Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Filtrations-basiertes Protokoll, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Mäuseskelettmuskeln zu isolieren, wobei wir die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation entfernt haben, wodurch es leicht anwendbar ist. Wir zeigen, dass das aus den Kernen hergestellte Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation und wahrscheinlich Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsstudien geeignet ist.

Zusammenfassung

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinbindung an Chromatin-DNA. Faserreicher Skelettmuskel war jedoch eine Herausforderung für ChIP aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Isolierung von hochwertigen Kernen mit minimaler Kontamination von Myofibrillen. Bisherige Protokolle haben versucht, Kerne vor der Vernetzung zu reinigen, was das Risiko einer veränderten DNA-Protein-Wechselwirkung während des verlängerten Keimpräparationsverfahrens verursacht. In dem aktuellen Protokoll haben wir zuerst das Skelettmuskelgewebe, das von Mäusen gesammelt wurde, vernetzt und die Gewebe wurden gehackt und beschallt. Da wir festgestellt haben, dass die Ultrazentrifugation nicht in der Lage war, Kerne von Myofibrillen unter Verwendung von vernetzten Muskelgeweben zu trennen, entwickelten wir ein sequentielles Filtrationsverfahren, um qualitativ hochwertige Kerne ohne signifikante Myofibrillenverunreinigung zu erhalten. Anschließend wurden Chromatin unter Verwendung eines Ultraschallgerätes hergestellt und ChIP-Assays mit anti-BMAL1-Antikörper zeigten eine robuste zirkadiane BindungMuster von BMAL1 zu Zielgen-Promotoren. Dieses Filtrationsprotokoll stellt eine leicht anwendbare Methode dar, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Skelettmuskelgeweben zu isolieren, was eine konsistente Probenverarbeitung für zirkadiane und andere zeitempfindliche Studien ermöglicht. In Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann unsere Methode für verschiedene mechanistische und genomische Studien eingesetzt werden, die sich auf die Skelettmuskelfunktion konzentrieren.

Einleitung

Skelettmuskel spielt eine wichtige Rolle in Physiologie und Verhalten. Die mehrkernige Muskelfaser besteht aus Myofibrillen, in denen Aktin und Myosin funktionale Einheiten bilden, die Sarkomere genannt werden, um kontraktile Kraft zu erzeugen. Skelettmuskel ist auch das größte Stoffwechselorgan im Körper, das für> 80% postprandiale Glukoseaufnahme und regulierende Insulinreaktion und metabolische Homöostase ^{1 , 2 verantwortlich ist} . Die Muskelphysiologie und der Stoffwechsel werden durch die zirkadiane Uhr, einen intrinsischen biologischen Timer ^{3 , 4 , 5 , 6,} genau reguliert. Zum Beispiel führte die Skelettmuskelspezifische Deletion von Bmal1 , einer der Kern-zirkadianen Taktkomponenten , zu einer Insulinresistenz und einer verminderten Glukoseaufnahme im Skelettmuskel, und die Tiere wurden gefunden, um Typ-2-Diabetes ^{7 zu entwickeln} . ichNeben der Skelettmuskulatur wird auch zunehmend ein endokrines Organ ⁸ geschätzt, das Myokine sekretiert, um den systemischen Stoffwechsel und die Physiologie zu regulieren. Mechanistische Studien sind erforderlich, um diese regulatorischen Funktionen im Skelettmuskel vollständig zu verstehen.

ChIP ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Abgrenzung der Promotorrekrutierung von DNA-bindenden Proteinen. ChIP wurde ursprünglich entwickelt, um die Nukleosomenorganisation auf Chromatin-DNA ^{9 , 10} zu identifizieren. Es wurde bisher eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung von Proteinen und Chromatin-DNA unter Verwendung von Formaldehyd, Dimethylsulfat oder Ultraviolettbestrahlung (UV) ^{11 , 12 beschrieben} . Die Formaldehyd-Vernetzung ist die am häufigsten verwendete, konservierende Chromatinstruktur und DNA-Protein-Wechselwirkungen ^{9 , 13 , 14} . Vernetztes ChromatIn wird durch Beschallung zerkleinert und mit Antikörper gegen das jeweilige DNA-bindende Protein von Interesse ^{15 , 16} immunpräzipitiert. In den letzten Jahren wurde die ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq), eine Methode, die ChIP mit NGS kombiniert, entwickelt, um die genomweite Transkriptionsfaktorbindung ^{17 zu untersuchen} und in einigen Fällen die dynamischen Veränderungen über einen Zeitverlauf ^{18 , 19 , 20} zu überwachen . Zum Beispiel haben zirkadiane ChIP-seq-Studien eine hochorchestrierte Sequenz der genomischen Bindung von zirkadianen Taktkomponenten und Histonmarkern, die eine zeitlich präzise Genexpression während des gesamten 24h-zirkadischen Zyklus ¹⁸ antreibt.

Die meisten verfügbaren ChIP-Protokolle sind für Weichgewebe ( zB Leber, Gehirn, etc. ) konzipiert, und nur sehr wenige wurden für harte Gewebe einschließlich Skele veröffentlichtTal muskel Es ist technisch anspruchsvoll, den faserreichen Skelettmuskel zu homogenisieren und die hochwertigen Kerne ^{21 zu} isolieren, insbesondere für ChIP-Experimente, die eine Vernetzung erfordern. In einer neueren Muskel-ChIP-Studie ²² wurden Satelliten-Zellen von Myofasern getrennt, und die Kerne wurden aus beiden Zelltypen durch ein verlängertes Verfahren mit Gewebeverdauung hergestellt. Der gesamte Prozeß dauerte etwa drei Stunden, bis die Formaldehyd-Vernetzung an isolierten Kernen durchgeführt wurde. Während dieses Verfahren eine vernetzte Muskelfaser vermeidet, die das Muskelgewebe für eine effiziente Homogenisierung noch widerstandsfähiger macht und in der Lage war, qualitativ hochwertige Kerne herzustellen, entsteht die signifikante Zeitverzögerung von der Gewebsansammlung zur Keimvernetzung das Risiko einer veränderten DNA -protein-interaktion Im Gegensatz dazu führten die meisten Studien eine Vernetzung unmittelbar nach der experimentellen Behandlung oder Gewebesammlung durch, um das Echtzeit-DNA-Protei zu erhaltenN Bindung ¹² Ein zweiter Nachteil der Kerneisolation vor der Vernetzung besteht darin, dass sie zeitempfindliche Anwendungen wie zirkadiane Probensammlungen ausschließt, die typischerweise in Intervallen von 3 - 4 h auftreten. Ohne Vernetzung der Kerne muss die Isolierung unmittelbar nach der Sezierung erfolgen, während vernetzte Proben nach Beendigung des gesamten Zeitverlaufs zusammen verarbeitet werden können, so dass eine größere experimentelle Konsistenz gewährleistet ist.

Andere Protokolle für die Kernenisolation aus dem unvernetzten Skelettmuskel wurden ebenfalls berichtet. Zwei Studien beschreiben die Verwendung von Gradienten-Ultrazentrifugation, um Kerne von verbleibenden Myofibrillen und Zelltrümmern ^{23 , 24} zu trennen. Während die Saccharose- oder Kolloidgradienten-Ultrazentrifugation mit unvernetzten Muskelgeweben wirksam ist, zeigten unsere Experimente, dass nach der Vernetzung die Gradienten-Ultrazentrifugation die Kerne nicht von der Zelle d trennteEbris auf dem gradienten

Wir haben daher ein Verfahren entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne unter Verwendung von vernetzten Maus-Skelettmuskelgeweben zu isolieren. Statt der Gradienten-Ultrazentrifugation haben wir eine serielle Filtrationsmethode entwickelt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Chromatinproben erfolgreich für ChIP-Studien angewendet, die ein zirkadianes Muster der BMAL1-Proteinbindung an Ziel-Promotoren zeigten. Unsere Methode kann breit auf verschiedene mechanistische Studien von Muskelgeweben anwendbar sein.

Protokoll

Die Tierpflege wurde unter den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt und die Verfahren wurden nach einem Tierprotokoll durchgeführt, das von der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt wurde.

1. Kernisolierung aus vernetzten Skelettmuskeln

1. Wiegen und Hackfleisch-Skelettmuskel, isoliert von etwa 20 Wochen alten C57BL / 6 männlichen Mäusen, in eiskalter Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), wie im Detail zuvor beschrieben.
   HINWEIS: Wir erhalten in der Regel 1,0 - 1,5 g Skelettmuskel von einer Maus.
   1. Legen Sie gehacktes Skelettmuskelgewebe in ein 50-ml-konisches Röhrchen mit 10 ml PBS auf Eis ein.
2. Zentrifugieren bei 300 xg bei 4 ° C für 5 min.
3. Den PBS-Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernen.
4. Schätzung des Pelletvolumens in jedem 50-ml-Röhrchen unter Verwendung von Referenzrohren mit 1, 2, 3 und 4 ml Wasser.
5. 7 Bände hinzufügenEiskaltes 1% Formaldehyd in PBS und homogenisieren die Proben auf Eis unter Verwendung eines Sondengewebehomogenisators (siehe Tabelle der Materialien ).
   HINWEIS: Optional: Die Homogenisierung kann in einem kalten Raum durchgeführt werden.
6. Vernetzen Sie die Probe durch Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
7. Die Vernetzungsreaktion durch Zugabe von 1 M Glycin auf eine Endkonzentration von 0,125 m müngen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Die Proben bei 3.000 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand über Aspiration entfernen.
9. Spülen mit 10 ml eiskaltem Basenpuffer (10 mM HEPES-KOH bei pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl ₂ , 0,5 mM DTT) mit frisch zugesetzten Protease-Inhibitoren (0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) , Und 10 & mgr; g / ml Leupeptin). Bei 3000 g 5 min bei 4 ° C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig durch Absaugen entfernen.
10. Das Pellet wird in 6 ml Lysepuffer (10 mM HEPES-KOH bei pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl ₂ , 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) mit frisch zugesetzten Protease-Inhibitoren (0,2 mM PMSF und 10 μg / mL Leupeptin).
11. Übertragen Sie die Probe auf einen vorgekühlten 15 ml Dounce-Homogenisator und inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Bevorzugt homogenisieren Sie jede Probe auf Eis mit 15 langsamen Schlägen mit einer losen Stößel gefolgt von 15 Schlägen mit engen Stößel, um die Kerne freizugeben.
12. Filtriere das Homogenat (6 ml) durch Zellsieb (Porengröße: 100 μm) und spüle mit 4 ml Lysepuffer. Die Proben bei 1000 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren. In 5 ml eiskaltes Basispuffer resuspendieren und 10 mal mit einer engen Pistille abgeben, um Kerne freizusetzen.
    1. Entfernen Sie ein Aliquot von 20 μl für die DNA-Konzentrationsmessung mit einem Spektrophotometer (OD260 / OD280) und mikroskopische Beobachtung mit Trypanblau, wenn nötig (siehe unten) ( Abbildung 1 A ).
13. Filtriere die Suspension durchEin Zellsieb (Porengröße: 70 μm), spülen Sie das Röhrchen und filtrieren Sie erneut mit 2 mL Basispuffer wie oben.
14. Wiederholen Sie die Filtration wie in Schritt 1.13 mit Zellsegmenten mit allmählich reduzierter Porengröße (40 μm, 30 μm, 20 μm und 10 μm).
    HINWEIS: Insgesamt wurden in den Schritten 1.12-1.14 Siebe mit 6 Porengrößen verwendet.
15. Bei 1000 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren Den Überstand entfernen und das Pellet in 500 μl Basispuffer resuspendieren.
16. Messen Sie die DNA-Konzentration wie oben.
    ANMERKUNG: Etwa 200 μg nukleäre DNA wurden aus der Kombination von beiden Hinterbeinen von einem Tier erhalten. Gegebenenfalls 20 μl für die mikroskopische Beobachtung mit Trypan-Blau-Färbung (Stammkonzentration 0,4%, 1: 5 Verdünnung); Die Kerne werden blau gefärbt ( Abbildung 1 B ).
17. Bei 1000 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Pellets bei -80 ° C aufbewahren.

2. Sonikation

1. Tauproben in 500 μl SDS-Lysepuffer auffüllen und unter leichtem Pipettieren resuspendieren.
2. Übertragen Sie die Kerne-DNA-Suspension auf eine Glasampulle auf Eis.
3. Führen Sie die Beschallung mit fokussierten Bursts von Ultraschall-Schallenergie von einem schalenförmigen Wandler aus. Siehe Materialliste für Ausstattungsdetails. Verwenden Sie folgende Einstellung: Zyklen pro Burst: 200; Intensität: 5; Arbeitszyklus: 20; Temperatur 4 - 6 ° C; 30 s ein / aus.
   HINWEIS: Ein Beispiel für die Bewertung der Ultraschall-Wirksamkeit ist in Abbildung 2 dargestellt .
4. Übertragen Sie das beschallte Chromatin auf ein 1,5 mL Röhrchen. Bei 12.000 xg für 15 min zentrifugieren und den Überstand in ein neues Röhrchen überführen. Übertragen Sie 50 μl beschallte Proben (~ 7 - 10 μg / Muskelprobe) in ein neues 1,5 mL Röhrchen für die umgekehrte Vernetzung über Nacht bei 65 ° C. Die restlichen Proben bei -80 ° C einfrieren.

3. Bewertung der Sonde und Quantifizierung

1. Add 1.0Μl RNase A (500 U / mL RNase A: 20.000 U / ml RNase T1) zu den eingesparten 50 μl beschallten Proben und inkubieren für 30 min bei 37 ° C.
2. Man gibt 8 μl Protease K (10 mg / ml) zu und inkubiert 30 min bei 55 ° C.
3. Ernte die DNA unter Verwendung eines DNA Extraktionskits.
   1. Füge 5 Volumen Bindepuffer hinzu, wende sie auf Spinsäule auf und zentrifugiere bei 4.000 xg, 10 min.
   2. Tragen Sie den Durchgang auf die gleiche Säule und zentrifugieren Sie wieder.
   3. Waschen mit Waschpuffer zweimal bei 13.000 xg, 1 min.
   4. Zentrifugieren Sie erneut bei 13.000 xg, 1 min, um die Säule zu trocknen.
   5. 50 μl H ₂ O zugeben und bei 13.000 xg, 1 min zentrifugieren, um DNA zu eluieren.
   6. Tragen Sie den Durchgang auf die gleiche Säule und zentrifugieren Sie wieder.
4. Quantifizierung der DNA-Menge mit einem Spektrophotometer (OD260 / OD280). Führen Sie Proben auf 0,8% Gele aus, um die Größe und Menge (1 μg) der beschallten Produkte zu bewerten ( Abbildung 2 ).
   HINWEIS: Die durchschnittliche Chromatinausbeute beträgt ca. ~ 20%.

4. ChIP

1. Das zuvor gereinigte Chromatin bei -80 ° C auftauen und das Chromatin auf ~ 100 - 120 μg pro Röhrchen austauschen. Verdünnen Sie 1:10 mit Radioimmunopräzipitationstest (RIPA) -Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC), 0,1% Na-Desoxycholat W / v), 1% Triton X-100).
   1. Wenn es mehrere Proben in jeder Gruppe gibt, kombinieren Sie gleiche Mengen an Chromatin-DNA mit der Endmenge von ~ 100 - 120 μg / Probe. Sparen Sie 10% als Eingabe.
2. Fügen Sie 40 μl (50% v / v Aufschlämmung in RIPA-Puffer) von BSA-vorblockierten (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G Agarose (Nicht-Huhn Antikörper) oder IgY Perlen (Chicken Antikörper) und inkubieren auf Ein Rotator für 3 h bei 4 ° C.
3. Zentrifugieren Sie bei 1000 xg, 10 min und übergeben Sie den Überstand sorgfältig auf neue Röhrchen.
4. Füge Antikörper bei 1 μg Antikörper pro ~ hinzu25 - 100 & mgr; g Chromatin-DNA.
5. Bei 4 ° C über Nacht bei ca. 15 U / min leicht einwirken lassen.
6. Füge 10 μl BSA-vorblockierte (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G Agarose (Nicht-Huhn Antikörper) oder IgY Perlen (Hühner Antikörper) Mischung und drehen im kalten Raum für 2 h.
7. Waschen Perlen wie folgt. Mit 1 ml RIPA-Puffer für 3 min zweimal waschen, mit 1 ml hohem Salzpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) für 3 min zweimal waschen , Mit 1 ml LiCl-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-Desoxycholat, 0,5% NP40) für 3 min zweimal gewaschen.
   1. Mit 1 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) für 3 min einmal abwaschen. Dann eluierte DNA mit Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA und 0,5% SDS).
8. Zentrifugieren bei 1.000 g, 1 min und vorsichtig den Überstand entfernen.
9. Resaustieren Sie den Wulst mit 50 & mgr; l Elutionspuffer.
10. Inkubieren für 10Min bei 65 ° C.
11. Zentrifugieren bei 12.000 g für 5 min.
12. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen, fügen Sie weitere 50 μl hinzu und zentrifugieren Sie noch einmal bei 12.000 g für 5 min. Das endgültige Elutionsvolumen beträgt 100 μl.
13. Reverse Vernetzung und DNA-Elution.
    1. Inkubieren des eluierten Chromatins über Nacht bei 65 ° C.
    2. Man gibt 1,0 ul RNase A zu und inkubiert für 30 min bei 37 ° C.
    3. Man gibt 8 μl Protease K (10 mg / ml) zu und inkubiert 30 min bei 55 ° C.
    4. Ernte die DNA unter Verwendung eines PCR-Cleanup-Kits mit Elutionsvolumen bei 50 μL nach dem Protokoll des Herstellers.
14. Analysieren Sie die Profile von Real-time qPCR wie zuvor beschrieben ^{25 , 26} .
    HINWEIS: Die Primer-Sequenzen sind in Abbildung 3 Legende aufgelistet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt ( Abbildung 3 ).

Ergebnisse

Hier haben wir die Formaldehyd-Vernetzung unmittelbar nach der Gewebesammlung durchgeführt, um die DNA-Protein-Wechselwirkung in Echtzeit zu bewahren. Jedoch fanden wir, dass Saccharose oder kolloidaler Gradient, der üblicherweise für die Kerneisolation ^{23 , 24 verwendet wurde} , bei der Trennung von Kernen von Myofibrillen (Daten nicht gezeigt) wirksam war. Der Grund mag sein, dass die Vernetzung eine ähnliche Schwerkraft für Ker...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine robuste Methode, bei der vernetzte Skelettmuskelgewebe verwendet wurden, um qualitativ hochwertige Kerne zu isolieren. Eine sequenzielle Filtration wurde durchgeführt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen, und die akustische Ultraschall-Energie aus dem schalenförmigen Wandler scherte das Chromatin für die ChIP-Analyse. Die Ergebnisse zeigten eine zirkadiane zeitspezifische Bindung von BMAL1 an Zielpromotoren.

ChIP kann verwendet werden, um Echtzeit-Protein-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Materials
Formaldehyd-Lösung	Sigma Aldrich	F8775
Glycin	Fisher Scientific	BP381-5
Trypanblau-Lösung (0,4%)	Fisher Scientific	15250061
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
Protease K	Sigma Aldrich	3115887001
Chicken Anti-BMAL1 Antikörper			Erzeugt in Hühnern (Cocalico Biologicals) gegen das Antigen aa 318 - 579, und IgY wurde mit demselben Antigen affinitätsgereinigt.
Hühner-IgY-Niederschlagsharz	GenScript	L00405
Equipment
KINEMATICA  Polytron PT2100 Tisch-Homogenisator	Fisher Scientific	08-451-178
15 mL Dounce Tissue-Grinder	Whearton	357544
Falcon Cell Seveners 100 & micro; m	Fisher Scientific	08-771-19
Falcon Zellsiebe 70 & Mikro; m	Fisher Scientific	08-771-1
Falcon Zellsiebe 40 & Mikro; m	Fisher Scientific	08-771-2
pluriSsieb 30 & Mikro; m	PluriSelect	43-50030-03
pluriSsieb 20 & micro; m	PluriSelect	43-50020-03
pluriSsieb 10 & micro; m	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 Fokussiertes Ultraschallgerät	Covaris	Modell S2
Labquake	Thermo Scientific	C415110 CCD-Mikroskopkamera
	Leica Microsystems	DFC3000 G
ReagenzienkitDNA-Extraktionskit
	Thermo Scientific	K0691
Puffer
Alle Pufferkomponenten sind im Protokoll beschrieben. Jede Komponente wurde von Sigma Aldrich