Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Protokolle für Waschmittel-freie Homogenisierung der kultivierten Säugerzellen basierend auf Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Diese Methode ist ideal für die Überwachung der Partitionierung von peripheren Membranproteinen zwischen löslich und Membran-Fraktionen.

Zusammenfassung

Kultivierte Zellen eignen sich für das Studium der subzellulären Verteilung von Proteinen, einschließlich der peripheren Membranproteine. Genetisch codierte Eindringmittel haben tagged Proteine das Studium der subzellulären Proteinverteilung revolutioniert. Es ist jedoch schwierig zu quantifizieren die Verteilung mit Fluoreszenz-Mikroskopie, vor allem, wenn Proteine teilweise cytosolischen sind. Darüber hinaus ist es oft wichtig, körpereigene Proteine zu studieren. Biochemische Tests wie Immunoblots der Goldstandard für die Quantifizierung der Proteinverteilung nach subzellulären Fraktionierung bleiben. Zwar kommerzielle Kits, die cytosolischen oder bestimmte Fraktionen Membran isolieren wollen, basieren die meisten dieser Kits auf Extraktion mit Reinigungsmitteln, die möglicherweise ungeeignet für das Studium periphere Membranproteine, die leicht aus Membranen extrahiert werden. Hier präsentieren wir ein Waschmittel-freie Protokoll für zelluläre Homogenisierung von Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Wir bestätigen die Trennung der subzellularen Organellen in lösliche und Pellet Brüche in verschiedenen Zelltypen und Proteingewinnung unter mehrere gemeinsame mechanische Homogenisierung nicht-Reinigungsmittel-basierte Methoden zu vergleichen. Einige Vorteile von Stickstoff ist Kavitation die überlegene Effizienz der zellulären Störungen mit minimalen physikalischen und chemischen Schäden an empfindlichen Organellen. In Kombination mit Ultrazentrifugation Stickstoff Kavitation ist eine hervorragende Methode, die Verschiebung von peripheren Membranproteinen zwischen cytosolischen zu untersuchen und Membran-Fraktionen.

Einleitung

Zelluläre Proteine können in zwei Klassen einteilen: diejenigen, die Membranen und diejenigen, die nicht zugeordnet sind. Nicht zugeordneten Membranproteine sind im Zytosol, Nukleoplasma und Lumina von Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) gefunden. Es gibt zwei Klassen von Membran-assoziierte Proteine, integralen und peripheren. Integrale Membranproteine sind auch bekannt als transmembrane Proteine, weil ein oder mehrere Segmente der Polypeptid-Kette erstreckt sich über die Membran in der Regel als eine α-Helix bestehend aus hydrophoben Aminosäuren. Transmembrane Proteine sind co-translationally Membranen im Laufe des Jahres ihre Biosynthese eingeschoben....

Protokoll

1. Puffer und Ausrüstung Vorbereitungen

1. Chill 45 mL Zelle Störung Bomben, 15 mL-Tuben und Ultrazentrifugation Rohre bei 4 ° c
2. Vorbereiten und chill Homogenisierung Puffer pro 2 x 10 ⁷ Zellen bei 4 ° c hinzufügen eine Protease Inhibitor Tablette kurz vor dem Einsatz 25 mL.
   Hinweis: Homogenisierung Puffer enthalten in der Regel KCl, anstatt NaCl besser reflektieren intrazellulären Salzzusammensetzung. Homogenisierung Puffer verwendet, die in diesem Protokoll besteht aus 10 mM HEPES bei pH 7,4, 10 mM KCl und 1,5 mM MgCl ₂ (nachfolgend hypotone Homogenisierung Puffer). Die meisten Puffer können für Stickstoff Kavitation an....

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die Aufteilung des zellulären Proteinen aus PNS in der löslichen cytosolische Fraktion (S) oder Membran Pellet Bruchteil (P). Wir untersuchten drei repräsentativen Zelllinien aus verschiedenen Zelltypen: HEK-293 (epitheliale), NIH-3 t 3 (Fibroblasten) und Jurkat (Lymphozyten). Rho Guanin Dissoziation Inhibitor (RhoGDI) und kationen-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CIMPR) dienten als Positivkontrollen für cytosolischen und Membran Brü.......

Diskussion

Die Vorteile von Stickstoff Kavitation gegenüber anderen Methoden der mechanischen Störungen sind vielfältig. Vielleicht ist der wichtigste Vorteil seine Fähigkeit, sanft aber effizient Proben zu homogenisieren. Die physikalischen Grundlagen der Dekompression kühlt Proben statt erzeugen lokale Erwärmung Schaden wie Ultraschall und Reibung/Scheren Techniken basiert. Kavitation ist auch äußerst effizient in der Plasmamembran zu stören. Da Stickstoff werden Luftblasen innerhalb jeder einzelnen Zelle bei der Dekompression, d.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellaufschlussgefäß (45 mL)	Parr Instrument	4639	Stickstoffkavitationsbombe
Dounce Homogenisator (2 mL)	Kontes	885300-0002	Dounce Stößel und Röhrchen
U-100 Insulinspritze 28G½	Becton Dickinson	329461	Needle
Atg12 Antikörper	Santa Cruz	271688	Maus Antikörper, verwenden bei 1:1000 Verdünnung
β-Aktin Antikörper	Santa Cruz	47778	Maus Antikörper, verwenden bei 1:1000 Verdünnung
β-Tubulin Antikörper	DSHB	E7-s	Maus Antikörper, verwenden bei 1:5000 Verdünnung
Calnexin Antikörper	Santa Cruz	23954	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
Calregulin-Antikörper	Santa Cruz	373863	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
Katalase-Antikörper	Santa Cruz	271803	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
CIMPR-Antikörper	Abcam	124767	Kaninchen-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
EEA1-Antikörper	Santa Cruz	137130	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
EGFR-Antikörper	Santa Cruz	373746	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
F0-ATPase-Antikörper	Santa Cruz	514419	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
F1-ATPase-Antikörper	Santa Cruz	55597	Maus-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
Fibrillarin-Antikörper	Santa Cruz	374022	Maus-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:200
Golgin 97 Antikörper	Santa Cruz	59820	Maus-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:1000
HDAC1-Antikörper	Santa Cruz	81598	Maus-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:1000
Hexokinase 1-Antikörper	Cell Signaling Technology	2024S	Kaninchen-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:1000
Lamin A/C-Antikörper	Santa Cruz	376248	Maus Antikörper, verwenden bei 1:1000 Verdünnung
LAMP1 Antikörper	DSHB	H4A3-c	Maus Antikörper, verwenden bei 1:1000 Verdünnung
Na+/K+ ATPase Antikörper	Santa Cruz	48345	Maus Antikörper, verwenden bei 1:1000 Verdünnung
Rab7 Antikörper	Abcam	137029	Kaninchen Antikörper, verwenden bei 1:1000 Verdünnung
Rab9 Antikörper	Thermo	MA3-067	Maus-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:1000
RCAS1-Antikörper	Santa Cruz	398052	Maus-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:1000
RhoGDI-Antikörper	Santa Cruz	360	Kaninchen-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:3000
Ribosomales Protein S6-Antikörper	Santa Cruz	74459	Maus-Antikörper, Verwendung bei einer Verdünnung von 1:1000
Sec61a-Antikörper	Santa Cruz	12322	Ziegen-Antikörper, Verwendung in einer Verdünnung von 1:1000
Dickwandiges Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter		349622 Probenröhrchen für die Ultrazentrifugation
TLK-100.3	Rotor Beckman Coulter	349481	Rotor für die Ultrazentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	364300	Ultrazentrifuge
cOmplete Proteasehemmer Cocktailtabletten	Roche	11697498001	Proteasehemmer
Zellschaber mit 25 cm Griff und 3,0 cm Klinge	Corning	353089	großer Zellschaber
Magnetischer Rührstab	Fisher Scientific	14-513-57SIX	Mikrorührstab
Magnetrührer mit Keramikaufsatz	Fisher Scientific	S504501AS	Magnetrührer