Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/55989
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University

Summary

Vi beskriver de detaljerede procedurer og strategier til at måle de mekaniske egenskaber og mekaniske udfoldelsen veje af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en atomic force mikroskop. Vi viser også repræsentative resultater som reference for valg af og begrundelse for god enkelt protein molekyle optagelser.

Abstract

Bestemmelse af de folde proces af proteiner fra deres aminosyresekvens til deres native 3D struktur er et vigtigt problem i biologi. Atomic force mikroskopi (AFM) kan løse dette problem ved at aktivere stretching og lempelse af enkelt proteinmolekyler, som giver direkte dokumentation for specifikke udfoldning og hvorved man genfolder karakteristika. AFM-baserede enkelt-molekyle kraft-spektroskopi (AFM-SMF'ER) giver mulighed for at måle konsekvent højenergi konformationer i proteiner, der ikke er muligt i traditionelle bulk (biokemiske) målinger. Skønt mange papirerne blev udgivet for at vise principper af AFM-SMF'ER, er det ikke let at udføre SMF'ER eksperimenter på grund af mangel på en udtømmende fuldstændig protokol. I denne undersøgelse, vi kort illustrerer principperne af AFM og detaljer omfattende protokoller, procedurer og analyse af data som en retningslinje til at opnå gode resultater fra SMF'ER eksperimenter. Vi demonstrere repræsentative SMF'ER resultater af enkelt protein mekaniske udfoldelsen målinger og vi leverer fejlfinding strategier for nogle almindeligt stødt på problemer.

Introduction

Fremskridt i enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMF'ER) af AFM har aktiveret mekaniske manipulation og præcise karakterisering af enkelt proteinmolekyler. Denne Karakteristik har produceret nye indsigter om protein mekanik1,2, proteinfoldning3, protein-ligand interaktioner4, protein-protein interaktioner5, og protein-baserede manipuleret materialer6,7,8. SMF'ER er især nyttigt for at studere protein udspiller sig, som strækker sig af AFM tillader de kemiske og fysiske obligationer inden for protein molekyle gradvist udvide ifølge deres stivhed, som giver anledning til et stadigt stigende contour længde. Denne overstretching af et protein molekyle kan producere en brat overgang i kraft-udvidelse kurven resulterer i et brud begivenhed (eller tvinge peak). Force bjergtop giver direkte oplysninger om udfoldelsen kraft og strukturelle ændring af protein under den mekaniske udfoldelsen proces. En af de første undersøgelser ved hjælp af AFM målt titin1 og fundet nye aspekter af protein, udfoldning og hvorved man genfolder fysiologiske betingelser uden brug af unaturlige denatureringsmidler ligesom koncentreret kemikalier eller ekstreme temperaturer.

SMF'ER eksperimenter er udført på en bred vifte af instrumenter, men her mener vi kun AFM. AFM består af fire hovedelementer: sonden, detektoren, prøveholderen og den piezoelektriske scanner. Sonden er en skarp spids på en cantilever prægtig slutningen. Efter kalibrering, er bøjning af cantilever under udspænding af en vedhæftet molekyle målt ved hjælp af en laserstråle, der er reflekteres fra bagsiden af udlægget til netop afgøre styrker ved hjælp af Hookes lov. Afspejles laser stråle projekter i en kvadrant fotodiode detektor, som producerer en spænding i forhold til fordrivelse af laserstråle fra byens diode. Substratet med protein prøven i væske er monteret på en 3D piezoelektriske scene, der kan styres med sub nanometer præcision. En computer læser spændingen fra fotodiode detektorer og styrer den 3D scene gennem en computer-styrede spændingsforsyning. Disse piezo aktuator stadier er normalt udstyret med kapacitive eller stammen-gauge holdning sensorer til netop foranstaltning piezo deplacement og korrekte hysterese gennem feed-back control system. Sensor signaludgang fra piezo-controller er omdannet til afstand ved hjælp af konstanten spænding af piezo thats fabrik-kalibreret. Et eksempel force-udvidelsen kurve fra en trækker eksperiment er vist i figur 2.

Der er to typer af AFM-SMF'ER eksperimenter: konstant hastighed og konstant kraft trække målinger. Konstant kraft SMF'ER målinger er beskrevet i Oberhauser et al. 9, mens her vi fokuserer på konstant hastighed målinger. En typisk AFM konstant-velocity trækker eksperiment er udført af giver spænding til et piezo forsigtigt flytte et substrat i forhold til en cantilever tip. En typisk eksperiment har spidsen oprindeligt trykker mod overfladen. Den trækker måling er begyndt ved at flytte substrat fra spids til at bringe ud af kontakt. Hvis et protein, der kommer i kontakt med spids i første omgang, det vil blive trukket og udfoldelsen sporingen af magt mod fordrivelse vil blive målt. Underlaget er derefter bragt tilbage i kontakt med spidsen og en afslappende trace måles hvor proteinfoldning kan bestemmes fra force forskydning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. protein forberedelse

  1. DNA kloning.
    1. Syntetisere en DNA sekvens af interesse, for eksempel DNA-sekvens af NI10C10, eller isolere via PCR fra værtsorganismen ved hjælp af standard molekylærbiologiske teknikker11. Flanke gen af interesse med begrænsning websteder under syntese eller ved at placere websteder i 5'-enden af PCR-primere svarer til et modul i plasmidet pEMI91 (Addgene #74888)12.
    2. Separat fordøje både plasmidet pEMI9112 og DNA-sekvens af interesse med et par af begrænsning sites så at rækkefølgen af interesse vil være flankeret af tandem I91 gentager (Se figur 1). Følg standardprotokol for begrænsning websteder.
    3. Rense fordøjet produktet ved hjælp af gelelektroforese og derefter ligate produkter ved hjælp af T4 DNA ligase, efter en standardprotokol. Efter ligatur, omdanne plasmidet til E. coli celler til plasmid rensning og rense plasmid bruger standardprotokoller. Sekvens bruge T7 primere eller indre pEMI91 primere til at bekræfte, at sekvensen blev med held omdannes.
  2. Transformation.
    1. Fjerne protein udtrykket celler, såsom C41 (DE3) pLysS celler, fra en-80 ° C fryser og en optøning helt på is.
    2. Tilføj 1 µL plasmid DNA til cellerne og rør kort; pipettering op og ned er ikke tilrådeligt, da det vil indføre luftbobler og varme cellerne.
    3. Inkuber kultur rør, der indeholder cellerne og plasmid på is i 30 min.
    4. Heat shock celler i et vandbad på 42 ° C til 45 s.
    5. Retur røret til is i 2 min.
    6. Placer 950 µL af LB bouillon i cellerne og ryste på 250 rpm i 1 timer ved 37 ° C.
    7. Placer omkring 200 µL af transformation på LB plader der indeholder 100 µg/mL Ampicillin. Hvis du bruger et plasmid end pEMI91, derefter bruge passende antibiotika for at plasmid. Placere plade natten over i en inkubator ved 37 ° C. Den næste dag, Fjern plade fra rugemaskinen, wrap med parafilm, og butik nedkølet op til 1 måned.
  3. Protein udtryk.
    1. Podes 15 mL af LB bouillon medium med 100 µg/mL ampicillin i en 50 mL tube ved 37 ° C natten vækst ved at røre en steril pipette tip til en enkelt bakteriel koloni på pladen og pipettering op og ned i LB.
    2. Overføre 15 mL kultur i 1 L af LB bouillon medium med 100 µg/mL ampicillin og ryst i 4-12 timer ved 37 ° C (indtil OD600 > 0,8).
    3. Indsamle 10 mL af kulturen for plasmid forberedelse.
    4. Tilføje 0,2-1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) og lavere temperatur til stuetemperatur for natten udtryk.
    5. Høste celler næste dag ved opdeling i fire rør og centrifugering ved 4000 × g i 40 min, og derefter fryse pellet ved-80 ° C i flere timer.
    6. Send plasmider udvundet fra celler til sekvensering med primere svarende til den indsatte kassette af protein12 og kontrollere det indsatte DNA pålidelighed.
  4. Protein oprensning.
    1. Tø en tube af frosne celler i 30 min. ved stuetemperatur.
    2. Suspendere optøede celler i lysisbuffer (38 mL vand, 2 mL glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 10 µg/mL DNase, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP, 500 µg/mL lysozym) og ryste på køl i 1 time.
    3. Fryse de lysed celler ved-80 ° C i flere timer og derefter re tø op ved stuetemperatur.
    4. Spin den lysate nede ved 13,100 × g i 30 min. ved 4 ° C.
    5. Køre supernatanten gennem en tyngdekraft flow kolonne for specifikke tag (fx Strep-tag eller hans-tag).
    6. Udføre en buffer udveksling ved hjælp af en centrifugal filter ved hjælp af den relevante buffer for Strep-tag eller hans tag og opbevares ved 4 ° C før brug.

2. dias forberedelse til forberedelse af prøver

  1. Forbered glas dias ved hjælp af Piranha løsning.
    1. Sted 10-30 stykker af runde glas dækning underkjoler (radius af 7.5 mm) i en 40 mL glas bægerglas.
      Bemærk: Udføre dette trin og følgende trin i en hætte. Følg standardprocedurer for håndtering af farlige kemikalier i dette trin.
    2. Der tilsættes 30 mL koncentreret svovlsyre (18,4 M).
    3. Der tilsættes 10 mL 30% hydrogenperoxid.
    4. Opvarm blandingen i 10-30 min til 95 ° C.
    5. Forsigtigt dekanteres Piranha løsning i en separat spildbakken (skal genbruges eller kasseres).
    6. Skyl dias med deioniseret vand for at fjerne Piranha løsning.
    7. Suspendere dias i 40 mL acetone.
    8. Dekanteres acetone i en spildbakken og genopslæmmes dias i 40 mL ethanol.
    9. Brug ren pincet til at omhyggeligt udtrække ét dias ad gangen og tør med argon eller renset luft.
    10. Sted rene og tørrede dias under vakuum indtil den guld fordampning eller under argon til langtidsopbevaring.
  2. Forberede guld belagt dias (valgfrit).
    Bemærk: Dette trin kræver brug af et vakuum (e-beam) fordamper, der er tilgængelige i mange renrums faciliteter på større universiteter.
    1. Skær fem objektglas (25 mm x 75 mm rektangulær form) i halve ved hjælp af en glasscutter.
    2. Anvende dobbelt-sidet klæbebånd henover midten af hver af 10 halv objektglas.
    3. Skære den klistrede side af en huskeseddel og anvende på det dobbeltklæbende tape, så den klistrede side i noten er opad. Den huskeseddel er generelt mindre klæbemiddel, men stadig fast tillægger dias til at forhindre fremtidige brud. Derefter kan disse halv objektglas nu fungere som glas dias indehaveren.
    4. Tryk forsigtigt på fire rene glas dias (fra afsnittet 2.1.10) til hvert hjørne af det klistrede side af indehaveren.
    5. Flytte glas dias til en e-beam fordamper. Følg specifikationerne af fordamper at anvende 70 nm af chrom og 300 nm af guld til overfladen.
    6. Gemme de Guld-belagte dias under argon.

3. Prøvetilberedning

  1. Forberede dias.
    1. Vælg en rent jern disk (15 mm i diameter) og tillægger den en selvklæbende fane.
    2. Unattach cover stykke af fanen klæbende.
    3. Vælg et stykke af rene glas (fra afsnittet 2.1.10) eller guld (fra punkt 2.2.7) og placere fast det på den klistrede side af jern-disk, vil dette være eksempeldias.
  2. Deponere protein diaset.
    1. Dialyze polyprotein i bufferen til eksperiment (25 mM Tris-HCl, pH 7,6 med 150 mM NaCl) bruger en buffer Ionbytterkolonnen som et 0,5 mL centrifugal filter. Spin protein i kolonnen for 10 min på 13.000 rpm og derefter vende kolonnen og elueres protein ind i en ny buffer af spinning på 1000 rpm i 2 min.
    2. Bestemme den omtrentlige proteinkoncentration ved måling af absorbans ved 280 nm, bruger et spektrofotometer.
    3. Fortynd protein til 10-100 µg/mL i en endelige mængden af 100 µL.
    4. Anvende de 60 µL af protein løsning på midten af diaset. Vær forsigtig på dette stadium ikke at lade nogen form for væske ind under ind i hullet mellem glas og jern dias, da dette kan medføre hævelse af limen i løbet af eksperimentet og ukontrolleret prøve bevægelser.
      Bemærk: Guld slides er hydrofobe, og en sfærisk droplet vil danne, mens glas dias er mere hydrofil og protein løsning kan spredes.
    5. Lad prøven sidde ved stuetemperatur i 10-60 min. I løbet af denne tid, gå videre til næste trin for at begynde at oprette atomic force microscope.

4. atomic Force mikroskop (AFM) Setup

Bemærk: Følgende er en generel beskrivelse af opsætning af AFM, og nogle specifikke detaljer kan variere afhængigt af den specifikke instrumentering brugt. Instrumentering brugt er delvist hjemmebyggede og beskrevet i detaljer i Scholl13.

  1. Montere cantilever på en AFM celle.
    1. Vælg cantilever med hensigtsmæssige egenskaber for programmet. Brug køreledningsophæng med foråret konstanter 4-10 pN/nm for lav udfoldelsen styrker (~ 10-50 pN), mens brug køreledningsophæng med foråret konstanter 15-100 pN/nm for høj udfoldelsen styrker.
    2. Omhyggeligt afhente cantilever fra slutningen og læg det i sonden bedrift celle.
    3. Sørg for, at holdecelle fast holder cantilever på plads før du fortsætter.
    4. Sted holdecelle ind i AFM hovedet for justering af laser.
  2. Juster laser i AFM hoved.
    1. Læg hovedet på en inverteret mikroskop og forbinde en batteripakke til AFM hovedet til kraftoverførsel laser i hovedet.
    2. Vedhæfte et kamera til mikroskop-detektor, således at laserlys kan visualiseres på et TV eller en computerskærm.
    3. Placer laseren, så det er beliggende på spidsen af af udlægget
  3. Mount hovedet med prøve.
    1. Skyl 10 µL af buffer ind i hver af sonden bedrift celle havne.
    2. Tage den eksempeldias, som har inkubere og dekanteres 40 µL af væske fra den rugede løsning. Tilføje 40 µL af bufferen på diaset. Sted eksempeldias på magnet over piezo.
    3. Sørg for, at AFM scenen er i en ophøjet position. Placer derefter AFM hovedet ind på scenen, så AFM cantilever er ovenfor prøve slipværktøjet.
  4. Center afspejles laserstråle på en fotodiode.
    1. Skær et lille stykke papir og placere den foran AFM fotodiode.
    2. Flytte AFM laser ved hjælp af knapperne, så laser spot på papiret bliver fokuseret og lyse.
    3. Justere AFM hoved spejlet, så laseren rammer fotodiode for at maksimere den samlede signal i alle kvadranter (A + B + C + D) og forårsager forskellen signalet mellem top to og nederste to kvadranter for at være nul (A + B-C-D).

5. atomic Force Microscope kalibrering

  1. Måle power spectrum.
    1. På filteret tilsluttet AFM, drej filterindstilling for AFM hoved signal til fuld båndbredde.
    2. AFM, selv, Sørg for at piezo er slukket, som dette vil tilføje støj til signalet.
    3. Bruge AFM software14 til at måle gennemsnitlige 512 beregninger af magt spektret fra 1.024 datapunkter pr. beregning.
    4. Bruge AFM software15 til at integrere spektral effekttæthed på tværs af den første top, der svarer til vibration til cantilever hovedtilstand.
  2. Beregne fotodiode følsomhed.
    1. AFM, selv, slå piezo-controller og ændre indstillingen filter til 500 Hz (low-pass filter).
    2. Overvåge forskellen signalet, som bør svingende omkring nul i AFM software. Hurtigt flytte AFM hovedet ned et par hundrede mikrometer ved hjælp af micropositioners. Gentag flytter hovedet ned og overvåge forskellen signal for konsekvent hopper. Overfladen er meget i nærheden når signalet hopper begynde at øge i højden.
    3. Så snart afbøjning signal mættede fedtsyrer ved kontakt med overfladen, flytte hovedet væk fra overfladen lidt.
    4. I AFM software, skal du bruge indgangskontrolmulighederne til at regulere piezo spændingen for at finde overfladen, ved at flytte op eller ned 100-5.000 nm. Hvis overfladen ikke er stadig i reach, fortsætte med at mindske afstanden mellem hovedet og prøven manuelt.
    5. I AFM software, foretage en trækker eksperiment med en scanningsstørrelse på omkring 500 nm så at spidsen kommer i kontakt for omkring 100 nm piezo rejse.
    6. Måle hældningen af den lineære region fotodiode signal versus piezo forskydning kurve hvor AFM spidsen forbliver i kontakt med underlaget overflade.
    7. Beregne foråret konstant og følsomhed ved hjælp af hældningen og integrerede power spectrum (Equation 1).

6. opsamling

  1. Forberedelse.
    1. Filtrene tilsluttet AFM, angive det filter opsætning så samplingfrekvensen er mindst to gange den båndbredde (Nyquist kriterium), som vil give en øvre grænse for low-pass cutoff.
  2. Målinger.
    1. Indstillet af scanningsstørrelse til den samlede teoretiske størrelse af udfoldelsen polyprotein (antallet af aminosyrer × 0.365) plus omkring 40% til trykker mod underlaget. For eksempel trække en 9 x I91 konstruktion vil have en teoretisk udfoldet længde på omkring 300 nm, så scanningsstørrelse bør være omkring 420 nm.
    2. Placer cantilever i AFM software, således at det er 80% af scanningsstørrelse væk fra overfladen (i dette tilfælde om 340 nm fra overfladen).
    3. I AFM satte software, scanning hastighed til 300 nm/s i første omgang.
      Bemærk: Denne hastighed kan ændres til at være langsommere eller hurtigere, afhængigt af programmet.
    4. Udføre en trækker eksperiment og måle den resulterende holdning piezo og fotodiode signal. Bruge AFM software til at starte scanningen.
    5. I AFM software, fortsætte med at udføre målingerne, indtil der er ca. 10.000 optagelser.
      Bemærk: Pickup er en positiv-kontrollerede molekyle generelt, omkring 0,5%16, så 10.000 er nødvendige for at kunne indsamle tilstrækkelige data til at analysere.

7. dataanalyse

  1. Normalisere dataene.
    1. For hver optagelse, beregne den forlængelse benytter forlængelse = forskydning - F/kc (kc er fra 5.2.7).
    2. Fastslå gældende basisniveauet ved at tage gennemsnittet af enten starten eller slutningen af force-udvidelsen spor, hvor ingen kraft toppe er til stede, og hvor cantilever ikke trykke mod overfladen. Hele kraft-udvidelse kurve kan derefter flyttes af dette gennemsnit.
    3. Oversætte data, således at forlængelsen er afstemt langs nul y-aksen. Dette skyldes, at molekylet skal indstilles til nul udvidelse i begyndelsen af et spor.
  2. At identificere proteiner af interesse.
    1. Identificere optagelser med mindst fire I91 begivenheder, der giver en enkelt-molekyle fingeraftryk. Disse optagelser fange sand "enkelt-molekyle målinger".
    2. Gemme begivenheder, der betegnes enkelt-molekyle begivenheder for yderligere analyse.
  3. Bestemme contour-længde tilvækst.
    1. For hver optagelse, passe et ormelignende forsyningskæden model til udfoldelsen begivenhed, Equation 2 hvor Equation 3 ved stuetemperatur, p er vedholdenhed længden (typisk 0,4 til 1 nm), x er forlængelsen i nanometer og L er den contour længde i nanometer.
      Bemærk: Form af orm-lignende kæde er en interpoleret opløsning til den nøjagtige, en mere nøjagtig numerisk løsning er fundet i Bouchiat et al. 17. alternativ montering modeller kan findes i Su et al. 18.
    2. Beregner forskellen mellem værdierne for L bestemmes for to på hinanden følgende unfolding begivenheder, og denne forskel er opfundet "kontur-længde tilvækst".
  4. Bestemme brud kraft.
    1. Beregne brud gældende for en given udfoldelsen begivenhed ved at tage det højeste punkt før det største fald i udfoldelsen kurven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater fra denne protokol er vist i figur 2. Begge paneler viser repræsentativ kraft-udvidelse kurver fra proteiner. Top viser resultater fra en I91 polyprotein, mens bunden viser I91 protein flankerende en protein-af-interesse, NI10C molekyle. Disse optagelser viser I91 karakteristiske kraft (200 pN) og kontur længde tilvækst (28 nm) som angiver, at den justering og kalibrering af AFM var vellykket. Disse force-udvidelsen kurver kan derefter analyseres af orm-lignende kæder (stiplet linje) som hjælp til at bestemme den kraft-uafhængig længden af molekylet og bestemme antallet af udfoldet restkoncentrationer. Når analyseret, kontur-længde intervaller (forskellen mellem efterfølgende contour-længder) og den udfoldende kraft kan bruges til at bestemme protein stabilitet, udfoldning sats, og udfolder sig vej19.

Figure 1
Figur 1: Plasmid kort over polyprotein. Denne polyprotein plasmid kort sekvens og fysiske DNA er tilgængelig via Addgene repository (www.addgene.org/74888). Det viser den prototypiske polyprotein design til AFM, hvor en polyprotein består af 8 ens gentagelser af I91 protein (grå bokse) som flankerer en protein af interesse (rød). Hvert modul indeholder en entydig begrænsning site, der tillader tilpasning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentant SMFS resultater. A. repræsentativ kraft-udvidelse kurven for poly I91 protein. Contour længde tilvækst mellem toppene er ~ 28 nm, og udfoldning styrker er mellem 100-200 pN. B. repræsentativ kraft-udvidelse kurven for (I91)3-NI10C-(I91)3 protein. Gennemsnitlig contour længde for ankyrin Gentag er ~10.5 nm, og udfoldelsen styrker er mellem 8-25 pN. Almindelig sav-tand mønster for ankyrin gentagelser er efterfulgt af I91 udfoldelsen toppe. Trække hastighed for begge (A) og (B) er 0,02 nm/ms. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et kritisk trin i protokollen er brugen af en polyprotein, beskrevet taktfast 1.1.2, der tjener som en positiv kontrol til "fingeraftryk" enkelt-molekyle begivenheder. Generelt, der skal udfoldelsen begivenheder af polyprotein proteiner (for I91, betyder det en udfoldelsen kraft af omkring 200 pN og kontur længde tilvækst af omkring 28 nm) til utvetydigt konkludere, at protein af interesse har været udfoldet. For eksempel, når protein af interesse er flankeret af tre I91 domæner fra begge sider, skal så der være mindst fire I91 begivenheder til at konkludere, at det er positivt en enkelt-molekyle begivenhed. Hvis der ikke er en positiv kontrol gennem en polyprotein, eller på anden måde, så er alle data ansvarlig for fejlfortolkninger.

Kloning strategien for plasmidet afhænger af genet og plasmid af interesse. Vi har stillet til rådighed en polyprotein plasmidet, som kan bruges sammen med denne protokol12. Der er plasmider tilgængelige for dette trin, der indeholder entydige begrænsning websteder for enkle kloning20,21. Disse plasmider kræver kun et unikt sæt af begrænsning websteder nemt klone i protein af interesse i plasmidet. Der er også metoder til at oprette denne plasmid fra bunden ved hjælp af Gibson forsamling22 som har fordel af nemt ændre de afskalning proteiner samtidigt med at indlagde protein af interesse. Der er også plasmider med modulære polyproteins med codon blandes domæner, der giver en enkel måde til effektivt sekvens interesse, medvirken i at sikre troskab21hele proteinet.

Valg af guld eller glas afhænger om protein er bestemt vedhæftet findes. Guld substrater giver mulighed for at danne Au-Cys obligationer mellem polyprotein og overfladen. Hvis en Cys føjes til slutningen af polyprotein, kan dette tjene som en måde at specifikt vedhæfte proteinet til overfladen. Glas substrater kan bruges af sig selv, som er nyttige for nogle proteiner, som ikke adsorberes godt til guld og er også nemmere at generere. Glas dias kan også bruges som en forløber for ved hjælp af bestemte vedhæftede filer med specialfremstillede polyproteins23. Glimmer substrater kan også bruges, hvilket kan være nyttigt for nogle proteiner, som har specifikke afgift websteder, der kan bindes til den negativt ladede overflade.

AFM spektroskopi på proteiner har flere vigtige begrænsninger. Prøveforberedelse kan mislykkes, hvis proteinet ikke kan splejses ind i en polyprotein. Proteiner, der er for lille til at producere målbare contour-længde intervaller eller for svag til at modstå kraft vil også ikke kunne løses af AFM. Typiske opløsning i AFM eksperimenter kun tillader løse styrker så lavt som 10-15 pN på grund af den typiske RMS støj i AFM udkragninger, selv om de seneste fremskridt har gjort tilgængelige bedre beslutninger med avancerede instrumentation24. Hastighed for konstant hastighed eksperimenter er også begrænset til omkring 4 nm/s25, og den bedste opløsning opnået kan typisk opdage stater kortere end 10 µs24. Hvis proteiner er mindre mekanisk stabile, de er bedre kendetegnet ved hjælp af optisk pincet, som har en lavere kraft vifte og typisk en højere tidsmæssige opløsning. Der findes stadig forbedringer i fremtiden til AFM, som kombinerer med FRET26, ved hjælp af AFM imaging for at bestemme protein positioner27 og stigende opløsning med specialdesignede udkragninger28.

AFM teknik er væsentlige for den eksisterende metoder, fordi det giver mulighed for udtrække kinetiske parametre, som udfolder sats og overgangen stat afstand på et enkelt molekyle niveau29. Mens andre traditionelle biokemiske metoder (NMR, kemiske denaturering, stoppet-flow fluorescens) kan også indhente oplysninger om kinetiske parametre, er resultaterne af disse metoder funktioner af en protein ensemble og ikke et enkelt molekyle. Dette gør en væsentlig forskel i tilfælde hvor der er forskellige og adskilte ensembler af et enkelt protein. AFM har vist sig for at være i stand til at skelne delpopulationer, i stedet for gennemsnit dem sammen30.

Den detaljerede forklaring af SMF'ER eksperiment på proteinmolekyler ovenfor stadig forudse ikke eventuelle problemer, der kan løses med erfaring. I den følgende vi drøfte fælles problemer og fejlfinding i forbindelse med opererer en AFM for konstant-velocity eksperimenter.

Sinusoidal-formet kraft baseline. Figuren sinusformet er skadeligt at bestemme korrekte kraft peak værdi, da det er vanskeligt at beregne baseline. Problemet er forårsaget af interferens af laser reflekteres fra af udlægget. For at afhjælpe dette problem, kan placeringen af laser spot på cantilever være lidt flyttet så længe den nye holdning stadig bevarer en god sum signal fra en fotodiode. Hvis problemet stadig fortsætter, kan du overveje at Repositionering af udlægget i sonden bedrift celle.

Fotodiode signal ikke mætte i et-trins når rører overfladen første gang. Når rører overfladen, hopper fotodiode signal i flere trin, indtil den når den mættede værdi. Det betyder, at spidsen ikke er det laveste punkt i AFM hoved og et andet sted på sonden chip kan røre prøveoverfladen før spidsen af cantilever. Dette problem har fastlægges nærmere for at fortsætte SMF'ER målinger og få korrekte force-udvidelsen kurve. Du kan løse problemet, forsøger at flytte placeringen af cantilever i sonden bedrift celle frem og tilbage og justere tæthed af krogen, som griber cantilever på plads. Hvis dette ikke hjælper, kan du prøve at skifte til en anden cantilever på samme chip eller endda ændre til en ny cantilever chip.

Ingen hændelser på alle eller mange hændelser ved retraktion. Dette er relateret til at finde den korrekte proteinkoncentration for eksperimentet. Hvis der er altid en enkelt stor kraft peak (> 500 pN) optræder på den strækning spor og ingen andre toppe vises mens gennemføre eksperimenter på guld belagt overflade, er cantilever faktisk måling guld-guld interaktion siden prøve molekyler på overfladen er alt for sparsomme. I dette tilfælde øges koncentrationen af protein prøven deponeret på guld overflade. Hvis der er flere uregelmæssigt formet toppe optræder på hver strækning spor af hver trække cyklus, tyder det imidlertid, at der er for mange molekyler absorberet til overfladen, at dannet et lag eller en kompliceret netværk på overfladen. I dette tilfælde skal prøven vaskes af den buffer, der bruges til at fjerne overskydende proteinmolekyler. Undertiden forbereder en ny prøve med lavere koncentration af protein er nødvendigt at slippe af med dette problem. Hvis den nye prøve også ikke kan løse problemet, tjek matteret ringformede rillen på AFM bedrift celle at se hvis nogen væske trængt ind i det. Rillen bør holde tørt under eksperimentet, da enhver væske i rillen vil par vibrationer af prøven i bedrift cellen og forårsage fotodiode signal at ændre unormalt når cantilever og overfladen er i kontakt.

Falske graduering af fotodiode signal, mellem ramperne. Dette er vejledende af flow, der kan skubbe den cantilever frem og tilbage, som er normalt forårsaget af en lille boble, der er i transit gennem de flydende kanaler. Denne type problemer vil forstyrre målinger med enorme signal stiger eller falder. For at løse dette problem, hæve hovedet fra underlaget, således at væsken omkring af udlægget ikke længere rører væsken omkring substratet. Derefter bringe dem tilbage sammen, og flytte hovedet tilbage til overfladen. Reformationen af kolonnen væske i cellen AFM er normalt nok til at forstyrre boblen fra de flydende kanaler, men hvis ikke, gentages er nødvendige.

Systematisk stigning eller fald i fotodiode signal. Drifting er et fænomen, der er til stede overalt i hvert forsøg, hvor udkragninger og spidsen vil altid glider meget hurtigt ved at røre den flydende drop på prøveoverfladen. Afdrift kan være forårsaget af temperatur ækvilibrering, hvor temperatur-induceret udvidelse eller sammentrækning af cantilever forårsager vibrationer i signalet. Venter mere end 10 min før gennemfører den første eksperiment formindskes betydeligt drivende hastighed. Når gennemføre trækker eksperimenter, hvis sporingen af stretching og afslappende ikke er sammenfaldende med hinanden, så er der en hysterese mellem de to halvdele af den trække cyklus, som svarer til en hurtig drivende sats og kræver ekstra tid til at nå ligevægt. Hvis force baseline hælder opad med en lille vinkel, den drivende hastighed er hurtigere end den trække hastighed og det er bedre at suspendere eksperiment at vente for mindre vibrationer på spidsen.

Force-udvidelsen kurve indledende region er ikke lodret. Det er nyttigt at se på handlingen kraft-udvidelse af optagelser, efter de er erhvervet fra en nyligt kalibreret opsætning. Hvis disse optagelser ikke viser et lodret område når cantilever presser mod overfladen, så kalibreringen kan være et problem og det skal gentages fra step 5.

Fotodiode signalet forsvinder efter et stykke tid. Dette kan skyldes fordampning af buffer i cellen væske. Det er vigtigt for at rehydrere celle ved at anvende mere buffer hver time eller så, for at holde prøven fra udtørring og gøre den ubrugelig for yderligere eksperimenter.

Iboende støj er høj (> 30 pN). En stor mængde af støj (målt som RMS kalibreret fotodiode udsving) er vejledende for ekstern støj. AFM eksperimenter skal ske på en luft-tabel til at reducere mængden af kobling til bygningen, men ekstern støj kan også være forårsaget af usikker fase, auditive støj i nærheden, eller koblingen af tabellen luft til nærliggende statiske objekter (f.eks. en stol). Støj kan også komme fra det elektroniske kontrollerende system af AFM (fx ustabil forbindelse i det elektroniske system).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation støtte MCB-1244297 og MCB-1517245 til PEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM Specimen Discs, 15mm diameter Ted Pella, Inc. 16218 Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick Ted Pella, Inc. 26024 serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs Ted Pella, Inc. 16079 Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly Bruker Nano Inc. 1B75C AFM head
Glass probe holder Bruker Nano Inc. MTFML-V2 Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  
Microlever AFM probes Bruker Nano Inc. MLCT Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips Bruker Nano Inc. OBL-10 Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs National Instruments PCI-6259 Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators Physik Instrumente LP P-753.11C Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage Physik Instrumente LP P-541.2CD Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  2. Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
  3. Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
  4. Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
  5. Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
  6. Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
  7. Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
  8. Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
  9. Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
  10. Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
  11. Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
  12. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
  13. Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
  14. Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
  15. Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
  16. Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
  17. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
  18. Su, T., Purohit, P. K. Mechanics of forced unfolding of proteins. Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).
  19. Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
  20. Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
  21. Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
  22. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  23. Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
  24. Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  25. Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
  26. He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
  27. Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
  28. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  29. Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
  30. Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).

Tags

Biokemi spørgsmålet 144 Atomic force microscope polyprotein protein foldning enkelt-molekyle kraft spektroskopi protein oprensning
Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E.,… More

Scholl, Z. N., Li, Q., Josephs, E., Apostolidou, D., Marszalek, P. E. Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope. J. Vis. Exp. (144), e55989, doi:10.3791/55989 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter