Eine rechnerische Methode, Fly Circadian Activity zu quantifizieren

Summary

Eine Methode zur Quantifizierung der zeitlichen Hauptmerkmale in Fliege Circadiane Rhythmen Bewegungsapparates gesehen wird vorgestellt. Die Quantifizierung erfolgt durch passende Fliege Aktivität mit einer Multi-parametrisches Modell Wellenform. Die Modellparameter beschreiben die Form und Größe der am Morgen und Abend Gipfeln der Tagesaktivität.

Abstract

In den meisten Tieren und Pflanzen zirkadiane Uhren Verhaltens- und molekulare Prozesse zu orchestrieren und diese mit der täglichen hell-dunkel-Zyklus synchronisieren. Grundlegende Mechanismen, die diese zeitliche Steuerung zugrunde liegen sind umfassend untersucht, mit der Taufliege Drosophila Melanogaster als Modellorganismus. In fliegen wird die Uhr in der Regel durch die Analyse von mehrtägigen Bewegungsorgane Aufnahme untersucht. Diese Aufnahme zeigt ein komplexes bimodales Muster mit zwei Gipfeln der Tätigkeit: eine Morgen-Gipfel, der geschieht, um Beginn und ein Abend-Gipfel, der um Dämmerung passiert. Diese zwei Gipfel bilden zusammen eine Wellenform, die sehr verschieden von sinusförmigen Schwingungen in Uhrengene, was darauf hindeutet, dass Mechanismen neben der Uhr tiefgreifende Auswirkungen haben bei der Herstellung die beobachteten Muster in Verhaltensdaten beobachtet. Hier bieten wir Ihnen Hinweise auf mit einer neu entwickelten rechnerische Methode, die zeitliche Muster fliegen Aktivität mathematisch beschreibt. Die Methode passt Aktivitätsdaten mit einer Modell-Wellenform, die besteht aus vier exponentielle Begriffen und neun unabhängige Parameter, die der Form und Größe der am Morgen und Abend Gipfeln der Aktivität vollständig zu beschreiben. Die extrahierten Parameter können helfen, die kinetischen Mechanismen der Substrate erläutern, die die häufigsten beobachteten bimodale Aktivitätsmuster in Fliege Bewegungsorgane Rhythmen zugrunde liegen.

Introduction

Der circadiane Uhr ist eine endogene biochemische Oszillator mit einer Periode von etwa 24 Stunden und ist fast allgegenwärtig bei Tieren und Pflanzen^1,2. Die Uhr hilft eines Organismus interne Prozesse und Verhalten an externe dunkle Lichtzyklus synchronisieren. Die genetische Struktur der circadianen Uhr hat seit den 1960er Jahren umfassend untersucht worden mit der Fruchtfliege, D. Melanogaster. In dieses Insekt, das Herzstück der circadianen Uhr besteht aus vier Proteinen: Zeitraum, TIMELESS, Uhr und Zyklus. Diese Kernkomponenten zusammen mit anderen Molekülen bilden eine Feedback-Schleife, die nahezu sinusförmige Schwingungen der Uhr Gene^3,4produziert. Die circadiane Uhr fliegen ist weit studiert mit mehrtägigen Bewegungsorgane Aufnahmen wo fliegen Aktivität mit einem einzigen Infrarot-Strahl überqueren der Mitte von einer einzelnen Röhre⁵erkannt. Eine typische Fliege Aufnahme hat ein komplexes bimodales Muster mit zwei gut unterscheidbare Gipfel: Morgen Peak (M), der beginnt am Ende der Nacht und hat ein Maximum, wenn Lichter einschalten; und Abend Peak (E), die am Ende des Tages beginnt und hat ein Maximum, wenn⁶Lichter ausschalten. Interessanterweise ist die Form von solchen Verhaltens Aufnahme ganz anders als die einfache sinusförmigen Schwingungen, die auf molekularer Ebene, was auf die Tätigkeitsbereiche weitere Mechanismen, die einen Beitrag zu den beobachteten zeitlichen Muster beobachtet. Um diese versteckten Mechanismen besser zu verstehen, haben wir eine rechnerische Instrument entwickelt, die eine quantitative Beschreibung der zeitlichen Muster enthält.

In unserer Arbeit gelten Bewegungsorgane Rhythmen in Bezug auf eine Wellenform, die Fliege Aktivitätsmuster imitiert. Da einfache Sinuswellen verwendet werden kann, um die beobachteten rhythmische Veränderungen in Aktivität zu modellieren, testeten wir verschiedene Signalformen, die einfachste auszuwählen, die fängt die hervorstechenden Eigenschaften, die bei den Aufnahmen zu sehen. Fruchtfliege circadiane Verhalten wird durch die Aktivität der Neuronen Uhr gesteuert, die oft exponentielle Muster von Aktivierung und Deaktivierung⁷haben. Die exponentielle Dynamik und visuelle Analyse der Daten hat uns motiviert, ein Modell mit exponentiellen begriffen, bestehend aus vier Exponenten mit neun unabhängigen Parameter und stark ähnelten die Fliege Tätigkeit Muster⁸zu bauen. Zusätzlich zu den lokomotorischen Daten analysieren wir auch ihre Leistungsspektrum. Typische fliegen Wirkungsspektrum zeigt mehrere Peaks bei Oberschwingungen T₀2 T₀3, etc., zusätzlich zu der erwarteten grundlegenden Peak bei der zirkadianen Periode T₀. Nach dem Fourier-Theorem erzeugt nur eine reine Sinuswelle einen einzigen Höhepunkt Leistungsspektren, während komplexere Wellenformen mehrere spektraler Peaks bei Oberschwingungen der primären Periode (Abbildung 1 zeigen). Daher angesichts der nicht-sinusförmigen zeitliche Muster fliegen Aktivität⁸, ein Multi-peak Leistungsspektrum der Daten soll mathematisch und bedeutet nicht zwangsläufig das Vorhandensein von mehreren Perioden der Schwingung. Wichtig ist, zeigt das Leistungsspektrum der vorgeschlagene Modell Wellenform auch Spitzen alle Oberwellen der primären Periode, ähnlich wie die Fliege Bewegungsorgane Aufnahmen, unterstreicht damit die Hi-Fi, mit denen unser Modell fliegende Daten sowohl in Zeit und Frequenz beschreibt.

Bei Zeit-Auflösungen von wenigen Minuten oder weniger fliegen Aktivität erscheint Daten laut, erschweren die Parameter direkt aus den raw-Daten zu extrahieren. Binning Daten in längeren Zeitabständen Geräuschpegel zu verringern, sondern verändern die Daten in einer Weise, die die Schätzung der Modellparameter beeinflussen können. Deshalb beziehen wir die Parameter von Leistungsspektren der Aufnahmen über einen analytischen Ausdruck für die erwartete Leistungsspektren aus der Fourier-Transformation des Modells Funktion⁸ (siehe zusätzliche Datei 1 Referenz⁸) berechnet. Dieser Ansatz der Parameter von den Leistungsspektren erhalten liefert genaue Parameterwerte ohne jede zusätzlichen Manipulationen, z. B. binning oder Filterung, die rohen Aktivitätsdaten. Mathematischen Details des Modells und der Wildtyp und Mutanten Daten-Anwendungen sind in Referenz⁸beschrieben. Das Protokoll präsentiert hier konzentriert sich auf die schrittweisen Anleitungen zur Verwendung des computational Tools.

Protocol

1. Messung fliegen Fortbewegung mittels Drosophila Activity Monitor (DAM)

Hinweis: Details finden Sie unter Referenz ⁵.

1. Vorbereiten, die einzelnen Röhren mit Essen an einem Ende fliegen und Baumwolle auf der anderen. Ende mit der Nahrung sollte versiegelt werden, um zu verhindern, dass die Speisen austrocknen.
   1. Setzen ca. 5-6 g fliegen Essen in ein 50 mL Becherglas. Das Essen in kleine Stücke schneiden, so dass es einfacher ist, it. Schmelzen
   2. Connect 32 einzelne Glasröhren mit einem Gummiband.
   3. Das Essen im Becherglas schmelzen, durch Erhitzen in der Mikrowelle für 10-15 S. Stop der Mikrowelle alle 5 s und vorsichtig schütteln Sie den Becher um gleich Schmelzen von Lebensmitteln zu gewährleisten.
   4. , Während das Essen setzen die vorbereiteten einzelnen Rohre in das Becherglas mit Lebensmitteln noch flüssig ist. Die Rohre hoch und runter bewegen, so dass sie gleichmäßig gefüllt sind.
   5. Erlauben das Essen zum abkühlen und erstarren für ca. 1 h.
   6. Nachdem das Essen solide ist, entfernen Sie die Rohre mit der Nahrung aus den Becher.
   7. Dichtung am Ende mit dem Essen, mit Wachs. Sorgfältig reinigen ein Rohr mit einem Papiertuch, dann drücken Sie zuerst das Rohr gegen das Wachs. Visuell überprüfen die Qualität der Dichtung, und wiederholen Sie ggf. die Abdichtung wieder.
   8. Schließen Sie das andere Ende des Rohrs mit Baumwolle, Baumwolle erlauben Luft zu durchlaufen, während halten eine Fliege in der Röhre gesperrt.
2. Legen eine Fliege in jedem einzelnen Röhrchen und die Rohre in die DAM.
3. Ort-Monitore in einem Inkubator, der konstante Temperatur und Feuchtigkeit behält. Basierend auf dem Experiment, legen Sie die richtige hell/dunkel-Bedingungen wie folgt.
   1. Für hell/dunkel-Experimente der fliegen in hell/dunkel-Zyklus für das ganze Experiment halten. Verwenden Sie nicht den ersten Tag der Messungen in der Analyse.
   2. Für ständige Dunkelheit Experimente, halten Sie zuerst die fliegen für zwei Tage in hell/dunkel-Bedingungen für die Mitnahme und Synchronisation der Uhren und wechseln Sie dann in ständiger Dunkelheit. Verwenden Sie die Messungen ab dem ersten Tag der ständigen Dunkelheit nicht in die Analyse.
4. Sammeln Sie mindestens vier Tage von Daten, die in der Analyse verwendet werden können.
   Hinweis: Das DAM-System wird eine einzelne Datei mit einer Fortbewegung Aufnahme von alle fliegen im Monitor Ausgang.

2. Analyse der Daten

1. Split die Monitor-Ausgang Datei in mehrere Dateien fliegen Einzelaktivität; jede Datei sollte eine einzelne Spalte ' .txt ' Datei mit einer einzelnen fliegen-Fortbewegung Messung.
2. Run ' ModelFitPS3.m ' Funktion in einem Befehlsfenster Matlab mit folgenden input-Parameter:
   1. für Samplingrate, die Daten Sampling-Zeit-Intervall in Sekunden festlegen. Wenn Aktivität pro Minute gemessen wurde, geben Sie beispielsweise 60 wie die Samplingrate.
   2. Für Bin_interval legen Sie das Zeitintervall in Minuten, die Daten werden zur besseren Visualisierung Makulatur; das empfohlene bin Intervall beträgt 20-30 min.
   3. Für Trend, geben Sie " 1 " Wenn die Daten Grundlinie Trendschau und " 0 " sonst; Daten mit Trend werden einen Polynom zweiten Ordnung und subtrahieren sie dann aus den Daten zuerst trendbereinigte werden.
3. In das Popup-Fenster wählen Sie eine einzelne Fliege Aktivitätsdatei.
   Hinweis: Die erste Handlung ist Daten Leistungsspektrum und nicht die vertraute Tätigkeit Handlung. Aus der geplotteten Leistungsspektrum, bestimmen die primäre Periode T ₀: entweder klicken Sie mit der linken Maustaste auf die circadiane Gipfel oder mit der rechten Maustaste auf die zweite harmonische Spitze (um T ₀ / 2).
4. Auf dem Grundstück geöffnete Daten zu überprüfen, ob am Morgen und Abend Spitzen gut visualisiert werden. Wenn dies nicht der Fall ist, ändern Sie den Bin_interval Wert von überall ein Rechtsklick auf die Grafik und den neuen Bin_interval-Wert in das Dialogfeld eingeben. Das Programm wird die Daten mit dem neuen Wert des Intervalls neu gezeichnet. Um den Bin_interval Wert zu akzeptieren, klicken Sie irgendwo auf das Diagramm.
5. Das Programm wird neu zeichnen die Daten wieder und zeigen die ersten fünf Tage der Aktivität. Auf diesem Grundstück, klicken Sie auf die erste M-Spitze, die in der Analyse (manchmal ist es notwendig, ein oder zwei Tage zu überspringen) verwendet werden.
   Hinweis: Das Programm wird der Graph der gepflückten Morgen Gipfel ab neu gezeichnet. Die blauen und roten Linien zeigen die ungefähre Position der E Peak und nächsten Tag M Gipfel jeweils basierend auf den Zeitraum bestimmt im Schritt 2.4.
6. Im selben Diagramm wählen Sie Daten für einen vorläufigen Sitz der Daten mit dem Modell: Klicken Sie auf die folgenden Punkte (in diesem bestellen, beachten Sie, dass die Klick-Position mit einem roten Stern auf der Unterseite angezeigt wird): (i) oben M Spitze; (Ii) Ende der M-Gipfel; (Iii) Beginn der E-Gipfel; (iv) Gipfel des Berges E; (V) Ende der E-Gipfel; (vi) Gipfel des Berges M des nächsten Tages.
7. Beachten Sie, dass das Programm nun das Leistungsspektrum präsentiert.
   Hinweis: Die X Achse ist jetzt in der Frequenz gegeben.
   1. In dem geöffneten Fenster mit dem Leistungsspektrum, wählen Sie Punkte, die für den Einbau des analytische Ausdrucks für das Modell Leistungsspektrum verwendet werden. Die Periode im Schritt 2.4 erkannt wird mit einer roten Linie markiert. Um Befestigungspunkte auszuwählen, zunächst grob ermitteln der primären Periode, ähnlich wie bei Schritt 2.4. Dann mit dem Schieberegler, Feinabstimmung der primären Periode schätzen, sodass die Armatur zeigt (gezeigt mit roten Kreisen, nach dem Verschieben der Schieberegler erscheint) sind geschlossen, Spitzenwerte.
8. Klicken Sie nach Auswahl der visuellen Höhepunkt " akzeptieren " und passt das Programm ausgewählte Punkten mit der analytische Ausdruck zum Berechnen der Modellparameter.
9. Hinweis, das die Parameter und spektrale Fit Fehler in der Datei gespeichert sind " model_fit_parameters.txtŔ das Programm spart zusätzlich 2 Figuren mit passt der Bewegungsorgane Daten und seine Leistungsspektrum.

Results

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht Quantifizierung der wichtigsten Merkmale in fliegen-Fortbewegung Muster. Die Quantifizierung wird erreicht durch den Einbau der Aktivitätsdaten mit einem Modell, das aus vier exponentielle Bedingungen besteht:

Das Modell verfügt über neun unabhängige Parameter, di...

Discussion

Dieses Werk stellt Anweisungen für die Verwendung eine rechnerische Tool, das eine quantitative Beschreibung der fliegen-Fortbewegung Muster bereitstellt. Das Werkzeug passt Fortbewegung Daten mit einem mathematischen Modell, bestehend aus vier exponentielle Begriffe, die zusammen die Form und Größe der M und E Gipfel beschreiben. Die endgültigen Werte für die Modellparameter stammen aus passend die Leistungsspektren der Daten, wo können die Rohdaten artifizielle Effekte verzichten, die Daten binning oder Filterung auf P...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Misst die Ortung von Fliegen mit einem einzelnen Infrarotstrahl
MatLab	Mathworks		Computerumgebung und Programmiersprache, MatLab sollte Optimierungs- und symbolische Mathematik-Toolboxen enthalten
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(Wildtyp)	Unsere Analyse kann mit Fliegenmutanten jeder zirkadianen Periode durchgeführt werden