Erkennung von passives Spender erythroiden Vorläuferzellen nach hämatopoetische Stammzell-Transplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien

Summary

Quantifizierung der Spender gewonnenen Zellen ist erforderlich, um Engraftment nach Stammzelltransplantation bei Patienten mit Hämoglobinopathien überwachen. Eine Kombination von Flow Cytometry-basierte Zellsortierung Kolonie Bildung Assay und anschließende Analyse von kurzen Tandem, die wiederholt verwendet werden, um die Verbreitung zu beurteilen und Differenzierung im Fach erythroiden Vorläuferzellen.

Abstract

Das Vorhandensein von unvollständigen Chimerism ist in einem Großteil der Patienten nach Knochenmarktransplantation für große Thalassämie oder Sichelzellenanämie vermerkt. Diese Beobachtung hat enorme Auswirkungen, da spätere therapeutische Immunmodulation Strategien klinische Outcome verbessern können. Konventionell, dient Polymerase Kettenreaktion-basierte Analyse der kurze Tandemwiederholungen Chimärismus in Spender stammenden Blutkörperchen zu identifizieren. Allerdings ist diese Methode beschränkt sich auf kernhaltigen Zellen und kann nicht unterscheiden zwischen dissoziierten einzellige Abstammungen. Wir die Analyse der kurze Tandemwiederholungen durchflusszytometrischen sortiert hämatopoetischen Vorläuferzellen zu fließen und verglichen mit der Analyse der kurze Tandemwiederholungen aus ausgewählten Burst-bildende Einheit - erythroiden Kolonien gewonnen, beide aus dem Knochen gesammelt Knochenmark. Mit dieser Methode können wir die verschiedenen Proliferation und Differenzierung der Spenderzellen in erythroiden Fach unter Beweis stellen. Diese Technik ist berechtigt, Stromüberwachung von Chimärismus in der Stammzell-Transplantation Einstellung abzuschließen und somit möglicherweise angewandte künftig klinische Studien, Stammzellforschung und Gestaltung der Gen-Therapie-Studien.

Introduction

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist der einzige verfügbare kurative Ansatz für eine Vielzahl von angeborenen genetischen Erkrankungen des blutbildenden Systems, krankheitsfreien Überlebensraten von über 90 % zu erreichen, denn sonst stark beeinträchtigt und lebensdauerbegrenzten Patienten¹. Die Wirksamkeit dieses wichtige therapeutische Werkzeug optimiert durch die Begrenzung der Toxizität von Pre- und nach der Transplantation Therapien², aber auch durch Interventionen auf die Aufrechterhaltung stabiler Organfunktion, quantifiziert die durch genaue Beobachtung der Spender-abgeleitete Zellen

Protocol

1. Isolation des blutbildenden Knochenmarkzellen durch Multi-Parameter-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

1. 1. Probe zu beflecken, bevor Sie den Prozess, die folgenden Punkte müssen abgeholt werden und zubereitet:
      1. Gradient-Medien für die Zubereitung von mononukleären Zellen (GM), 50 mL konische Rohre
      2. 12 x 75 mm Messrohre für das Beflecken Zellen
      3. Retikuläres Puffer: Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 3 % fetalen Kälberserum (FCS)
      4. Pipetten < / l ich >
      5. FC Block und Färbung Antikörper (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450 BD Biosciences). Mit dieser Kombination Fluorochrom ist vernachlässigbar Spil....

Results

Trennung von Lymphohematopoietic Vorfahren von FACS Zellsortierung

Hier zeigen wir die Ergebnisse von der Sortierung der notwendigen Zellpopulationen für nachgeschaltete STR Analyse. Knochenmark-Zellen wurden mit V450-konjugierten Anti-CD45, FITC-konjugierten Anti-CD36 und APC-konjugierten Anti-CD34 gebeizt. Die Bevölkerung von Interesse ist die Megakaryocyte erythroiden Vorläuferzellen (MEP), kernhaltigen Zelle.......

Discussion

Das Ziel der aktuellen Studie ist es, dem Publikum eine Kombination aus beiden Ansätzen geben für Spender/Empfänger Chimärismus in erythroiden Vorläuferzellen nach HSCT bei Patienten analysieren für Hämoglobinopathien behandelt: 1.) Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmarkproben gefolgt von Analyse der kurze Tandemwiederholungen und 2.) koloniebildenden Einheit wächst der Knochenmarkzellen, Klassifizierung von Kolonien in verschiedenen Vorläuferzellen gefolgt von Analyse der k.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	GE Healthcare	GE17-1440-02	RBC entfernen
Konische 50-ml-Röhrchen	Falcon	14-432-22	Probenvorbereitung
12 x 75 mm Durchflussröhrchen	Falcon	352002	FACS-Sortierung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Gibco	10010023	PBS
Fötales Kälberserum	Invitrogen Inc.	16000-044	FCS (hitzeinaktiviert)
CD34 APC	BD Bioscience	561209	FACS-Ab
CD36 FITC	BD Bioscience	555454	FACS-Ab
CD45 V450	BD Bioscience	642275	FACS-Ab
Trypanblau	Gibco	15250061
Hämozytometer	Invitrogen Inc.	C10227	Automatische Zellzählung
Hank' s Balanced Salt Solution	Gibco	14025092	Suspensionspuffer in der FACS-Analyse
HEPES	Gibco	15630080	Bestandteil des Suspensionspuffers
FcR	BD Bioscience	564220	Block FCR
FACS Aria I	BD Bioscience	23-11539-00	FACS Sorter
Rekombinant  humanes Erythropoietin	Affimetrix eBioscience	14-8992-80	EPA
Isocove" s Modifizierter Dulbecco" s Medium	Gibco	12440053	IMDM
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081	Bestandteil des Kulturmediums
CD34+ magnetische Beads	Milteny Biotech	130-046-702	CD34+ Aufreinigung
Rekombinant  humaner G-CSF	Gibco	PHC2031	CFU-Assay
Rekombinant  humaner SCF	Gibco	CTP2113	CFU-Assay
Rekombinant  humaner GM-CSF	Gibco	PHC2015	CFU-Assay
Rekombinant  humaner IL-3	BD Bioscience	554604	CFU-Assay
Rekombinant  humaner IL-6	BD Bioscience	550071	CFU-Assay
Methocult H4434 Medium	Stemcell Technologies	4444	CFU-Assay
QiAmp DNA Blutextraktionskit	Qiagen	51306
DNA-Isolierung Nanodrop ND-1000 Spektrenphotometer	Thermo Scientific	ND 1000	DNA-Quantifizierung
DNAase-frei H2O	Thermo Scientific	FEREN0521	DNA-Vorbereitung
AmplTaq Gold DNA-Polymerase	Angewandte Biowissenschaften	N8080240	PCR
Eppendorf Mastercycler	Gradient Eppendorf	6321000019	PCR
Hi-Di Formamid	Angewandte Biowissenschaften	4311320	PCR
GeneScan 500 ROX Größenstandard	Angewandte Biowissenschaften	4310361	PCR
3130 Genetischer Analysator	Angewandte Biowissenschaften	313001R	PCR