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Methodenartikel

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

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DOI:

10.3791/56003

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27. November 2017

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1Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama, 2College of Medicine, University of South Alabama, 3Institute for Regenerative Medicine, University of Zurich, 4Department of Dermatology, University Hospital Zurich, 5Center for Applied Biotechnology and Molecular Medicine (CABMM), University of Zurich - Irchel Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von primären amniotische Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen in induzierte pluripotente Stammzellen unter Verwendung eines nicht-Integration von episomal Ansatzes in vollem Umfang chemisch definierten Bedingungen. Verfahren der Gewinnung, Kultur, Neuprogrammierung und Charakterisierung der daraus resultierenden induzierten pluripotenten Stammzellen durch strenge Methoden werden detailliert beschrieben.

Zusammenfassung

Autologe zellbasierte Therapien bekam einen Schritt näher an der Realität mit der Einführung von induzierten pluripotenten Stammzellen. Fetaler Stammzellen, wie Fruchtwasser und Membran mesenchymale Stammzellen, stellen eine einzigartige Art von undifferenzierten Zellen mit Versprechen in Gewebe-Engineering und Reprogrammierung in iPSC für zukünftige pädiatrische Interventionen und Stammzell-banking. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt ein optimiertes Verfahren zur Gewinnung und Kultivierung primäre amniotischen Flüssigkeit und Membran mesenchymalen Stammzellen und generiert episomal induzierte pluripotente Stammzellen aus diesen Zellen in vollem Umfang chemisch definierte Kultur Bedingungen, die Nutzung von menschlichen rekombinante Vitronectin und E8 Medium. Charakterisierung der neuen Linien durch die Anwendung strenger Methoden – Durchflusszytometrie, konfokale Bildgebung, Teratom Bildung und transkriptionelle profiling – wird ebenfalls beschrieben. Die neu erzeugten Linien auszudrücken Marker von embryonalen Stammzellen – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – wobei negativ für die SSEA-1-Markierung. Die Zelllinien bilden darum in scid-Beige Mäuse in ca. 6-8 Wochen und die darum enthalten Gewebe repräsentativ für alle drei Mikrobeschichten. Transkriptionelle Profilierung der Linien mit dem Absenden globalen Ausdruck Microarray Daten zu einem Bioinformatic Pluripotenz Bewertung Algorithmus als alle Linien pluripotenten und daher ist dieser Ansatz eine attraktive Alternative zu Tierversuchen. Die neuen iPSC-Linien können problemlos in nachgeschalteten Experimente mit der Optimierung von Differenzierung und Tissue Engineering verwendet werden.

Einleitung

Die Technologie von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) bringt über mögliche Zellersatztherapien, Krankheit, Medikament und Entwicklungsstörungen Modellierung und toxikologischen Screening1,2,3. -Ersatz-Therapien können konzeptionell durch Zelle Injektion erreicht werden, in-vitro-differenzierte Gewebe (z. B. kardiale Patches) Implantation oder geführte Regenerierung mittels Gewebetechnik. Fruchtwasser (AFSC) und Membran-Stammzellen (AMSC) sind eine ausgezeichnete Quelle von Zellen für diese Interventionen entweder direkt4,5,6,7 oder als ein Ausgangspunkt Zellpopulation Umprogrammierung in Pluripotenz8,9,10,11,12.

Frühe Ansätze verwendet nicht definierte Kultur-Systeme oder Neuprogrammierung Methoden, die beinhalten genomischen Integration von9,10,11,12konstruiert. Eine neuere Studie beschäftigt ein Xeno-freies Medium, obwohl eine weniger definierte Basalmembran Anlage Matrix (BMM) verwendet wurde, um iPSC aus amniotische Flüssigkeit Epithelzellen zu generieren. Teratom Bildung Assay war jedoch nicht in die Studie zusammen mit einer Fülle von in-vitro- und molekulare Daten enthalten. Amniotische flüssige epitheliale Zellen erwiesen sich als eine etwa 8-fold höhere Neuprogrammierung Effizienz im Vergleich zu Neugeborenen Fibroblasten13haben. In einer anderen Studie fanden mesenchymaler Stammzellen aus Fruchtwasser auch in iPSC mit einem viel höheren Wirkungsgrad12neu programmiert werden.

Pluripotente Stammzellen unterscheiden sich in Geweben repräsentativ für alle 3 Mikrobeschichten und somit das größte Potenzial haben. Pädiatrische Patienten könnten davon profitieren die Ernte, Neuprogrammierung und Tissue Engineering ihre autologe amniotische Flüssigkeit Stammzellen pränatal und perinatal amniotischen Membran-Stammzellen. Darüber hinaus konnte das relativ niedrige Niveau der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (niedriger als adulte Stammzellen14,15) theoretisch helfen bei der Bewältigung des beobachteten Eigentumsvorbehalts epigenetische Voreingenommenheit von Quellzellen iPSC16.

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Umprogrammierung Fruchtwasser und Membran Stammzellen zur Pluripotenz in chemisch Xeno-freie E8 Medium für rekombinante Vitronectin17 (VTN) mit episomal Plasmide18definiert. Der Hauptvorteil der amniotischen Flüssigkeit und Membran-Zellen als eine Quelle der Zellen für eine Anpassung liegt in ihrer Verfügbarkeit Pre und perinatal und somit würde dieser Ansatz vor allem Forschung zugute, in pädiatrischen Gewebetechnik.

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Protokoll

Das Protokoll folgt institutionellen Richtlinien der Ethik-Kommission für Forschung am Menschen. Schriftliche Einwilligung des Patienten wurde für die Verwendung von Fruchtwasser für die Forschung erhalten.

Dieses Protokoll folgt die Politik der institutionellen Animal Care und Use Committee von der University of South Alabama.

1. Isolierung und Kultur der primären Fruchtwasser mesenchymalen Stammzellen

  1. Beschichtung von amniotische Flüssigkeit Zellen
    1. Erhalten Sie ein Minimum von 2,5 mL Fruchtwasser geerntet in den Prozess der Amniozentese durch einen Arzt.
      Hinweis: Alle Umgang mit lebenden Zellen und Gewebe muss in einem sterilen Gewebekultur Schrank durchgeführt werden und muss geeignete persönliche Schutzausrüstungen verwendet werden. Vertrautheit mit den grundlegenden Zellkultur und steriler Technik ist erforderlich.
    2. Bereiten Sie die amniotische Flüssigkeit und Membran (AFMC) Zellkulturmedium: EBM-2 basal Medium, 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 20 ng/mL von bFGF, 25 ng/mL des EGF, 10 ng/mL des IGF. Für die Kultur der primären amniotic Fluid sowie amniotischen Membran Stammzellen sollte das Medium mit Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt werden.
    3. Am Tag 0 mischen Sie 2,5 mL Fruchtwasser mit 3,5 mL Kulturmedium AFMC und Platte in ein T25-Fläschchen. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 48 Stunden vor der Prüfung auf das Vorhandensein von Kolonien ungestört.
    4. Am 5. Tag sollte Kolonien von adhärenten Zellen vorhanden sein. Schütteln Sie die Flasche um Zellen zu entfernen, die nicht in vollem Umfang haften am Boden und Schutt und Vakuum-Aspirat die abgebrannte Medium/amniotische flüssige Mischung mit einer Pasteurpipette. Ersetzen Sie mit 5 mL frischem AFMC Medium.
    5. Kultur für weitere 5 Tage. Verändern Sie jeden zweiten Tag, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben Medium.
  2. Isolierung der primären mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen amnion
    1. Erhalten Sie die Plazenta so bald wie möglich nach der Geburt, innerhalb von 24 h spätestens zellulären Integrität zu maximieren. Schneiden Sie ein 9 cm2 Segment der Amnion, Blutgerinnsel entfernen und waschen in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 30 mL PBS mit Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt.
    2. Hacken Sie die Membranen mit einem Paar von Skalpelle Stücke in der Kulturschale steril 10 cm Gewebe fein. Die Verdauung der Membranen und die Gewinnung der Zellen werden mit einem Gewebe-Dissoziation-System erreicht werden. Protokoll des Herstellers zu folgen.
      Hinweis: Je feiner die Stücke des Gewebes nach Wolfen, je höher die Anzahl der Zellen wiederhergestellt nach der Verdauung.
    3. Übertragen Sie der Gewebemasse Hackfleisch / Membran mit dem Skalpellklingen in einem Gewebe Dissoziation Rohr und vermischen Sie sich mit 4,7 mL RPMI 1640 Medium. Die Dissoziation Enzyme (siehe Tabelle of Materials) mischen.
    4. Montieren Sie die Rohre auf die Gewebe Dissociator und führen Sie Programm "h_tumor_01". Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C auf eine rockende Plattform für 30 min.
    5. Weiter verdünnt die Suspensionen mit 35 mL RPMI 1640 und gelten für ein 70 µm-Sieb über einem Zentrifugenröhrchen 50 mL Sammlung gelegt.
    6. Zentrifuge zubereitet für 5 min bei 200 X g bei Raumtemperatur, überstand verwerfen, das Pellet in 5 mL RPMI 1640 Aufschwemmen, zählen die Zellen unter Verwendung einer Hemacytometer und Platte bei einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2 in Gewebekultur-behandelten Gefäße mit frisch AFMC Medium mit Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt.
      Hinweis: Im Falle eines unvollständigen Verdauung, kleine Stücke des Gewebes werden anwesend sein und Einzelzellen werden knapp. Spin-down wieder und die ganze Tablette in einem T75 Kolben Platte.
  3. Kultur der primären AFSC und AMSC
    1. Durchgang Kolonien des AFSC/AMSC durch Absaugen von Vakuum verbrachte mittlere mit einer Pasteurpipette und Zugabe von 2 mL der Zelle Ablösung Enzym in den Kolben. Inkubation bei 37 ° C für 5-8 Minuten.
    2. Tippen Sie auf die Flasche zu helfen, die Zellen zu verdrängen und mischen die Aufhängung mit einem gleichen Volumen des AFMC Mediums (Antibiotikum Antimykotikums Ergänzung sollte nicht von diesem Zeitpunkt an notwendig sein). Zentrifugieren Sie bei 200 g für ca. 4-5 min. Entfernen des Überstands mit entweder einem Glas Pasteurpipette oder einfach durch Umkehrung der Röhre und in einen Abfallbehälter entleert.
    3. Blättern Sie unten die Zentrifugenröhrchen zu brechen das Pellet in einer Einzelzelle Suspension in die restlichen Tropfen Flüssigkeit und mischen Sie mit AFMC Medium für Beschichtung. Platte in T-Flaschen mit einer Dichte zwischen 2.500 und 5.000 Zellen/cm2.
    4. Wechsel-Medium jeden zweiten Tag. Die Zell-Linien über Durchgang 6 nicht Kultur. Umprogrammierung Zwecke, als niedrige verwenden Sie eine Passage wie möglich.
    5. Bereiten Sie gefrorenen Vorräte an AFSC und AMSC als Backups mit eiskalten Medium. Kulturen, die mit einer Zelle Ablösung Enzym, Zentrifuge bei 200 g bei 4 ° C für 5 min zu ernten.
    6. Den Überstand mit einer Pasteurpipette zu entfernen und den Boden des Röhrchens auf die Zellen im Pellet singularisieren flick. Im kompletten Einfrieren Medium bei einer Dichte von 1 × 106/mL und Aliquot in Cryovials aufzuwirbeln. Lagern Sie in einem eiskalten Behälter über Nacht bei-80 ° C. Fahren Sie mit flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung.

2. Reprogrammierung in Pluripotenz

  1. Erhalten Sie die Neuprogrammierung Plasmide
    1. Die Neuprogrammierung Plasmide durch ein Non-Profit-Plasmid-Repository zu kaufen. Ein Material Transfer Agreement ist erforderlich.
    2. Verwandeln Sie die Plasmide in kompetente E. Coli Zellen und isolieren Sie die Plasmide mit einem kommerziellen Plasmid-Extraktion-Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    3. Messen Sie die Konzentration von Plasmid DNA mit einem Spektralphotometer. Ziel für eine hohe Konzentration resultierende Plasmid, idealerweise ca. 1 µg/µL, Verdünnung der Probe während der Transfektion zu vermeiden.
    4. Die Konzentrationen der einzelnen Plasmide unter Verwendung eines UV-Spektralphotometer und aliquoten messen sie individuell.
    5. Mischen Sie 3 µg, 3 µg und 2 µg von EN2K, ET2K und M2L Plasmide, beziehungsweise. Dies ist die Neuprogrammierung Plasmid-Lösung. Die Menge der Plasmid-Lösung reicht, 1 x 106 Zellen zu transfizieren. Mehrere solcher Aliquote vorzubereiten.
    6. Speichern Sie alle Aliquote bei-80 ° C.
  2. Zieltafel Kultur vorbereiten
    1. Ein 6-Well-Platte mit Vitronectin beschichten – fügen Sie 1 mL Vitronectin Verdünnungspuffer in jede Vertiefung und mischen in 40 µL der Stammlösung VTN (1 µg/cm2). Lassen Sie bei Raumtemperatur (RT) oder im Brutschrank bei 37 ° C für 1 h.
    2. Vakuum-Aspirat die Lösung unter Verwendung einer Pasteurpipette und ersetzen durch 2 mL des AFMC Mediums in jede Vertiefung. Speichern Sie bei 37 ° C, bis die Zellen überzogen werden sollen.
      Hinweis: Wichtig: The AFMC Medium verwendet in diesem Schritt sollte keine antibiotischen oder antimykotischen Lösungen enthalten.
  3. Ernte kultiviert primäre AFSC/AMSC
    Hinweis: Vergrößern Sie AFSC/AMSC in Kultur genug machen gefrorenen Vorräte bei einer niedrigen Passagenanzahl und eine T-75 Flasche Umprogrammierung zu widmen. Seit sowenig wie sind 100.000 Zellen ausreichend für ein Experiment, Ziel bei der Ernte rund 500.000 Zellen, um Verluste auszugleichen und wenn Optimierung der Transfektion Parameter oder verschiedenen Kulturbedingungen sollen getestet werden.
    1. Umgehend an einen niedrigen Gang ernten Sie die AFSC/AMSC Zelle Ablösung Enzym-Mix verwenden, wie unter Punkt 1.3.1, 1.3.2 beschrieben. Nachdem die Zellen zentrifugiert haben, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
    2. Das Pellet in 1 mL PBS und gut mischen, Serumkomponenten waschen Aufschwemmen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemacytometer. Passen Sie die Zelldichte bis 100.000/mL PBS und Aliquot in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Dadurch ist nur einen minimalen Kontaktzeit zwischen den Zellen und der Puffer für die Transfektion verwendet.
    3. Den Microcentrifuge Schlauch auf 5 mL Polystyrol Rohre (als Adapter, lässt Zentrifugation in eine normale Schaukel-Rotor) und Zentrifuge bei 200 X g für 4 min bei Raumtemperatur. Invertieren Sie der Rohre und entsorgen Sie den Überstand in einen Abfallbehälter. Verwenden Sie einen Rotor mit festen Winkeln nicht.
    4. Führen Sie eine zusätzliche Zentrifugationsschritt bei 200 X g für 3 min bei Raumtemperatur. Dadurch wird die verbleibende Flüssigkeit aus den Wänden des Rohres an der Unterseite zu sammeln. Abzusaugen Sie sorgfältig alle davon mit einer 200 µL Pipette.
  4. Transfektion mit Umprogrammierung Plasmide
    1. Umprogrammierung Experimente, werden eine Transfektion System (siehe Tabelle der Materialien) zur Neuprogrammierung Plasmide in die Zellen zu liefern. Platzieren Sie Transfektion Tipps, Transfektion Rohre, Wiederfreisetzung Puffer und elektrolytische Puffer in der Gewebekultur Schrank. Die Kit-Reagenzien sind bei RT gehalten bis sie geöffnet werden, dann sie bei 4 ° c gelagert werden
      Hinweis: Wir verwenden die 10 µL-Version des Kit.
    2. Verschieben Sie die Transfektion Gerät zu schließen, so dass die u-Bahnstation direkt in den Schrank gestellt werden kann. Füllen Sie eine Transfektion Röhre mit 3 mL elektrolytische Puffer und montieren Sie den Schlauch in die Station ganz in den Schlitz schieben.
    3. Nehmen Sie die Neuprogrammierung Plasmid Lösung Aliquote in 2.1.5 Rücksprung-80 ° C Lagerung vorbereitet und es ermöglichen Sie ihnen, bei RT in der Kultur Schrank Auftauen.
    4. Wählen Sie auf der Transfektion Gerät folgende Transfektion Parameter: 950 V, 40 ms und 1 Impuls.
    5. Aufzuwirbeln Sie das Pellet mit 100.000 Zellen in 10 µL Wiederfreisetzung Puffer. Arbeiten Sie schnell von diesem Punkt auf seit Wiederfreisetzung Puffer leicht giftig ist und eine erhöhte Belichtungszeit ergibt sich eine deutlich niedrigere Zellviabilität.
    6. Mischen Sie in 1/10 der Neuprogrammierung Plasmid-Lösung (die Lösung aliquoten bereitete für eine Gesamtmenge von 1 x 106 Zellen).
    7. Montieren Sie einen Transfektion Tipp auf die Transfektion Pipette.
    8. Aspirieren Sie die Zellsuspension in die Transfektion Spitze sorgfältig, Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Wenn Bläschen beobachtet werden, die Aussetzung zu vertreiben und die Aspiration wiederholen. Luftblasen werden Transfektion behindern.
    9. Legen Sie die Transfektion Pipette in die Transfektion Röhre und drücken Sie die Schaltfläche "START" auf dem Bildschirm des Geräts Transfektion. Warten Sie, bis der Bildschirm-Meldung über den Erfolg der Transfektion und entfernen Sie die Pipette aus der Tube sofort.
    10. Vertreiben Sie die Aufhängung in 1 auch von der Ziel-6-Well-Platte in Abschnitt 2.2 vorbereitet. Das Medium von einem benachbarten gut mischen Sie und verteilen Sie die Suspension gleichmäßig in beide Vertiefungen (die resultierende Zelldichte werden 50.000/gut).
    11. Wiederholen Sie die Transfektion für alle Mikrozentrifugenröhrchen AFSC/AMSC individuell mit. Legen Sie die Platte in den Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2.
  5. Kultur der transfizierten AFSC/AMSC
    1. Kultur der transfizierten Zellen für 2-5 Tage. Wechseln Sie dann zur Neuprogrammierung Medium bestehend aus E8 ergänzt mit 100 µM von Natrium Butyrate am 3. Tag.
      Hinweis: Zur Vermeidung von Überwucherung der Quelle AFSC/AMSC kann sekundäre Durchgang durchgeführt werden. Allerdings wird die Passagierung deaktivieren Sie die Option für die Neuprogrammierung Effizienz korrekt zu berechnen, wenn dieser Parameter von Interesse ist.
    2. Ändern der Neuprogrammierung Mediums täglich, jeden zweiten Tag für 10 Tage. Wechseln Sie das Medium jeden Tag von Tag 10 auf.
  6. Manuellen Kommissionierung komplett neuprogrammiert Kolonien für klonale expansion
    1. Voll umprogrammierten Kolonien erscheinen um 14. Tag. Kolonien zu erweitern in Größe und kompakter zu ermöglichen. Sie können manuell abgeholt und so früh wie Tag 15-16 auf frische Platten übertragen.
    2. 1 h vor der Kommissioniervorgang Mantel 24-Well-Platten mit 8 µL VTN in 300 µL Vitronectin Verdünnungspuffer pro Bohrloch (1 µg/cm2) und bei RT oder 37 ° c inkubieren Ersetzen Sie die Lösung mit E8 Medium ohne Natrium Butyrat.
    3. Wählen Sie Kolonien eine ausreichende Größe (im Idealfall über 400 µm im Durchmesser) in einer sterilen Kultur Kabinett. Eine Phase-Kontrast-Mikroskop oder einem Stereomikroskop kann verwendet werden.
    4. Für die Kommissionierung, wird ein LCD imaging Mikroskop in den Schrank gelegt verwendet werden, da der Monitor die Notwendigkeit für Okulare eliminiert. Sterilisieren Sie den Mikroskoptisch mit 70 % Ethanol.
    5. Mit einem regelmäßigen Phasenkontrast-Zelle Kultur Mikroskop, auswählen, markieren und notieren Sie die Anzahl der Kolonien abgeholt werden. Dies ist wichtig, um sicherzustellen, dass keine Zeit für diesen Prozess während die eigentliche Kommissionierung verschwendet wird.
    6. Eine Reihe von PCR-Röhrchen, die gleich oder größer als die Anzahl der Kolonien zu kommissionierenden mit 30 µL 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) mit PBS-Puffer zu füllen. Kolonien werden in diese Rohre für partielle Dissoziation vor Beschichtung platziert werden.
    7. Planen, wählen Sie 5 Kolonien zu einem Zeitpunkt von den Platten mit einer 10 µL Pipette legen Sie auf 2 µL. die Pipettenspitze am Rande Kolonie schräg halten und vorsichtig und allmählich die ganze Kolonie von der Oberfläche zu kratzen. Sofort die ganze Kolonie in der Pipettenspitze Aspirieren und in eine der vorbereiteten PCR Röhren mit EDTA übertragen.
    8. Wiederholen Sie mit den restlichen 4 Kolonien. 4-6 min bei RT inkubieren.
    9. Pipettieren der Suspension nach oben und unten sanft mit einem größeren Pipettenspitze zu die Kolonie kleiner Klumpen brechen. Vermeiden Sie eine einzelne Zelle-Suspension.
    10. Platte die Suspension direkt in ein Ziel auch von einer 24-Well-Platte in Schritt 2.6.2 vorbereitet. Wiederholen Sie mit den übrigen Kolonien.
    11. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.6 durch 2.6.10, wenn mehr als 5 Kolonien abgeholt werden, aber nicht mehr als 5 Kolonien zu einem Zeitpunkt abholen. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
  7. Klonalen Expansion und Reifung der iPSC
    1. Kolonien zu wachsen und kompakter zu ermöglichen. 3-6 Tage sind ausreichend. Wechseln Sie täglich das Kulturmedium. 400 µL bis 1 mL der E8 Medium basierend auf die Zelldichte verwenden.
    2. Brunnen von 24-Well-Platte mit einer ausreichenden Dichte Kolonie werden in 6-Well Platten erweitert. 1 h vor Passagierung, bestreichen Sie die 6-Well-Platten mit VTN (wie in Schritt 2.2.1). Ersetzen Sie die Lösung in den Brunnen mit 2 mL E8 Medium pro Bohrloch.
    3. Das abgebrannte Medium aus der Quelle-Brunnen mit einer 1 mL-Pipette abzusaugen und ersetzen mit 300 µL 0,5 mM EDTA zu waschen. Aspirieren Sie sofort mit der gleichen Pipettenspitze und ersetzen mit 300 µL 0,5 mM EDTA wieder, dann bei RT inkubieren Sie für 5 min. aspirieren Sie alle Flüssigkeit, die mit einer 1-mL-Pipette.
    4. Set 1-mL-Pipette, Kapazität, einen 1 mL weite Bohrung Tipp drauf montieren und aspirieren E8 Medium aus dem Ziel weit in die Spitze. Die Source-iPSC-Kultur mit einem Strom des Mediums abwaschen.
    5. Übertragen Sie die Aussetzung in das Ziel gut und Pipettieren nach oben und unten mehrmals Kolonien in Klumpen von 20-50 Zellen aufzubrechen. Stellen Sie sicher, sie bekommen in den Brunnen durch sanftes Schaukeln und schütteln die Platte gleichmäßig verteilt und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
    6. Änderung des Mediums täglich und Stelle alle 3 bis 4 Tage. Jede Differenzierung Kolonien können unter dem Phasenkontrast-Mikroskop markiert und mit einer Pipettenspitze in der Kultur Schrank entfernt. Dies ermöglicht eine selektive Vermehrung von qualitativ hochwertigen reinen iPSC-Kultur.
    7. 1 h vor Passagierung, Mantel der Brunnen von einem 6-Well-Platte mit VTN wie in Schritt 2.2.1. Ersetzen Sie die Lösung mit 2 ml E8 Medium pro Bohrloch.
    8. Routinemäßige Passagierung ist ähnlich der ersten Passagierung getan mit 0,5 mM EDTA (Schritte 2.7.2, 2.7.5). Ersetzen Sie verbrauchte Mittel in einen Brunnen von einem 6-Well-Platte mit 1 mL EDTA zu waschen und zu verwerfen.
    9. Fügen Sie 1 mL EDTA und 5-7 min für partielle Dissoziation bei RT inkubieren. Die Inkubationszeit zu optimieren wenn notwendig, sicherzustellen, dass eine Aussetzung der rund 20-50 Zellen Klumpen entsteht. Dissoziation in einzelnen Zellen zu vermeiden.
    10. Die EDTA-Lösung zu verwerfen und 1 mL des Mediums E8 mit einer 1-mL-Pipette aus dem Ziel gut in eine weite Bohrung Pipettenspitze Aspirieren.
    11. Abwaschen der Source-iPSC-Kultur mit einem Strom des Mediums E8 wiederholt, bis eine gewünschte Portion von der Oberfläche erschien und gut in das Ziel zu übertragen. Dieser Teil steht für das Split-Verhältnis (z.B., 1/8 der Kultur kann übertragen werden für ein Verhältnis von 1:8.)
    12. Durchgang alle 3-4 Tage. IPSC Linien Reifen durch Kultivierung sie für mindestens 15 Passagen vor der Verwendung in nachgeschalteten Experimente zu ermöglichen

3. Charakterisierung und Bestätigung der Pluripotenz

Hinweis: Beziehen sich auf die zusätzlichen Dateien für Details auf Durchflusszytometrie und konfokalen Mikroskopie.

  1. Teratom Bildung assay
    1. Um die Kapazität der iPSC durch Teratom Bildung Assay in Geweben, die repräsentativ für alle drei Mikrobeschichten unterscheiden zu bestimmen, folgen Sie die institutionellen Richtlinien für Tierpflege und Nutzung, Vorausplanung, damit Zeit für die Einreichung des entsprechenden Protokolls Dokumente. Die Teratom Bildung bei Mäusen dauert zwischen 6 bis 10 Wochen.
    2. Kultur 4 Brunnen von einer 6-Well-Platte pro iPSC-Linie für 4 Tage. Die ungefähre Anzahl der Zellen in einer Flanke einer Maus injiziert ist 0,5 bis 1 x 106 Zellen. Optional: Aufpreis kann auch gewidmet werden Bestimmung einer Anzahl von repräsentativen Zellen in einem gut durch einzelne Zelle Dissoziation mit einer Zelle Ablösung Enzym und zählen.
    3. Berechnen Sie das Volumen der E8/BMM Mischung der iPSC-Klumpen in ausgesetzt werden: beide Flanken einer Maus injiziert werden, jeweils mit 150 µL Büschel Suspension. Drei Mäuse sind ausreichend, um Teratom Bildung von iPSC zeilenweise testen. Schließen Sie eine zusätzliche 150 µL pro Nadel in die resultierende Lautstärke zum Ausgleich Totvolumen. 1 Nadel pro Maus dient. Das Gesamtvolumen beträgt also 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
    4. Distanzieren Sie die iPSC-Kolonien mit EDTA teilweise als wären sie zu passagiert werden, wie in den Schritten 2.7.8, 2.7.10 beschrieben. Es ist wichtig, dass die Kolonien werden in Klumpen getrennt und nicht in einzelne Zellen aufgeteilt.
    5. Verlauf der iPSC-Kolonien mit 675 µL E8 Medium (die Hälfte des berechneten ab Schritt 3.3.3), verwenden einen Wide-Bohrung-Tipp. Übertragen Sie die Büschel Suspension in einer 5 mL Polystyrol Rohr. Auf Eis legen.
    6. Kombinieren Sie mit 675 µL BMM. Halten Sie die entstandene Suspension auf Eis, bis die Injektion.
    7. Die Mäuse um sie zu immobilisieren zu betäuben mit Isofluran. Dies sollte durchgeführt oder geleitet von Fachkräften des Vivariums.
    8. Vortex 5 mL Polystyrol Rohr kurz und aspirieren die Büschel-Suspension (450 µL pro Maus) in einer Insulin-Spritze mit einer 22 G Nadel ausgestattet. 150 µL Zellsuspension subkutan zu injizieren. Dieser Band enthält ca. 1 x 106 Zellen (siehe Punkt 3.1.2).
    9. 3 Mäuse pro iPSC Zeile zu injizieren. Folgen Sie richtige Tierpflege Praxis für alle Verfahren.
    10. Der Zustand der Mäuse täglich überwacht.
    11. Wenn die darum einen Endpunkt von 1,5 bis 2 cm Durchmesser erreichen, einschläfern die Mäuse, explant der darum, und speichern sie in Formalin-Lösung für Gewebe Fixierung für 24 h.
    12. Eine Histologie zentrale Einrichtung für Hämatoxylin Eosin (H & E) Färbung bringen Sie der festen darum. Ein Pathologe wird das Vorhandensein von Geweben aller drei Mikrobeschichten benoten.
      Hinweis für Karyotyping: Live iPSC Kulturen zu versendet werden sollten spezialisierte zytogenetischen Labors zur Prüfung der Integrität der Karyotyp. Es wird empfohlen, dass diese Tests durchgeführt werden, alle 5 Gänge.
  2. Transkriptionelle Profilierung
    1. Kultur 2 Brunnen von einer 6-Well-Platte für 3-4 Tage eine RNA-Probe zu erhalten. Verwenden Sie nur qualitativ hochwertige Kulturen, geringfügige Verunreinigungen mit Differenzierung der Zellen durch Schaben sie mit einer Spitze Pipettieren angesprochen werden kann.
    2. Isolieren Sie RNA aus iPSC-Kulturen mit einem kommerziell erhältlichen Kit nach der Hersteller-Protokolls. Proben zu einer spezialisierten genomische Kern-Anlage zu versenden.
    3. Erhalten Sie die globale transcriptional Profile der iPSC Linien mittels Microarrays (siehe Tabelle der Materialien für die unterstützten Optionen) oder RNA Sequenzierung.
    4. "*.Idat" Dateien für bioinformatische Beurteilung der Pluripotenz durch eine Online-Schnittstelle am Coriell Institut einreichen. Alternativ senden "* .cel" Dateien für bioinformatische Identifikation des Zelltyps, einschließlich pluripotente Stammzellen durch eine Online-Schnittstelle an der Johns Hopkins University. Weitere Informationen über die Arten von Daten, die die einzelnen Bioinformatic Assays akzeptieren Tabelle der Materialien .

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Ergebnisse

Informierter Zustimmung wurde von Patienten erhalten vor der Ernte Fruchtwasser für genetische Testzwecke und eine kleine aliquoten des Fluids für die Forschung zu widmen. Ohne Zustimmung ist erforderlich für die Nutzung der amniotic Membrane in der Forschung, da die Plazenta medizinischen Abfälle darstellt. Amniotische Flüssigkeit und Membran Stammzellen typische mesenchymalen Anzeigeeigenschaften, morphologisch ihre Zellen sind spindelförmig und Phase-hell. Bei der Umprogrammierung, die...

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Diskussion

Die erste Phase der iPSC-Generation von fetalen Stammzellen beinhaltet die Gewinnung von die Quellzellen aus fetaler Gewebe, ihre Kultur, Ausbau und Einführung von episomal Neuprogrammierung Plasmide. Dieser Phase folgt eine Kulturdauer von ca. 14-18 Tage, bevor die ersten voll umprogrammierten Kolonien erweitert werden können. Die Abschlussphase ist Reifung der iPSC-Klone. Die ersten Gewinnung von Stammzellen amniotischen Membran wird mittels einer kombinierten mechanische und enzymatische Verdauung von der Amnion errei...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den Fonds Medizinische Forschung an der UZH Forschungskredit der Universität Zürich, The SCIEX NMSCh unter Stipendien 10.216 und 12.176, der Schweizerischen Gesellschaft für Kardiologie, The Swiss National Science unterstützt. Stiftung unter Grant [320030-122273] und [310030-143992], das 7. Rahmenprogramm, Leben Ventil, Europäische Kommission unter Grant [242008], die Olga Mayenfisch Stiftung, die EMDO Stiftung, Gründungshilfe 2012 von der Universitätsklinik Zürich, und interne Finanzierung des Mitchell Cancer Institute.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tumor-Dissoziations-Kit, menschlichesMiltenyi Biotec130-095-929Gewebe-Dissoziationssystem, Reagenz-Kit, enthält Gewebe-Dissoziationsröhrchen und Gewebe-Dissoziationsenzyme
gentleMACS DissoziatorMiltenyi Biotec130-093-235Gewebe-Dissoziationssystem, Dissoziator
Thermo Scientific & trade; Shandon & Handel; Einweg-Skalpell Nr. 10, steril, einzeln verpackt, 5,75 (14,6cm)Thermo-Fisher3120032
70 µ m ZellsiebeCorning10054-456
RPMI 1640 mittelThermo-Fisher32404014 
WippplattformVWR40000-300
50 ml ZentrifugenröhrchenThermo-Fisher339652
15 ml ZentrifugenröhrchenThermo-Fisher339650
EBM-2 BasalmediumLonzaCC-3156Basalmedium für AFMC Medium
FGF 2 Human (exprimiert in E. coli, nicht glykosyliert)Prospec BioCYT-218bFGF, Ergänzung für AFMC medium
EGF Human, PichiaProspec BioCYT-332 EGF, Zuschlag für AFMC-Mittel
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human RecombinantProspec BioCYT-022IGF, Ergänzung für AFMC Medium
Fetales Rinderserum, embryonale Stammzellen qualifiziertThermo-Fisher10439024FBS
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)Thermo-Fisher15240062 für primäre AFSC/AMSC, für routinemäßige AFSC/AMSC sollte es nicht notwendig sein, nicht im Medium für transfizierte Zellen verwenden!
Accutase Lösung zur ZellablösungStemCell Technologies07920Enzym zur Zellablösung
CryoStor CS10StemCell Technologies07930vollständiges Gefriermedium
PBS, pH 7,4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362zur Plasmidisolierung
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, Reprogrammierungsfaktoren Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, Reprogrammierungsfaktoren Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, Reprogrammierungsfaktoren c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis SpektralphotometerThermo-FisherND-2000CSpektralphotometer
Neon® TransfektionssystemThermo-FisherMPK5000Transfektionssystem, Komponenten:
Neon Pipette - Transfektionspipette
Neon Gerät - Transfektionsgerät
Neon® Transfektionssystem 10 &Mikro; L KitThermo-FisherMPK1025Verbrauchsmaterial-Kit für das Neon Transfection System, es enthält:
Neon Spitze - Transfektionsspitze
Neon Tube - Transfektionstube
Puffer R - Resuspensionspuffer
Puffer E - elektrolytischer Puffer
Stemolecule™ NatriumbutyratStemGent04-0005niedermolekularer Verstärker der Reprogrammierung
TeSR-E8StemCell Technologies05940E8 Medium
Vitronectin XF™StemCell Technologies07180VTN, Lagerkonzentration 250 & Mikro; g/ml, wird für die Beschichtung bei 1 & Mikro verwendet; g/cm2 in vitronektin Verdünnung (CellAdhere)
Puffer CellAdhere™ VerdünnungspufferStemCell Technologies07183Vitronektin-Verdünnungspuffer
UltraPure™ 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020vor Gebrauch mit PBS auf 0,5 mM verdünnen
EVOS® FL Imaging SystemThermo-Fisher ScientificAMF4300LCD Imaging Mikroskop System
CKX53 Inverses MikroskopOlympusPhasenkontrast-Zellkulturmikroskop
Pierce™ 16% Formaldehyd (w/v), MethanolfreiThermo-Fisher28908Gebrauch mit PBS auf 4% verdünnen, verdünnt bei 2-8 &de; C für 1 Woche
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050Permeabilisierungspuffer, kalt auf -20 ° C vor der Verwendung
von Maus IgG1, κ Isotyp-Steuerung, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782Isotypkontrolle für Oct3/4A, Nanog-Maus
IgG1 und kappa; Isotyp-Steuerung, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783Isotypkontrolle für Sox2
Maus anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Maus anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Maus anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
Maus IgGM, κ Isotyp-Steuerung, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617Isotypkontrolle für TRA-1-60
Maus IgGM, κ Isotyp-Steuerung, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618Isotypkontrolle für TRA-1-81
Maus anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Maus anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Maus IgG1, κ Isotyp-Steuerung, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129Isotypkontrolle für SSEA-1
Maus IgG3, κ Isotyp-Steuerung, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321Isotypkontrolle für SSEA-4
Maus Anti-Mensch SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
Maus Anti-Mensch SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Maus IgG+IgM, Alexa Fluor® 488Jackson Immunoresearch115-606-068Verwendung in einer Verdünnung von 1:600 oder weitere Optimierung
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-068Verwendung in einer Verdünnung von 1:600 oder weitere Optimierung
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490Stammlösung 10 mM, weitere Verdünnung auf 1:12.000 für eine Arbeitslösung
Corning® Matrigel® Wachstumsfaktor-reduzierte, phenolrotfreieCorning356231Basalmembranmatrix (BMM)
scid-beige Mäuse, weiblichTaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)Qiagen74134RNA-Isolationskit
T-25-Kolben, mit Gewebekulturen behandelteThermo-Fisher156367
T-75-Kolben, mit Gewebekulturen behandelteThermo-Fisher
Nunc™ GewebekulturschaleThermo-Fisher12-567-650 10 cm Gewebekulturschale
6-Well-Platten, gewebekulturbehandeltThermo-Fisher140675
Neubauer Zählkammer (Hämazytometer)VWR15170-173
Mr. Frosty™ GefrierbehälterThermo-Fisher5100-0001 Behälter zum Gefrieren
FACS-Röhrchen, Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, 5 mlCorning3520585 ml Polystyrolröhrchen
Eppendorf Röhrchen, 1,5 mlThermo-Fisher05-402-961,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen
PCR-Röhrchen, 200 & Mikro; lThermo-Fisher14-222-262
Pipettenspitzen, 100 bis 1250 & Mikro; lThermo-Fisher02-707-4071-ml-Spitzen mit schmaler Bohrung
, Pipettenspitzen, 5 bis 300 & micro; lThermo-Fisher02-707-410
Pipettenspitzen, 0,1 bis 10 & Mikro; lThermo-Fisher02-707-437
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung, 1000 & micro; lVWR89049-166mit breiter Bohrung und 1 mL Spitzen
PasteurpipettenThermo-Fisher13-678-20A
Ethanol, 200 proofThermo-Fisher04-355-451
WirbelmischerVWR10153-842
Kammer-Deckglas, 8 Brunnen, 1,5 mm BorosilikatglasThermo-Fisher155409Konkonokal-Kulturgefäß mit Glasboden
22G NadelnVWR82002-366
InsulinspritzenThermo-Fisher22-253-260
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%Sigma-AldrichHT501128-4LFixierung von explantierten Teratomen
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204Expression Microarray, unterstützt durch PluriTest, vom Hersteller eingestellt
PrimeView Human Genome U219 Array PlateThermo-Fisher901605Expressions-Microarray (ehemals Affymetrix-Marke), wird demnächst von PluriTest
GeneChip unterstützt. Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482-Expressions-Microarray (ehemals Affymetrix-Marke), unterstützt von CellNet, wird demnächst von PluriTest unterstützt
PluriTest®Coriell Institutewww.pluritest.org, kostenloser Service für die bioinformatische Bewertung der Pluripotenz, akzeptiert Microarray-Daten - *.idat-Dateien von der HT-12 v4-Plattform, unterstützt bald U133-, U219-Microarray- und RNA-Sequenzierungsdaten
CellNetJohns Hopkins Universitycellnet.hms.harvard.edu, kostenloser Service für die bioinformatische Identifizierung von Zelltypen, einschließlich plutipotenter Stammzellen, basierend auf U133-Microarray-Daten - *.cel-Dateien, wird bald RNA unterstützen Sequenzierungsdaten
vor - 156499 Glas

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