Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von automatischen bildgeführten Patch-Clamp-Experimenten mit einem System, das kürzlich für Standard- In-vitro- Elektrophysiologie-Geräte entwickelt wurde.

Abstract

Voll-Zell-Patch-Clamp ist die Gold-Standard-Methode, um die elektrischen Eigenschaften von einzelnen Zellen zu messen. Allerdings bleibt die In-vitro- Patch-Clamp aufgrund ihrer Komplexität und ihrer hohen Abhängigkeit von Benutzerbetrieb und -steuerung eine anspruchsvolle und leistungsstarke Technik. Dieses Manuskript zeigt ein bildgeführtes automatisches Patch-Clamp-System für in-vitro- Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente in akuten Hirnschnitten. Unser System implementiert einen computervisionsbasierten Algorithmus, um fluoreszenzmarkierte Zellen zu detektieren und sie zum vollautomatischen Patching mit einem Mikromanipulator und einer internen Pipettendruckkontrolle zu zielen. Der gesamte Prozess ist hoch automatisiert, mit minimalen Anforderungen für menschliches Eingreifen. Echtzeit-experimentelle Informationen, einschließlich elektrischer Widerstand und interner Pipettendruck, werden elektronisch für die zukünftige Analyse und für die Optimierung auf verschiedene Zelltypen dokumentiert. Obwohl unser System im Kontext der akuten brai beschrieben wirdN Slice-Aufnahmen kann es auch auf die automatisierte bildgeführte Patch-Clamp von dissoziierten Neuronen, organotypischen Slice-Kulturen und anderen nicht-neuronalen Zelltypen angewendet werden.

Introduction

Die Patch - Clamp - Technik wurde zuerst von Neher und Sakmann in den 1970er Jahren entwickelt , um die Ionenkanäle von erregbaren Membranen ¹ zu studieren. Seitdem wurde die Patch-Clamping auf die Untersuchung vieler verschiedener Subjekte auf zellulärer, synaptischer und Circuit-Ebene angewendet - sowohl in vitro als auch in vivo - in vielen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Kardiomyozyten, Xenopus-Oozyten und künstlichen Liposomen ² . Dieser Prozess beinhaltet die korrekte Identifizierung und Ausrichtung einer Zelle von Interesse, komplizierte Mikromanipulator-Steuerung, um die Patch....

Protocol

1. Systemeinrichtung

1. Konstruktionsdruckgerät ausbauen.
   1. Montieren Sie das Druckregelgerät gemäß Schaltplan ( Abbildung 1 ). Löten Sie die notwendigen Teile auf die Leiterplatte (Leiterplatte), die nach den Schaltplänen der elektrischen Schaltungen hergestellt wurde ( Abbildung 1b ). Verwenden Sie Standardwiderstände, LEDs, Metall-Oxide Semiconductor Feld-Eeffect Transistoren (MOSFETs), Kondensatoren und Steckverbinder (siehe Tabelle der Materialien ). Lötmagnetventile auf die Leiterplatte auftragen. Verbinden Sie die Luftpumpe und den Luftdrucksensor mit der elektrischen L....

Results

Unser System wurde auf seine Fähigkeit getestet, Zellen in akuten Hirnschnitten, Maus induzierten Pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert in Neuronen, und HEK 293 Zellen künstlich ausdrücken Kanäle von Interesse. Abbildung 3 zeigt ein Experiment mit Thy1-ChR2-YFP-transgenen Mäusen (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), die auf fluoreszenzmarkierte Schicht-5-Pyramiden-Neuronen im visuellen Kortex zielen. Die Zielzelle war eine der automatisch ident.......

Discussion

Hier beschreiben wir eine Methode für automatische bildgeführte Patch-Clamp-Aufnahmen in vitro . Die wichtigsten Schritte in diesem Prozess sind wie folgt zusammengefasst. Zuerst wird Computer Vision verwendet, um die Pipettenspitze automatisch mit einer Reihe von Bildern zu erkennen, die über ein Mikroskop aufgenommen wurden. Diese Information wird dann verwendet, um die Koordinatentransformationsfunktion zwischen dem Mikroskop und den Manipulator-Koordinatensystemen zu berechnen. Computer Vision wird verwende.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD-Kamera	QImaging	Rolera Bolt
Elektrophysiologie-Rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Inklusive Mikroskop und Manipulatoren. Die vom Hersteller zur Verfügung gestellte Software zur Steuerung des Manipulators, die in diesem Manuskript demonstriert wird, ist " Linlab2".
Verstärker	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computergesteuerter Mikroelektrodenverstärker
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED-Lichtquelle	Cool LED	pE-100	Wellenlänge 488 nm
Datenerfassungskarte	Measurement Computing	USB1208-FS	Sekundäre Datenerfassung. Siehe Handbuch unter : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Magnetventile	The Lee Co.
Luftpumpe	Virtuelle Industrie	VMP1625MX-12-90-CH
Luftdrucksensor	Freescale Semiconductor	MPXV7025G
Slice Niederhalter	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, flach für RC-40 Kammer, 2,0 mm, 19,7 mm
Python	Anaconda	Version 2.7 (32-Bit für Windows)	https://www.continuum.io/downloads
Schraubklemmen	Sparkfun	PRT - 08084	Schraubklemmen 3,5 mm Raster (2-polig)
(2-polig)
N-Kanal MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Steckdosen Lötfahne - 8-polig	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Rot 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Grün	5mm Sparkfun	COM-09592
DC Hohlstecker/Steckverbinder (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wandadapter Netzteil - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Anschlusskabel - Sortiment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Verriegelung Stecker x Buchse x Buchse Absperrhahn	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Schläuche	Fisher scientific	14-171-129	Außendurchmesser: 1/8 Zoll Innendurchmesser: 1/16 Zoll
BNC-Stecker auf BNC-Stecker Koaxialkabel	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Widerstand (5% Toleranz)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II