Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Zusammenfassung

Hier stellen wir einen zuverlässigen und einfachen Assay vor, um den Glykogengehalt in Cyanobakterienzellen zu messen. Das Verfahren beinhaltet die Ausfällung, die selektierbare Depolymerisation und den Nachweis von Glukoseresten. Diese Methode eignet sich sowohl für Wildtyp- als auch für gentechnisch veränderte Stämme und kann das metabolische Engineering von Cyanobakterien erleichtern.

Zusammenfassung

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als eine wichtige intrazelluläre Kohlenstoff- und Energiespeicherung während der Photosynthese. Die jüngsten Entwicklungen in der Forschung haben komplexe Mechanismen des Glykogenstoffwechsels hervorgehoben, einschließlich des Diel-Zyklus der Biosynthese und des Katabolismus, der Redoxregulation und der Beteiligung von nicht-kodierender RNA. Gleichzeitig werden Anstrengungen unternommen, um Kohlenstoff von Glykogen zu wünschenswerten Produkten in gentechnisch veränderten Cyanobakterien umzuleiten, um die Produktausbeuten zu erhöhen. Mehrere Methoden werden verwendet, um den Glykogengehalt in Cyanobakterien mit variablen Genauigkeiten und technischen Komplexitäten zu bestimmen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die zuverlässige Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien zur Verfügung, die in einem Standard-Life-Science-Labor durchgeführt werden können. Das Protokoll beinhaltet die selektive Ausfällung von Glykogen aus dem Zelllysat und die enzymatische Depolymerisation von Glykogen zur Erzeugung von Glucose-Monomeren, die durch einen Glukoseoxyd nachgewiesen werdenIdase-Peroxidase (GOD-POD) enzymgekoppelter Assay. Die Methode wurde auf Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, zwei Modell-Cyanobakterienarten, die in der Stoffwechseltechnik weit verbreitet sind. Darüber hinaus zeigte das Verfahren erfolgreich Unterschiede in den Glykogeninhalten zwischen dem Wildtyp und Mutanten, die in regulatorischen Elementen oder Glykogen-Biosynthesegenen defekt sind.

Einleitung

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als den Hauptkohlenhydratspeicher von Kohlenstoff aus CO _{2, der} durch Lichtsynthese in Licht fixiert ist. Glykogen ist ein Glycan, bestehend aus linearem α-1,4-verknüpften Glucan mit Verzweigungen, die durch α-1,6-verknüpfte Glucosyl-Bindungen erzeugt werden. Die Glykogen-Biosynthese in Cyanobakterien beginnt mit der Umwandlung von Glucose-6-phosphat in ADP-Glucose durch die sequentielle Wirkung von Phosphoglucomutase und ADP-Glucose-Pyrophosphorylase. Der Glucoseanteil in ADP-Glucose wird auf das nicht-reduzierende Ende des α-1,4-Glucan-Grundgerüsts von Glykogen durch eine oder mehrere Glykogensynthasen (GlgA) übertrag....

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Cyanobakterielle Kulturen
   1. Wachsen Synechocystis sp. PCC 6803 bei 30 ° C in flüssigem BG11-Medium ⁸ , mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO ₂ . Beleuchten Sie die Kulturen kontinuierlich mit Licht bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 50 μmol Photon / m ² / s.
   2. Wachsen Synechococcus sp. PCC 7002 in flüssigem A + Medium ²³ (BG11-Medium kann auch verwendet werden), mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO ₂ . Die Temperatur sollte 37 ° C betragen. Beleuchten ....

Ergebnisse

10 ml Wildtyp- Synechocystis sp. PCC 6803 wurden unter photochotrophischen Bedingungen gezüchtet, bis der OD _730nm Wert etwa 0,8 erreichte. Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert. Der OD _730nm- Wert wurde auf 2-3 eingestellt. Der Glykogengehalt wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll analysiert. Der Glykogengehalt pro OD _{730 nm} betrug 13 ± 1,8 μg / mL / OD _{730 nm} ( N = 12). Die Glykogen - Geh.......

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind Glykogenpräzipitation und Resuspension. Nach der Zentrifugation nach Ethanol-Präzipitation bildet Glykogen ein lichtdurchlässiges Pellet, das lose an den Wänden der Mikrozentrifugenröhrchen haftet. Daher muss beim Entfernen des Überstandes besondere Aufmerksamkeit gegeben werden, um das Pellet nicht zu entfernen. Das Glykogen-Pellet ist klebrig, und Solubilisierung kann schwierig sein, wenn es austrocknet. Man beachte, daß die vollständige Solubilisierung des Glykogenpell.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Mikroplatten-Reader	Molecular Devices	NA	Eliza Plate Reader
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Beads Beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spektralphotometer	Amersham Biosciences	NA	Spektralphotometer
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Puffer
HCl	Merck	1-00317	pH-Adjutment
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	32319	Puffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzym für die Glykogendepolymerisation
α-Amylase, thermostabil (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzym für die Glykogendepolymerisation
D-Glucose	Merch	8337	Standard für den Glukoseassay
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher scientific	23225	Zur Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Aluminium-Trockenschalen, Einweg	VWR	611-1362	Zur Bestimmung des Zelltrockengewichts
D-Glucose Assay Kit (GODPOD-Format)	Megazyme	K-GLUC	Zur Bestimmung von Glukosekonzentrationen
Zirkonoxid-Brote, 0,15 mm	Weiter Advance	ZrOB015	Kügelchen für die Zelllyse in einem Bullet Blendar Storm
RINO Röhrchen	Next Advance	NA	Röhrchen für die Zelllyse in einem Bullet Blendar Storm