältig in 1-2 mL Homogenisierung Medium mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals in Sekundenbruchteilen Microsome für nachgeschaltete Experimente machen.
11. Übertragen die Microsome Bruchteil in ein neues Röhrchen 5 mL Rundboden.
    Hinweis: Nach diesem Schritt ist es möglich, Objektive Microsomen durch Iodixanol Dichte Gradienten Zentrifugation laut Hersteller bereichern ' s-Protokoll, um unspezifische Microsomen zu entfernen. Die Peak-Fraktionen für exogene Antigene werden gesammelt und dann mit dem nächsten Schritt der Reinigung (Schritt 3) unterworfen.

3. Reinigung von Microsomen mit bOVA unterziehen ERAD

1. Add 1/100 Volumen von frischen SA-magnetischen Kügelchen auf den Microsome Bruchteil Schritt 2.11 in der 5 mL Runde Unterrohr.
   Hinweis: Bevor Sie diesen Schritt, es ist möglich, Microsome Bruchteil von Kontrolle-magnetische Beads zu Verunreinigungen der unspezifischen Microsomen vorab klar.
2. Sanft vermischen und drehen die Rundboden-Röhre langsam für 30 min bei 4 ° c
3. Insgesamt 4 mL in die Rundboden Röhrchen ca. 2-3 mL Homogenisierung Medium hinzufügen und vorsichtig vermengen.
4. Ein Magnetstativ Rundboden Rohr aufsetzen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Da die Perlen an die Vesikel gebunden der Magnet angezogen sind, braune Mikro-Perlen werden allmählich reichern sich an der Rohrwand am nächsten an den Magneten.
5. Mit dem Rohr in der Magnetstativ verbleibenden sorgfältig verwerfen die Überstände durch Absaugen, die ungebundenen Vesikel zu entfernen.
6. Waschen die magnetische Beads die Vesikel zweimal mit 5 mL Medium Homogenisierung durch die magnetische verpflichtet stehen für 10 min bei 4 ° C und entsorgen des Überstands jedesmal durch sorgfältig absaugen.
   Hinweis: Ohne Magnetstativ, Reinigung von Centrifugations bei 2.000 x g für 10 min, 4 ° C ist auch verfügbar.
7. Aufschwemmen der magnetischen Kügelchen durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals an die Vesikel sorgfältig in 100 µL Homogenisierung Medium gebunden.
8. Übertragen die resuspendierte Vesikel in eine neue Reaktionscup als die gereinigten Microsome für nachgeschaltete Experimente.
   Hinweis: In der Regel 50 µL Microsome Bruch mit 5-20 µg Proteinen aus 1 x 10 ⁷ Zellen isoliert werden kann.

4. Analyse der gereinigt Microsomen

1. Aufschwemmen der magnetischen Perlen verpflichtet die Vesikel aus Schritt 3,8 für 100-200 µL Puffer TNE (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 % Nonidet p-40) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails anstelle der Homogenisierung Medium.
2. Übertragen die lysate aus Schritt 4.1 auf eine neue 1,5-mL-Reaktionscup.
3. Bestimmen die Proteinkonzentration Schritt 4.2 mithilfe einer BCA Assay Kit pro Hersteller ' s Protokoll.
   Hinweis: In der Regel 5-10 µL lysate aus Schritt 4.2 genügt, um festzustellen, die Proteinkonzentration.
4. Übertragen die lysate aus Schritt 4.2 (2 µg Protein für silberne Färbung und 10 µg Protein für das westliche Beflecken) in neue Mikroröhrchen.
5. Setzen die Mikroröhrchen auf einem Heizblock bei 95 ° C und Kochen Proteine in 1 x SDS-Gel-laden-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM Dithiothreitol, 4 % SDS, 0,2 % Bromophenol Blue, 20 % Glycerin) für 5 min.
6. Zentrifugieren Mikroröhrchen für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in neue Mikroröhrchen die unlöslichen Anteile entfernen.
7. Die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (2 µg) von standard SD-Seite zu analysieren.
8. Visualisieren die Protein-Bands durch die silberne Färbung mit silbernen Färbung nach dem Hersteller Kit ' s Protokoll.
9. Analysieren die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (10 µg) von standard SD-PAGE und Western-Blot. Verwenden Sie das Reagenz (SA-HRP) pro Hersteller ' s-Protokoll und visualisieren von Fluorography.

5. In-vitro- Rekonstitution des ERAD Ubiquitination von bOVA Verwendung gereinigt Microsomen

1. Übertragung der gereinigten Microsomen (5-10 µg Protein) von 3,8 Schritt mit einem Volumen von 50 % der Retikulozytenzahl lysate (RL), 1 x Reaktion Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl (₂), und 12:02-Flag gekennzeichnet Ubiquitin in eine neue Reaktionscup. Der letzte Band dieses Experiments ist 20-40 µL.
2. Inkubation die Reaktionscup für 2 h bei 37 ° c
   Hinweis: Wenn die Menge an Ubiquitinated bOVA in Schritt 5.12 zu klein, durch westliche Beflecken zu erkennen ist, fügen Sie 10 µM MG132 oder 2 µM Lactacystin, die Verarbeitung von Ubiquitinated bOVA durch Proteasomen hemmen.
3. Stoppen Sie die Reaktion indem man die Reaktionscup auf Eis.
4. Lösen die Microsomen durch Zugabe von 500 µL TNE Puffer mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails.
5. Die Reaktionscup Zentrifuge für 10 min bei 21,500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in eine neue Reaktionscup die unlöslichen Brüche zu entfernen, die Ubiquitinated bOVA in DC2.4 vor der in-vitro- Ubiquitination Assay enthalten.
6. Den Überstand auf eine neue Reaktionscup übertragen und Volumen 1/100 der neuen SA-magnetische Beads (in der Regel 5 µL für 500 µL Überstände).
7. Sanft vermischen und drehen die Reaktionscup langsam für 30 min bei 4 ° c
8. Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen der Überstand durch Absaugen, bOVA und Ubiquitinated bOVA wiederherzustellen mit der SA-magnetische Beads gebunden.
9. Waschen zweimal die gesammelten SA-magnetische Beads mit 1 mL TNE Puffer durch Zentrifugation für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen des Überstands jedesmal durch Aspiration.
10. Kochen der SA-magnetischen Kügelchen in 1 x SDS-Gel Ladepuffer für 5 min bei 95 ° C auf einem Hitze-Block, der gereinigten Proteine durch die SA-magnetische Beads zu lösen.
11. Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° c in eine neue Reaktionscup, die unlöslichen Anteile zu entfernen die Überstände sammeln.
12. Analysieren die SA-magnetische Beads durch standard SD-Seite und Western-Blot-an die Proteine gebunden. Der Einsatz von Antikörpern (Anti-Flag, Anti-Multi-Ub und Anti-Maus IgG-HRP) und das Reagenz (SA-HRP) ist pro Hersteller ' s-Protokoll und visualisiert durch Fluorography.

Results

Um den molekularen Mechanismus der CP zu erhellen, ist es notwendig, die zellulare Fächer zu identifizieren, wo exogene Antigene ERAD-wie Transport und Verarbeitung unterzogen werden. Während Beobachtungen durch immunofluorescent Mikroskopie oder durch Elektronenmikroskopie der zelluläre Fach wo exogene Antigene^{16,17,18,19angesammelt...}

Discussion

In früheren Studien von CP eingearbeitete exogene Antigene in den geschützten Bereich des späten Endosom oder ER durch immunofluorescent Mikroskopie^16,30,31,32angesammelt. Es wird geschätzt, dass ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen in diesen spezialisierten Bereichen ER oder späten Endosom durchgeführt werden, wie das zelluläre Fach von Saccharose oder Iodixanol Dichte Gr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco von life technologies	11875-093
fötales Rinderserum	Equitech bio	SFB30
Natriumpyruvat	gibco von life technologies	11360-070
MEM nicht-essentielle Aminosäuren	gibco von life technologies	11140-050
HEPES	gibco von life technologies	15630-080
2-Mercaptoethanol	Gibco von life technologies	21985-023
L-Glutamin	gibco von life technologies	25030-164
Penisicillin-Sreptomycin	gibco von life technologies	15140-122
DMEM	gibco von life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotin-Protein Etikettierkit	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnologie	201270
Lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce Homogenisator	IUCHI	131703
Proteasehemmer Cocktails	SIGMA	P8340
Iodixanol	Cosmo bio	1114542
SA-magnetische Kügelchen	New England Biolabs	201270
Kontrolle magnetische Kügelchen	Chemagen	M-PVA012
magnetisches Gestell	BD Biosciences	552311
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Silberfärbekits	Cosmo bio	423413
Retikulozyten Lysat	Promega
Flaggenmarkiertes Ubiquitin	SIGMA	U5382
Anti-Ovalbumin (OVA,Maus)	Antikörper Shop	HYB 094-06
Ant-Multi-Ubiquitin (Maus)	MBL	D058−
Anti-Flag (Maus)	SIGMA	F3165
Trypsin	SIGMA	85450C