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Methodenartikel

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

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DOI:

10.3791/56083

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18. September 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test, wo sind prelabelled mesenchymale Zellen Co kultiviert mit Ratte Aorta abgeleitet endotheliale Netzwerke. Diese neuartige Methode ermöglicht die Visualisierung von mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) Homing und Integration mit endothelialen Netzwerken, Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften und Auswertung von MSC Immunophenotypes und gen-Expression.

Zusammenfassung

Angiogenese ist ein komplexen, stark regulierten Prozess verantwortlich für die Bereitstellung und Aufrechterhaltung angemessener Gewebedurchblutung. Unzureichende Gefäßsystem Wartungs- und pathologischen Fehlbildungen führt zu schweren ischämischen Erkrankungen, während allzu reichlich vaskulären Entwicklung mit Krebs und entzündliche Erkrankungen verbunden ist. Eine viel versprechende Form der Pro-angiogenen Therapie ist die Verwendung von angiogenen Zellen Quellen, die regulatorische Faktoren sowie körperliche Unterstützung für neu entstehender Gefäßsystem bilden können.

Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind ausführlich untersuchten Kandidaten für vaskuläre Regeneration durch ihre parakrine Effekte und ihre Fähigkeit zu erkennen und Heimat von ischämischen oder entzündeten Gewebe. Insbesondere sind erste Trimester menschlichen Nabelschnur perivaskuläre Zellen (FTM HUCPVCs) einen vielversprechenden Kandidaten aufgrund ihrer Pericyte Eigenschaften, hohe proliferative und multilineage Potenzial, immun-privilegierten Eigenschaften und robuste parakrine Profil. Um effektiv potenziell angiogenen regenerativen Zellen bewerten, ist es eine Voraussetzung, sie zuverlässig und "übersetzbar" prä-klinischen Tests zu testen. Die Aorten Ring-Assay ist ein ex-Vivo Angiogenese Modell, die für einfache Quantifizierung von röhrenförmigen endothelial Strukturen ermöglicht, bietet Zubehör unterstützende Zellen und extrazellulären Matrix (ECM) vom Host schließt entzündliche Komponenten und ist schnell und kostengünstig einzurichten. Dies ist vorteilhaft im Vergleich zu in-Vivo -Modelle (z.B.Hornhaut-Assay, Matrigel Stecker Assay); die Aorta Ring-Assay kann verfolgen die verabreichten Zellen und beobachten Sie interzelluläre Wechselwirkungen Xeno-Immune Ablehnung zu vermeiden.

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Anwendung des Aorten-Ring Assays, schließt menschliche MSCs in Ko-Kulturen mit entwickelnden Ratte Aorta endotheliale Netzwerke. Dieser Test ermöglicht die Analyse des MSC Beitrags zur Entstehung und Entwicklung durch physikalische Pericyte-ähnlichen Interaktionen Rohr und ihre Wirksamkeit für die Migration aktiv auf Seiten der Angiogenese und zur Beurteilung ihrer Fähigkeit führen und vermitteln ECM-Verarbeitung. Dieses Protokoll bietet weitere Informationen über Veränderungen im MSC-Phänotyp und gen-Ausdruck folgt Kokultur.

Einleitung

Der komplexe Prozess der Angiogenese verbessert und Gewebedurchblutung durch die Förderung von Nachwuchs Schiff Entwicklung von bereits bestehenden Gefäßsystem1unterhält. Es ist ein streng regulierte, ausgewogene Prozess durch Pro-angiogenen und Anti-angiogenen Faktoren. Jeder Mangel in diesem System führen zu unzureichender Schiff Wartung oder Wachstum, verursacht schwere ischämische Erkrankungen wie Herzinfarkt Krankheit, Schlaganfall und Neurodegenerative Erkrankungen. Übertriebene vaskulären Entwicklung ist jedoch charakteristisch für Bedingungen wie Krebs und entzündliche Erkrankungen2.

Entwicklung von Therapien, die darauf abzielen, Angiogenese zu günstigen Geweberegeneration zu kontrollieren ist von zentraler Bedeutung. Trotz umfangreichen präklinischen und klinischen Untersuchungen haben Versuche mit Pro-angiogenen Faktoren und Micro-RNAs Angiogenese stimulieren konnte gewünschten Ergebnisse3,4,5zu erreichen. Mögliche Gründe für die vorübergehende Effekte sind: begrenzte Lebensdauer der angiogenen Proteine und Nukleinsäuren und die begrenzte Anzahl von gezielten Wachstumsfaktoren6,7. Obwohl lösliche angiogenen Faktoren entscheidend für die Initiierung der Angiogenese sind, hängen die Wartung und die Funktionalität des Gefäßsystems Zelltypen, einschließlich Perizyten und glatten Muskel Zellen8zu unterstützen. Bereich der Pro-angiogenen Therapien erforscht jetzt potenzielle Stammzellen und Vorläuferzellen Zelle, die angiogenen Faktoren vor Ort zur Verfügung stellen kann, während Gefäßsystem, selbst erneuern oder sogar Differenzierung in physisch unterstützt neu entwickelt werden. Endothel-wie Zellen9,10. Suche nach der optimalen angiogenen Zelltypen mit der Fähigkeit, diese funktionalen Anforderungen zu erfüllen verspricht für ischämische Geweberegeneration.

Um mögliche zellbasierte Therapien erfolgreich in klinischen Studien zu übersetzen, müssen prä-klinischen Studien ihre Wirksamkeit zu demonstrieren, und markieren Sie die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese. Trotz der hohen Anzahl von etablierten Angiogenese Assays, Bereich fehlt einen "Gold-Standard" in-vitro- Assay, die zuverlässig die Wirksamkeit von potenziellen Kandidaten Zelle Arten11,12, auswerten konnte 13. die meisten in-vitro- Angiogenese-Assays (einschließlich die endotheliale Proliferation, Migration und Rohr-Bildung-Assays) in der Regel bewerten die Auswirkungen von Zellen oder Verbindungen auf endothelialer Zellen phänotypischen Veränderungen oder Differenzierung in Stahlrohr und Netzwerk-Strukturen14,15. Während diese Funktionen für Angiogenese von entscheidender Bedeutung sind, sollte ein "übersetzbar" Assay auch bewerten: 1) die Augmentation oder den Austausch der unterstützende Zelltypen, einschließlich Perizyten oder glatten Muskelzellen, (2) die Verarbeitung von ECM und/oder Basalmembran, und 3). die Effizienz, die Bildung von funktionalen Microvasculature zu fördern. In Vivo Angiogenese Modelle, einschließlich der Hornhaut Assay und Matrigel Stecker Assay, rekapitulieren die einzigartige in Vivo Mikroumgebung, sondern stehen vor der Herausforderung durch die Schwierigkeiten bei der Verfolgung verabreicht Zellen, physikalische Wechselwirkungen zu beobachten. Darüber hinaus kann in in Vivo Modellen Xeno-Immune Ablehnung auftreten, während des Tests mögliche allogene Zelle Therapie Kandidaten16. Ex Vivo Angiogenese-Modelle kann besonders die Aorta Ring-Assay zur Verfügung stellen: (1) einfache Beobachtung und Quantifizierung der röhrenförmigen Strukturen, (2) Zubehör unterstützende Zellen (3) ECM von Host und künstliche Zubehör (4) Ausschluss von entzündlichen Komponenten, und 5) schnelle und kostengünstige Installation17,18. In der Regel kann die Aorta Ring-Assay angiogenen Potenzial der kleine Sekretorische Proteine, pharmakologische Wirkstoffe und transgene Nager-Modelle19,20,21testen.

MSCs sind viel versprechende Kandidaten für vaskuläre Regeneration in erster Linie durch ihre parakrine-vermittelten Effekte22,23,24. MSCs haben gezeigt, dass wichtige angiogenen Faktoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), sezernieren Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) und Angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs können auch erkennen und Heimat von ischämischen oder entzündeten Gewebe, jedoch die genauen Mechanismen sind derzeit noch untersucht. In zunehmendem Maße unterstützt die Literatur die Hypothese, dass die meisten MSCs perivaskuläre Zellen entstehen, Co Pericyte Marker Express und können Verhalten sich wie Perizyten27. HUCPVCs sind eine junge MSCs abgeleitet aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur. Sie repräsentieren eine Bevölkerung von MSCs mit Pericyte-Like Eigenschaften und wurden von FTM und Begriff Nabelschnüre charakterisiert. FTM HUCPVCs zeigen eine hohe Expression von Pericyte Markern einschließlich CD146 und NG2, hohe proliferative und multilineage Potenzial, immun-privilegierten Eigenschaften und zeigt eine robuste parakrine Profil28. FTM HUCPVCs sind ein idealer Kandidat Zelltyp, Regeneration des verletzten Gewebes durch die Förderung von neuen Gefäßsystem über ihre Pericyte-ähnliche Eigenschaften zu fördern.

Um die angiogenen Potenzial und Pericyte-ähnliche Eigenschaften der menschlichen MSCs zu testen, sind eine sehr begrenzte Anzahl von Angiogenese-Assays zur Verfügung wo positive Angiotropic Migration (nachfolgend "Homing"), ECM Bearbeitung und Entwicklung von körperlichen Wechselwirkungen zwischen Zelltypen können untersucht werden, während quantitative Daten über Microvasculature Entwicklung zu erhalten.

Hiermit präsentieren wir eine Protokoll, die eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test beschreibt. Menschlichen MSCs waren Co kultiviert mit entwickelnden Ratte abgeleitet Aorten endotheliale Netzwerken, um ihren Beitrag zur Entstehung, Reifung und Homöostase Rohr zu beurteilen. Diese Version von der Aorta Ring-Test bewertet die Fähigkeit und Potenz der Zelle Therapie Kandidaten nach Hause führen Sie zu Seiten der Angiogenese, ECM Verarbeitung vermitteln und tragen zur endothelialen röhrenförmigen Entwicklung durch den Aufbau von Pericyte-wie körperliche Interaktionen. Neben der Quantifizierung des Nettoeffekt von MSCs auf in-vitro- endothelialen Netzwerkbildung und interzelluläre Wechselwirkungen zu beobachten, haben wir auch ein Protokoll zur MSCs von Ko-Kulturen zu isolieren optimiert. Durch Durchflusszytometrie und qPCR, ist es möglich, Veränderungen in MSC Phänotyp und gen-Expression nach Kokultur zu charakterisieren. Als Modell Zelltypen verglichen wir ontogenetisch früh (pränatal) und Ende (Erwachsenen-) Quellen des menschlichen MSCs: FTM HUCPVCs und menschlichen Knochenmark stammenden MSCs (BMSC), bzw. in die Aorta Ring-Assay. Wir schlagen vor, der Aorta Ring-Test verwendet werden, um das angiogenen Potenzial der jeden physisch unterstützende Zelltyp beim untersuchten angiogenen regenerative Anwendungen zu studieren.

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Protokoll

alle Studien mit Tieren durchgeführt und nach Ankunft Richtlinien 29 gemeldet wurden. Alle Studien wurden mit Genehmigung durch institutionelle Forschung Ethik den Verwaltungsrat (REB Anzahl 4276) durchgeführt. Alle Tier, das Verfahren des Tier Pflege des University Health Network (Toronto, Kanada), genehmigt wurden und alle Tiere erhielten humane Pflege in Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8 th Edition ( Der National Institutes of Health 2011).

1. Aorten Ring-Assay-Setup

  1. isolieren die Ratte Aorta.
    1. Einschläfern 8 - 10 Wochen alten Sprague-Dawley Ratten mit CO 2 Erstickung: Set CO 2 Kammern auf 20 % gas-Ersatz (Durchfluss = 0,2 x Kammer Volumen/min). Durch das Fehlen von Prise Reflex und Herz Schlägen durch Abtasten Brust bestätigen.
    2. Nass das Fell am Brustbereich mit steriler Gaze mit 70 % Ethanol. Sterilisierte Pinzette und Schere verwenden, um einen Einschnitt in der Mittellinie der Brust machen und durch Haut und Muskel Schichten geschnitten.
    3. Sobald der Brustkorb ausgesetzt ist, schneiden den Brustkorb auf jeder Seite und Falten nach oben ca. 5 mm aus dem Brustbein auf jeder Seite. Blutungen aus Intercostalneuralgie Arterien in frischen Kadavern erwartet.
    4. Drücken das Lungengewebe und Herz anatomische rechts um die Aorta freizulegen. Die Aorta ist die weiße farbige Schiff befindet sich direkt neben der Wirbelsäule.
    5. Einsatz Zange zum Klemmen der Aorta (nach dem Aortenbogen) und chirurgische Schere um den ersten Schnitt die Aorta mit der Pinzette halten. Beim Schneiden der Aorta, die Brusthöhle füllt sich schnell mit Blut, deshalb ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um die Aorta vor der Blutgerinnung zu erhalten.
    6. Einsatz Pinzette halten die Aorta und vorsichtig schälen der Aorta nach unten, Weg von der Wirbelsäule. Der Zug wird die Intercostalneuralgie Arterien ohne weitere Einschnitte trennen. Erhalten Sie ca. 10 cm des Gewebes und/oder vor die Aorta teilt sich in zwei Niederlassungen in die Bauchhöhle und die Aorta aus dem Kadaver geschnitten. Die Membrane zu drücken, bei Bedarf den Zugang zu senken Sie Abschnitte der Aorta zur kaudalen Richtung.
      Hinweis: Schälen der Aorta sanft, da intensive Kraft es reißen führen kann. Wenn die Aorta Tränen zulassen Blutgerinnung für ein paar Sekunden und einem Papiertuch verwenden, um das geronnene Blut zu entfernen, so dass Sichtbarkeit der verbleibenden Aorta.
    7. Ort die Aorta in der 15 mL Tube mit 10 mL eiskaltes Hank ' s ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S ergänzt). Halten Sie die Rohre auf Ice
      Hinweis: Die Aorta Gewebe kann für 1-2 h auf dem Eis dauern aber es empfiehlt sich, es so schnell wie möglich bearbeiten.
  2. Bereiten die Aorta Ring Assay Kulturmedien in einem sterilen Biosafety Kabinett (BSC).
    1. Bereiten die endotheliale Wachstumsmedium (EGM) durch den Einsatz einer Filteranlage Filtern 500 mL endotheliale Basal Medium (EBM) mit 2 % fetalen Bovine Serum (FBS), 1 % Gentamicin und Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt. 50 mL der gefilterten Medien setzen Sie eine Perle oder Wasserbad bei 37 ° c
    2. 100 mL Filtern mithilfe einer anderen Filtrationseinheit P/S, vorbereitet von EBM ergänzt mit 2 % FBS und 1 % die EBM 2 % FBS (EBM-FBS) und Lagerung bei 4 ° c
  3. 12-Well-Zellkultur-Platten mit basalen Membran extrahieren (BME) während der Arbeit auf dem Eis zu beschichten.
    1. Ort ein 12-Well-Platte auf eine kalte Oberfläche (große Eisbeutel oder Tablett). Fügen Sie 200 µL/Well der frisch aufgetauten BME Verwendung gekühlt Pipettenspitzen und wirbeln die BME um gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. Arbeiten schnell, ungleichmäßige Polymerisation der BME zu vermeiden.
      Hinweis: Eine typische Aorta Exzision ergibt 20 Aorta Ringe. Um Variabilität zwischen der Aorta Ring-Assays berücksichtigen, setup mindestens drei Aorten Ring Assays pro Behandlungsgruppe und enthalten ein Steuerelement. Wenn die Quelle es zulässt, empfiehlt sich 6 Ringe pro Behandlungsgruppe.
    2. Legen die beschichteten Platten in feuchte Inkubatoren (95 % Relative Luftfeuchtigkeit, 37 ° C, 5 % CO 2; diese Bedingungen auf alle befeuchteten Inkubator Schritte im folgenden übertragen) für 30 min. statt 1.000 µL Pipettenspitzen zurück in-20 ° C für Schritt 1.5.3.
      Hinweis: Während der Basalmembran Extrakt im Lager Konzentration verwendet wird, seine Konsistenz und Steifigkeit wird streng kontrolliert durch die Polymerisationszeit. Achten Sie darauf, die exakt gleichen Polymerisation Zeiten für alle parallelen und unabhängigen Experimenten halten.
  4. Abschnitt die Aorta in gleichmäßige Ringe.
    1. Die Aorta aus der 15-mL-Tube und schreiben es in ein 10 cm Teller mit 10 mL frisches HBSS ergänzt mit 1 % P/S.
    2. Verwenden zwei Arten von Zangen, um sorgfältig zu trennen, die überschüssiges Bindegewebe, Fettgewebe, und einem Skalpell für die übrigen Zweige der Intercostalneuralgie Arterien der Aorta verbunden. Dies reduziert die Variabilität zwischen Ring-Einheiten basierend auf unterschiedlichen Ebenen des restlichen Gewebes. Entfernen Sie alle verbleibenden Blut aus in die Aorta geronnenen.
    3. Legen Sie ein Lineal oder Raster unter 10 cm Teller genau 1-2 mm breite Abschnitten der Aorta mit sterilen Skalpell und Pinzette schneiden. Schneiden Sie die Abschnitte so exakt wie möglich um Variabilität zwischen den Einheiten zu reduzieren.
  5. Der Aorta Ringe in BME einbetten.
    Hinweis: Wenn das Schneiden der Aorta Ringe vor der BME Polymerisation Inkubation nicht abgeschlossen ist, entfernen Sie die beschichteten Platten aus feuchte Inkubatoren und fügen Sie 100 µL der EBM in jede Vertiefung, die Polymerisation zu kündigen hinzu. Exaktes Timing ist wichtig, da übermäßige Polymerisation des BME die endotheliale Netzwerkmigration Entwicklung und Zelle behindern kann. Sobald die Aorta Ringe vorbereitet sind, entfernen Sie die EBM aus den Brunnen und machst weiter Schritt 1.5.2.
    1. Entfernen Sie die BME beschichtet-Brunnen aus die befeuchteten Inkubatoren und zurück zum BSC.
    2. Sorgfältig holen einzelne Aorta Ringe mit Zange und Platz eins in der Mitte jedes BME-beschichtete gut. Wiederholen Sie für die verbleibenden Aorta Ringe.
      Hinweis: Medien übertragen zusammen mit der Aorta Ring aufbewahrt werden minimal um Polymerisation Unregelmäßigkeiten zu vermeiden.
    3. Verwendung gekühlt (-20 ° C) 1.000 µL Pipettenspitzen 300 µL des BME auf jeder Aorta Ring hinzufügen und gleichmäßig verteilen die BME um den Brunnen.
    4. Die eingebetteten Aorta Ringe die befeuchteten Inkubatoren für 30 min. zurück
    5. Entfernen Sie die Platten mit dem eingebetteten Aorten Ring aus den befeuchteten Inkubatoren und langsam hinzufügen 1.000 µL EGM (vorbereitet und aufgewärmt am Schritt 1.2.1) indem man die Pipette Tipp gegen die Wand der Kultur gut.
      Hinweis: Direkt Pipettieren der Medien auf die BME stören der polymerisierten BME und kontinuierliche Endothel Netzwerkentwicklung behindern kann. Verwenden Sie eine entsprechende Mehrkanal-Pipette, falls verfügbar.
    6. Nach 24 h, 1.000 µL EGM zu entfernen und ersetzen Sie durch 1.000 µL EBM-FBS in Schritt 1.2.2, wieder durch Pipettieren langsam gegen die Seite der Kultur gut vorbereitet.
  6. Pflegen die Aorta Ring-Assay indem 500 µL EBM-FBS mit 500 µL frische EBM-FBS (37 ° C) jeden 48 h.
    Hinweis: Siehe secTion 2 der MSC Kultur Expansion am selben Tag als Aorten Ring Assay Einrichtung starten. Dadurch wird sichergestellt, dass MSCs bereit für Kokultur, sind wenn die endotheliale Netzwerke bereit sind.
  7. Verwenden die Hellfeld-Mikroskopie Aorten Ring Assayentwicklung endotheliale Netzwerk folgen (siehe Abbildung 1 als Referenz für optimale Netzentwicklung). Sobald der endothelialen Netzwerke Aspekt ist wie in Abbildung 2 gezeigt, fahren Sie mit der Einrichtung der Aorta Ring Assay-MSC Ko-Kulturen (Abschnitt 3). Finden Sie unter Schritt 4.1 für weitere Details von imaging-die endotheliale Netze.

2. Gewebekultur

  1. Prepare Stammlösungen der Gewebekultur Medien.
    1. Kultur FTM HUCPVCs (vorher festgelegten, n ≥ 3 unabhängige Linien für jeden) 30 und handelsüblichen BMSCs in Alpha-MEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S.
    2. Die Medien mit 0,2 µm Pore Größe Filter Flaschen sterilisieren.
    3. Speichern die vorbereiteten Medienlösungen bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen.
  2. Pflegen FTM HUCPVC und BMSC Kulturen in feuchte Inkubatoren und Passage bei 70-80 % Konfluenz von Phasenkontrastmikroskopie bestimmt. Nutzung entsprechende Mengen an Medien für die Größe des Gewebes Kulturschale verwendet (d.h. 10 mL in einer 10 cm Petrischale). Verwenden Sie diese Kulturbedingungen für den Erhalt und die MSCs Passagierung.
  3. Distanziert MSC Monolagen für Passagierung oder Aorten Ring Assay-MSC Co Kulturen mit einer Dissoziation Enzymlösung (4 mL/10 cm Teller) und inkubieren Sie in die feuchte Inkubatoren für 3 min. sorgen Loslösung der Zellen mit Hellfeld Mikroskopieren; inkubieren für eine zusätzliche 1-2 min ggf..
  4. Übertragen der dissoziierten Zellen in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 400 X g für 5 min.
  5. Aspirieren den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet und Aufschwemmen der Zellen in 1 mL eine geeignete Kulturmedien (Alpha-MEM komplette Medien für Passagierung Zellen oder EBM-FBS für Aorten-Ring Assay/MSC Ko-Kulturen) zum zählen von Zellen Zähler.

3. Vorbereitung der Aorta Ring Assay/MSC Ko-Kulturen

  1. Samen 10 4 MSCs auf jedem eingebettet Aorten Ring (9.000 Zellen/cm 2 / 12-Well Platte). Basierend auf der Anzahl der Aorta Ring Assays, Pre-Fleck die MSCs mit lebensfähigen, nicht übertragbaren Fluoreszenzfarbstoff. Halten Sie mindestens drei Brunnen der Aorta Ringe ohne MSCs für eine Kontrollgruppe.
    1. 10 5 MSCs/mL EBM-FBS-Medien zu beflecken, fügen 2,5 µL lebensfähigen, unübertragbare fluoreszierenden Farbstoff/mL (5 µM) in einem 15 mL-Tube und in den befeuchteten Inkubator für 30 min. sanft Mediamix das Rohr auf halbem Weg durch die Inkubation.
    2. Folgenden die 30 min Inkubation, 1 Volumen von frischen EBM-FBS zu den gefärbten Zellen hinzufügen und drehen sich mit 400 X g für 5 min.
    3. Den Überstand zu entfernen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL der EBM-FBS-Medien. Bestätigen erfolgreiche Färbung der die Fluoreszenz-Mikroskopie mit MSCs.
  2. Der aortalen Ring-haltigen Platten aus den befeuchteten Inkubator und entfernen 500 µL EBM-FBS aus jedem Brunnen.
  3. Samen vorsichtig 10 4 MSCs in 500 µL EBM-FBS auf jedem eingebetteten Aorten Ring durch gleichmäßig um die endotheliale Netze pipettieren. Gleichmäßige Verteilung durch sanft schütteln die Kultur-Platte zu gewährleisten.
    1. Fügen Sie zusätzliche EBM-FBS um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen der Medien auf die Aorta Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen 1.000 µL.
  4. Fluoreszenz-Mikroskopie verwenden, um das Eindringmittel gekennzeichneten MSCs in die Aorta Ring-Assay visualisieren.

4. Mikroskopie

  1. Verwendung Hellfeld Mikroskopie, die Ratte endotheliale Netze vor der Aorta Ring Assay/MSC Bild Co Kulturen für die Basislinie (Tag 0) Messungen der endothelialen Netzwerk-Eigenschaften (z.B., Netzwerk Länge, Netzwerk Schleifen). Bild 4-Quadranten pro Bohrloch aus der Aorta Ring zum am weitesten Abschnitt der endothelialen Netzwerk in diesem Quadranten.
    1. Bild der Aorta Ring Netze nach der Aortenklappe Ring Kulturen Co Assay/MSC auf 3, 5 und 7 Tagen. Verwenden Sie diese Bilder, um die MSC-Wirkung auf die endotheliale Netzentwicklung zu quantifizieren.
  2. Fluoreszenz-Mikroskopie bereits beschriftete MSCs in der Aorta Ring Test Image verwenden.
    1. Folgenden 24 Stunden der Aorta Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen verwenden Fluoreszenz-Mikroskopie, um MSC Homing, Dehnung und Integration mit der endothelialen Netzwerken zu visualisieren. Überschneiden sich die fluoreszierenden Bilder von MSCs mit Hellfeld-Bilder der Endothelzellen, die NS1 der beiden Zelltypen zu beobachten.
    2. Bild der MSCs innerhalb der entwickelten endotheliale Netze proximalen Aorta Ring Gewebe lokalisiert, und die MSCs lokalisiert im neu entstehenden Netzwerke distale Aorta Ring Gewebe ( Abbildung 2).

5. Flow Cytometry und qPCR

  1. einen Tag vor der Wehre die Aorta Ring endotheliale Netze, tauen eingefrorene Dispase bei 4 ° C O/N. Abschnitt 5.3 ist identisch für Durchflusszytometrie und qPCR.
  2. 50 mL Dispase und 50 mL 0,5 % Trypsin in 37 ° C Perle oder Wasserbad warm.
  3. Rufen die Zellen für die Analyse aus der Aorta Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen.
    1. Nach 1 Woche der Aorta Ring Assay/MSC Kokultur, entfernen die Nährmedien und fügen Sie 1 mL der Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) langsam zu jeweils gut 3 min und zu entfernen. Wiederholen Sie diese waschen zweimal mehr.
    2. Fügen Sie 800 µL vorgewärmt Dispase in jede Vertiefung und brüten in den befeuchteten Inkubatoren für 15 min.
    3. Entfernen Sie die Platten aus den befeuchteten Inkubatoren und Dispase durch Pipettieren (5-10 X) um zu brechen die BME auszusetzen und übertragen Sie den Inhalt jedes gut in separaten 15 mL Röhrchen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 5.3.3 wieder mit frischen vorgewärmten Dispase bis keine Reste ist BME in der Kultur gut beobachtet. Fügen Sie 1 Volumen von PBS ergänzt mit 3 % FBS, Dispase-Zellsuspension, die Dispase zu inaktivieren. Entfernen Sie die Aorta Ringe schwebend in die Zellsuspension mit Pipettenspitzen.
    5. Spin Zellsuspensionen bei 400 X g für 5 min. Überstands vorsichtig entfernen, so dass 3 mL Zellsuspension in der 15 mL Tube.
      Hinweis: Eine offensichtliche, solide Pellet möglicherweise nicht sichtbar aber Zellen und BME vorhanden sind.
    6. 3 mL vorgewärmte 0,5 % Trypsin hinzufügen die Zellsuspension und kräftig Aufschwemmen (5-10 X durch Pipettieren) Zellen. Die trypsiniert Zelle Lösungen in den befeuchteten Inkubatoren für 10 min. inkubieren
    7. Trypsiniert Zellsuspensionen vom befeuchtete Inkubatoren und fügen 6 mL PBS ergänzt mit 3 % FBS und erneut ein paar Times. Drehen der Zellsuspensionen 400 X g für 5 min.
    8. Sorgfältig alle überstand, verlassen die Zelle Pellet in das Rohr zu entfernen und erneut Zellen in 1 mL PBS ergänzt mit 3 % FBS in jedem Röhrchen.
    9. Filtern die 1 mL Zellsuspension mit einem 70 µm Zelle Sieb, aggregierte Zellen und passives BME aus der Zellsuspension entfernen. Zählen der Zellen in 1 mL Zellsuspension Zelle Zähler.
  4. Durchflusszytometrie Zellen vorbereiten.
    1. Inkubation der Zelle Suspensionen (10 5 Zellen in 200 µL PBS ergänzt mit 3 % FBS) mit Fluorophor konjugiert (FITC oder APC) primären Antikörper (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) Konzentration = 01:40) bei 4 ° C für 30 min lichtgeschützt.
      Hinweis: Durchflusszytometrie für MSCs wurde von Hong Et Al., 2013 28 optimiert. Ein Minimum von 10.000 Zellen ist für genaue Messwerte erforderlich.
    2. Nach 30 min Inkubation der Zellen in 2 mL PBS ergänzt mit Zentrifuge (400 X g, 5 min) und 3 % FBS Aufschwemmen.
    3. Halten Sie Zellen bei 4 ° C bis zum Analysieren von Durchflusszytometrie (mindestens 1 x 10 4 Veranstaltungen) innerhalb von 1 h vor Licht geschützt. Die gating-Strategie finden Sie ergänzende Abbildung1. Menschlichen MSCs mit Anti-TRA-1-85 (APC) sortieren (Konzentration: 01:40 und in 0,5 % FBS/PBS) und Sortieren von Zellen in 350 µL Zelle Lysis Puffer für qPCR Analyse.
      Hinweis: Lysierten Zellen können bei-80 ° C bis zu 3 Monate für zukünftige qPCR Analyse gespeichert werden.
  5. QPCR Analyse der Zellen vorbereiten.
    1. Die RNA aus lysierten Zellen mit spaltenbasierten RNA-Isolierung-Kits zu isolieren und die RNA-Konzentration und Qualität bestimmen.
    2. Vorbereiten cDNA von bis zu 5 µg RNA pro 100 µL Reverse Transkriptase Reaktion. Einen Vorverstärkung Schritt ausführen, wenn die RNA-Ausbeute gering ist (< 10 ng/µL). Verwendung von weniger als 100 ng RNA führt zu einer hohen Rate der falsch negativen.
      Hinweis: Die cDNA-Vorlagen können bei-20 ° C zur weiteren Analyse für bis zu 4 Monate gelagert werden.
    3. Führen die qPCR mit Angiogenese Ausdruck Profiler Arrays zum Erkennen von Änderungen in der Genexpression. Verwendung 5 ng cDNA pro Reaktion (40 Zyklen, 60 ° C Temperatur Glühen/Verlängerung). Ausdrückliche Falte Änderung des Ausdrucks im Vergleich zu undifferenzierten MSC abgeleitet cDNA Proben. Führen Sie die entsprechenden Negativkontrollen (Aorten Ring ohne menschliche MSCs).

6. Netzwerk-Quantifizierung folgende Aorten Ring Assay/MSC Ko-Kulturen

  1. Download Bildbearbeitungssoftware wie ImageJ zusammen mit Angiogenese Analyzer Plugin 31.
  2. Die endotheliale Netzwerk Aufnahmen zu importieren und öffnen Sie mit Hilfe der Software.
  3. Konvertieren Bild Waage basierend auf den Spezifikationen des Mikroskops verwendet.
  4. Verwenden eine geradlinige Werkzeug, um die radiale Netzwerk Wachstum zu messen.
  5. Zählen die endotheliale Netzwerk Schleifen mit dem Zelle-Zähler-Tool (Schleifen mit mindestens 4 Seiten sollten quantifiziert).
  6. Für zusätzliche Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften, verwenden die Angiogenese Analyzer-Plugin oder andere ähnliche Plugins master Segmente analysieren Gesamtlänge Segment, total Netzwerkbereiche und Anzahl der Kreuzungen. Verwenden Sie das Tool unscharfe Maske um zu verschwimmen Aorten Ring Gewebe und leeren Räume, um falsche positive Berechnungen zu vermeiden.
  7. Übertragen die Werte auf eine Statistik Programm und Graph endotheliale Netzwerkeigenschaften nach der Aortenklappe Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen.

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Ergebnisse

Die schematische Arbeitsablauf für die Festlegung der Aorta Ring/MSC Kokultur Assay ist in Abbildung 1gezeigt. Die wichtigsten Schritte sind: Ratte Aorta Isolation, schneiden und Einbettung der Aorta Ringe, Überwachung der Endothelzellen sprießen und Netzentwicklung, und abschließend Etikettierung und die MSCs verwalten. Die Zeitachse der endothelialen Netzwerkanalyse umreißt das Fenster für die Analysen für jede Periode der Co Kultivierung möglich: Tag 1, 5 ...

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Diskussion

Es gibt mehrere kritische Phasen beim Aufbau eines erfolgreichen Aorten Ring Assays MSC Kokultur Experiment. Erstens sind die wichtigsten Schritte beim isolieren und Aorta-Schnitt: 1) erhalten ausschließlich die thorakale Segment der Aorta; (2) vorsichtig entfernen, verzweigten Blutgefäße, Bindegewebe und Fettgewebe und; (3) schneiden sogar Abschnitte der Aorta (~ 1 mm), Variabilität zwischen einzelnen Assay zu begrenzen. Zweitens ist die erfolgreiche Einbettung der Aorta Ringe in BME für dieses Tests von entscheidender ...

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Offenlegungen

Dr. Clifford L. Librach ist Mitinhaber des Patents: Methoden der Isolation und der Verwendung von Zellen aus ersten Trimester Nabelschnur Gewebe. In Kanada und Australien gewährt.

Danksagungen

Die Autoren danken den folgenden Mitarbeiter und Personal Forschung: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai und Sarah Laronde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alpha-MEMGibco12571071Für FTM-, HUCPVC- und BMSC-Nährmedien.
APC-konjugiertes Anti-Human-TRA-1-85R& D SystemsFAB3195AHumanspezifischer Zellmarker für die Durchflusszytometrie und Zellsortierung
Basalmembranextrakt (BME) (Matrigel)Corning354234Für die Einbettung der Aorta
Bullet-KitLonzaCC-3162Enthält: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)humaner epidermaler
Wachstumsfaktor (hEGF); Vaskulär
Endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF); R3-
insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbinsäure; Hydrocortison;
humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fötales Rinderserum
(FBS). Erforderlich für die Vorbereitung EGM
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925Für die Färbung von MSCs, Grün wird optimal von MSCs aufgenommen
CKX53 KulturmikroskopOlympusFür die Hellfeldbildgebung der Entwicklung endothelialer Netzwerke
Countess automatisierter ZellzählerInvitrogenC10227Zellzählung für MSC-Kulturen, Durchflusszytometrie und qPCR-Dispase
StemCell technologies7923Zur Dissoziation von Aortenring-MSC-Cokulturen (Vorwärmung bei 37 > C)
Sterile EinwegskalpelleVWR21909-654Zum Durchtrennen der Aorta
Dulbecco's phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD8537PBS. 1X, ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid
Endotheliale Basalmedien (EBM)LonzaCC-3156Basalmedien für die Kultivierung von Aortenring-Assay-MSC-Cokulturen (warm bei 37 &°; C vor dem Gebrauch). Erforderlich für EGM- und EBM-FBS-Ethanol
, 70 %, Biotechnologie-QualitätVWR97064-768Zur Sterilisation von Oberflächen
EVOSLife TechnologiesHauseigenes Fluoreszenzmikroskop zur Verfolgung der MSC-Migration und -Integration
Fötales Rinderserum (FBS) (Hyclone)GE HealthcareSH3039603Serumkomponente des Zellkulturmediums
FITC-konjugierter Anti-CD31-AntikörperBD558068Humaner Endothelmarker für die Durchflusszytometrie
FITC-konjugierter Anti-CD146-AntikörperBD560846Humaner Perizytenmarker für die Durchflusszytometrie
PinzetteAlmedic 7727-A10-704Zum Reichen von Rattengewebe. Kann jede ähnliche Pinzette verwenden
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175-0941X Ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid
HERAcell 150i CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific51026410Für die Inkubation von Zellen
Menschliche Angiogenese RT2-Profiler PCR-ArrayQiagenPAHS-024ZSpezifisch für den Menschen und enthält Primer für 84 Gene, die an der Angiogenese beteiligt sind. Jede Vertiefung ist 1 Primer-Reaktion
ImageJOpen-Source-Bildverarbeitungssoftware. Angiogenesis Analyzer Plugin
LSR IIBDUHN SickKids FC Facility erforderlich. Für die Durchflusszytometrie.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Einrichtung. Für die Zellsortierung.
Penicillin/StreptomycinGibco15140122Antibiotische Komponente für Puffer und Zellkulturmedium
RNeasy Mini KitQiagen74104Für die RNA-Aufreinigung. Enthält Zelllysepuffer
RT2Easy First Strand KitQiagen330421Zur Vorbereitung von cDNA für die qPCR
RT2PreAMP cDNA-SynthesekitQiagen330451Voramplifikation von cDNA bei geringer Ausbeute
Chirurgische Schere FineScience Tools14059-11Zum Schneiden von Haut, Muskeln und Aorta
Sterile GazeVWR3084Zum Befeuchten und Sterilisieren von Brustfell
TrypleEThermo Fisher Scientific12605036MSC Dissoziationsenzym vorwärmen bei 37 > C
0,2 μ m PorenfiltrationseinheitThermo Fisher Scientific566-0020Zur Sterilisation von Gewebekulturmedien
0,25 % Trypsin/EDTAGibco25200056Für die Zelldissoziation bei 37 & Grad vorwärmen; C
10 cm GewebekulturschalenCorning25382-428Zum Reinigen und Schneiden von Aorten- und MSC-Zellkulturen
12 Well-ZellkulturplattenCorning-Sigma AldrichCLS3513Zum Einrichten von Aortenring-Assays-MSC-Cokulturen
15-ml-RöhrchenBD Falcon352096Für allgemeine Gewebekulturverfahren
70 & mu; m Zell-SiebFisherbrand22363548Zur Sicherstellung einer Einzelzellsuspension vor der Durchflusszytometrie oder Sortierung

Referenzen

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