Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

Summary

Protokolle für das Studium der embryonalen und perinatalen murinen Aorta mit in Vivo klonalen Analyse und Schicksal Mapping, Aorten-Explantaten und isolierten glatte Muskulatur, die Zellen detailliert sind hier. Diese unterschiedlichen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Morphogenese der embryonalen und perinatale Aorta in normale Entwicklung und die Pathogenese in Krankheit.

Abstract

Die Aorta ist die größte Arterie im Körper. Die aortalen Wand besteht aus einer Innenlage aus Endothelzellen, einer Mittelschicht aus alternierenden elastische Lamellen und glatten Muskelzellen (SMCs) und eine äußere Schicht der Fibroblasten und extrazelluläre Matrix. Im Gegensatz zu der weit verbreiteten Studie von pathologischen Modelle (z.B. Arteriosklerose) in der Erwachsenen Aorta ist über die embryonale und perinatale Aorta weit weniger bekannt. Hier konzentrieren wir uns auf SMCs und Protokolle für die Analyse der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorten SMCs in normale Entwicklung und Krankheit. Insbesondere die vier Protokolle enthalten sind: ich) in Vivo embryonalen Schicksal Kartierung und klonale Analyse; (II) Explant embryonalen Aorta Kultur; (III) SMC isoliert von der perinatalen Aorta; und iv) subkutane osmotische Mini-Pumpe Platzierung in schwanger sind (oder nicht-schwangeren) Mäuse. Diese Ansätze ermöglichen die Untersuchung des Origin(s), des Schicksals und der klonalen Architektur von SMCs in die Aorta in Vivo. Sie ermöglichen für die Modulation embryonalen Aorta Morphogenese im Mutterleib durch die ständige Einwirkung von pharmakologischen Wirkstoffen. Darüber hinaus isolierte Aorta Gewebe explants oder Aorten SMCs Einblicke in die Rolle des spezifischen gen Ziele während grundlegende Prozesse wie Muscularization, Proliferation und Migration eingesetzt werden. Diese Hypothese schaffende Experimente an isolierten SMCs und der explantierten Aorta können dann im Kontext in Vivo durch pharmakologische und genetische Ansätze beurteilt werden.

Introduction

Die Herz-Kreislauf-Systeme der Mehrzeller Funktion, Nährstoffe und Sauerstoff zu den Zellen zu liefern sind, die nicht in Kontakt mit der äußeren Umgebung und Abfallstoffe und Kohlendioxid aus diesen Zellen zu entfernen. Bei Wirbeltieren besteht das primäre Herz-Kreislauf-System des Herzens, welche pumpt durch eine Reihe von Blutgefäßen Blut. Die Wände der großen Blutgefäße wie Arterien und Venen, bestehen aus drei Schichten: ich) die Intima oder innere Schicht von Endothelzellen; (II) die Medien oder mittlere Schicht abwechselnd umlaufend länglichen glatten Muskelzellen SMCs und elastische Lamellen; und Iii) der Adventitia oder äußere Schicht von Bindegewebe und Fibr....

Protocol

alle Maus-Protokolle sind durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an der Yale University genehmigt.

1. In Vivo embryonalen Schicksal Mapping und klonale Analyse

Hinweis: Wir haben diese Ansätze allgemein verwendet, um die Ursprünge der Zellen und ihrer klonalen Architektur in Entwicklung und Krankheit Modelle bewerten ^{7 , 8 , 9 , 10}.

1. Paarung zwischen Mäuse mit einem CreER und Mäuse mit einem Cre-Reporter einrichten.
   Hinweis: Eine CreER is....

Results

In einer repräsentativen klonalen Analyse von SMCs Embryonen Mutant für Eln (das Gen Kodierung der extrazellulären Matrix Protein Elastin) Eln^(+/-), Acta2-CreER^T2 Mäuse waren verbunden mit Eln^(+/-) Mäuse auch die Durchführung der Multi-Color ROSA26R^(Rb/Rb) Reporter. Wie in Schritt 1 beschrieben, Stecker wurden überprüft, schwanger Dämme wurden mit einer einzigen Tamoxifen-Injektion (1,5 mg) bei E12.5 induziert, und s.......

Discussion

Im Gegensatz zu den umfangreichen Untersuchungen der murinen Aorta und ihrer großen Niederlassungen in Erwachsenen pathologischen Zuständen, wie z. B. Modelle von Arteriosklerose ist weniger bekannt, bezüglich der Morphogenese und der Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta. Hier setzen wir auf die embryonale/perinatale Aorta, speziell die SMCs und bieten Protokolle zur Untersuchung der Aorta durch in-Vivo, Gewebe Explant und SMC Isolierung nähert. Diese kostenlosen Ansätze bieten die Ermittler mit unte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648
Maisöl	Sigma	C-8267	Vehikel für Tamoxifen
4-OH-Tamoxifen	Sigma	H7904	Aktiver Metabolit von Tamoxifen
Progesteron	Sigma	P8783-5G	Verwendung in halber Konzentration von Tamoxifen
OCT-Verbindung	Sakura tissue tek	4583	Zur Herstellung von Kryoblöcken
Cryomolds	Polysciences inc	18986
DAPI	Sigma	D9542	IHC-Färbung des Zellkerns, Endkonzentration 5 mg/mL
Cy3 direkt konjugierter Anti-SMA-Antikörper	Sigma	A2547	IHC-Färbung von SMA, Endverdünnung 1:500
Anti-CD31-Antikörper	BD Pharmingen	550274	IHC-Färbung von GFP, Endkonzentration 0,006 mg/mL
Anti-GFP-Antikörper	Thermo Fisher Scientific	A-11121	IHC-Färbung von CD31, Endkonzentration 0,0016 mg/ml
Sekundärantikörper Ziege Anti-Kaninchen, Alexa 647	Life Technologies	a21244	IHC-Färbung, Endkonzentration 0,004 mg/ml
Sekundärantikörper Ziege Anti-Kaninchen, Alexa 488	Life Technologies	a11008	IHC-Färbung, Endkonzentration 0,004 mg/ml
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10567-014	Für Zellkulturen
FBS	Thermo Fisher Scientific	10437028
Anti-Integrin, Beta3-blockierender Antikörper	BD Biosciences	553343	Klon 2C9. G2, Endkonzentration 0,02 mg/ml
Kollagenase	Worthington Biochemical Corp	44H14977A	Zur Verdauung der Aorta
Elastase	Worthington Biochemical Corp	34K15139	Zur Verdauung der Aorta
Antibiotisch-antimykotisch (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062
Rekombinant humanes FGF	Promega	G5071
Rekombinant humanes	EGF Promega	G5021
Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Amphotericin B	Thermo Fisher Scientific	15290026
Gewebekulturplatten	Corning	CLS430165
Alzet osmotische Minipumpe	Durect Corporation	2001
ECLIPSE 80i Aufrecht Fluoreszenzmikroskop	Nikon
TCS  SP5	Leica
Branson Sonifier 450	VWR
Myh11-CreERT2 Mäuse	Das Jackson Laboratory	19079
Acta2-CreERT2 Mäuse			Gewonnen aus dem Labor von Dr. Pierre Chambon und Daniel Metzger
ROSA26R-CreERT2 Mäuse	The Jackson Laboratory	8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) Mäuse	Das Jackson Laboratory
ROSA26R(EYFP/EYFP) Mäuse	Das Jackson Laboratory	006148
ROSA26R(Konfetti/Konfetti) Mäuse	Das Jackson Labor	13731
ROSA26R(Rb/Rb) Mäuse	Labor von Dr. Irv Weissman		Gewonnen aus dem Labor von Dr. Irv Weissman