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Methodenartikel

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

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DOI:

10.3791/56089

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13. September 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Miami, 2Department of Medicine, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Visualisierung von Insulin Exozytose in intakte Inseln mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein. Isolierte Inseln sind mit Adenoviren Codierung gekoppelt an die Vesikel Fracht Neuropeptid Y pHluorin infiziert. Dies ermöglicht für den Nachweis von Insulin Granulat Fusion Veranstaltungen konfokalen Mikroskopie.

Zusammenfassung

Insulin-Sekretion spielt eine zentrale Rolle in Glukose Homeostasis unter normalen physiologischen Bedingungen, wie bei Krankheit. Aktuelle Ansätze für Insulin Granulat Exozytose studieren entweder Elektrophysiologie oder Mikroskopie gekoppelt, um die Expression von fluoreszierenden Reporter verwenden. Aber die meisten dieser Techniken wurden optimiert für klonale Zelllinien oder erfordern abkoppelt pankreatische kleinen Inseln. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier vorgestellte Methode für Real-Time Visualisierung von Insulin Granulat Exozytose in intakten Pankreas Inseln. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Virusinfektion isolierte pankreatische Inselchen mit Adenoviren, die ein pH-Sensitive grünes fluoreszierendes Protein (GFP), pHluorin, gekoppelt an Neuropeptid Y (NPY) kodiert. Zweitens, beschreiben wir die konfokale imaging von Inselchen fünf Tage nach Virusinfektion und Granulat Insulinsekretion zu überwachen. Kurz, die infizierten Inselchen auf ein Deckglas auf einem bildgebenden Kammer gesetzt und abgebildet unter eine aufrechte Laserscanning-confocal Mikroskop während wird kontinuierlich mit extrazelluläre Lösung, enthält verschiedene Reize durchblutet. Konfokale Bilder über 50 µm der Insel sind als Zeitraffer-Aufnahmen mit einem schnell-Resonanz-Scanner erworben. Die Verschmelzung von Insulin Granulat mit der Plasmamembran kann im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Verfahren auch erlaubt die Prüfung einer Batterie von Reizen in einem einzigen Experiment ist kompatibel sowohl mit Maus als auch mit menschlichen Inselchen und ist kombinierbar mit verschiedenen Farbstoffen für funktionelle Bildgebung (z.B. Membran potenzielle oder zytosolischen Kalzium Farbstoffe).

Einleitung

Insulin wird von den Betazellen der Bauchspeicheldrüse Insel produziert und es ist ein wichtiger Regulator der Glukose-Stoffwechsel-1. Tod oder Dysfunktion der Betazellen stört Glukose Homöostase und führt zu Diabetes2. Insulin wird in dichten Kern-Granulat, das in einem Ca2 +freigesetzt werden verpackt-abhängigen Weise3. Aufklärung, wie Insulin Granulat Exozytose reguliert wird ist wichtig zu verstehen, was bestimmt Insulinsekretion und eröffnet neue Wege für die Identifizierung der neue therapeutische Targets für die Behandlung von Diabetes.

Exozytose von Insulin wurde durch elektrophysiologische Ansätze wie Membran Kapazität Messungen und mikroskopische Ansätze in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ausgiebig untersucht. Membran Kapazität Messungen haben gute zeitlichen Auflösung und einzelne Zelle Aufnahmen erlauben. Jedoch Änderungen in der Kapazität reflektieren die Oberfläche Nettoveränderung der Zelle und nicht einzelnen Fusion Ereignisse erfassen oder Insulin Granulat Fusion aus anderen Nichtinsulin sekretorischen Vesikel3zu unterscheiden. Mikroskopisch kleine Ansätze, wie ein zwei-Photonen oder vollständige interne Reflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie in Kombination mit fluoreszierenden Sonden und Vesikel Ladung Proteine, geben Sie weitere Details. Diese Techniken steht Einzelveranstaltungen und auch die Pre- und Post-steht Phasen zu erfassen und können für das Studium steht Muster in den Bevölkerungen der Zellen3verwendet werden.

Fluoreszierende Reporter kann von drei Arten: 1) extrazelluläre, 2) zytoplasmatischen oder (3) vesikuläre. (1) extrazelluläre Reporter sind polar Tracer (z.B. Dextrans, Sulforhodamine B (SRB), Luzifer gelb, Pyranine), die durch die extrazelluläre Milieu4eingeführt werden können. Die Verwendung von polar Tracer ermöglicht die Untersuchung der Fusion Pore in einer Bevölkerung der Zellen und nimmt verschiedene interzelluläre Strukturen wie Blutgefäße. Sie berichten jedoch nicht auf Vesikel Ladung Verhalten. (2) zytoplasmatischen Reporter sind fluoreszierende Sonden gekoppelt an Membran-assoziierte Proteine, die Gesicht Zytoplasma und Andocken und Exozytose beteiligt sind. Beispiele hierfür sind Mitglieder der löslichen N- Ethylmaleimide-Sensitive Faktor Anhaftung Rezeptor (SNARE) Proteinfamilie, die erfolgreich eingesetzt in den Neurowissenschaften für das Studium der Neurotransmitter-Freisetzung-5. Solche Proteine haben mehrere Bindungspartner und sind nicht Insulin-Granulat bestimmte. (3) vesikuläre Reporter sind fluoreszierende Sonden verschmolzen, vesikuläre Ladung Proteine, die für die Untersuchung von Fracht-spezifische Vesikel Verhalten ermöglichen. Insulin-Granulat spezifische Ladung Proteine sind Insulin, c-Peptid und Inselchen Amyloid Polypeptid NPY u.a.6,7. NPY ist nur in Insulin mit Granulat und ist zusammen mit Insulin, so dass es einen hervorragenden Partner für eine fluoreszierende Reporter8veröffentlicht.

Die Verschmelzung von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zu NPY hat zuvor eingesetzt, um verschiedene Aspekte der Exozytose in neuroendokrinen Zellen, wie die Anforderungen der spezifischen Synaptotagmin Isoformen9,10 zu studieren und wie die zeitlicher Verlauf der Freigabe hängt von dem Aktin-Zytoskelett und Myosin II11,12. In dieser Studie wählten wir pHluorin als fluoreszierende Reporter, die eine veränderte GFP, die nicht fluoreszierenden ist bei den sauren pH-Wert im Inneren Rumpfkern Granulat wird aber hell fluoreszierende bei Kontakt mit der extrazellulären pH-neutral-13. Reife Insulin Granulat haben einen sauren pH-Wert unter 5,5. Sobald das Untermodul "mit der Plasmamembran und öffnet verschmilzt, ist die extrazelluläre Nullph von 7,4, erlaubt die Verwendung von pH-Sensitive Proteine pHluorin als Reporter7,14seine Ladung ausgesetzt.

Angesichts der Sensibilität der pH-Wert des pHluorin und die selektive Expression von NPY in Insulin-Granulat kann die NPY-pHluorin Fusion Konstrukt verwendet werden, verschiedene Eigenschaften von Insulin Granulat Exozytose zu studieren. Die virale Lieferung des Konstrukts Fusion sorgt für hohe Transfektion Effizienz und arbeitet an primären Betazellen oder Zell-Linien sowie auf isolierten Inseln. Diese Methode kann auch als Richtlinie verwendet werden, für das Studium in einer anderen Zelle Art mit NPY-haltige Vesikel Exozytose. Es kann auch mit einer transgenen Mausmodell Studie zu Auswirkungen von bestimmten Bedingungen (Niederschlägen, Überexpression, etc.) auf Exozytose kombiniert werden. Diese Technik wurde zuvor verwendet, um räumliche und zeitliche Muster der Insulinsekretion Granulat in Beta-Zell-Populationen in menschlicher Inselchen15zu charakterisieren.

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Protokoll

der Tierethik Ausschuss von der University of Miami hat alle Experimente angenommen.

1. virale Infektion der intakten isolierten menschlichen oder Maus Pankreas Inselchen

  1. Insel-Kultur: bereiten Sie die kleine Insel Kulturmedien: Connaught medizinische Forschung Labors (CMRL) 1066, 10 % (V/V) FBS und 2 mM L-Glutamin.
    1. Menschlichen pankreatische kleinen Inseln werden von der integrierten Islet Vertriebsprogramm (NIDDK, NIH) erhalten. Nach der Ankunft transfer der Inseln (~ 500 Inselchen Äquivalente) auf 35 mm nicht-Zellkultur Petrischalen mit 2 mL CMRL Kulturmedien bei 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 für 24 h vor der Virusinfektion behandelt.
    2. Maus Pankreas Inseln absperrbar nach vorher festgelegten Protokolle 16. Nach Isolierung, Kultur ~ 200 Inselchen Entsprechungen im Gewebe Kultur 35 mm Petrischalen mit 2 mL CMRL Kulturmedien bei 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 für 24 h vor der Virusinfektion behandelt.
      Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung transgener Mäuse mit GFP oder YFP Reportern äußerte auf kleinen Inseln zur Vermeidung von Überschneidungen der Fluoreszenz mit NPY-pHluorin.
  2. Virus Vorbereitung
    Hinweis: die NPY-pHluorin Fusion wurde in die pcDNA3 Vector 10 kloniert und subcloned in einem adenoviralen Vektor für adenoviralen Produktion [Adenovirus Serotyp 5 (DE1/E3)] durch einen rekombinanten Adenovirus produzierendes Unternehmen. Das Virus wurde regelmÄÑig und bei-80 ° c gelagert Die virale Lager erfolgt durch das Unternehmen bei Titer von 10 12 10 13 Viruspartikel (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. Für in-vitro- Inselchen Infektion, Einsatz 10 6 PFU/mL, was eine ungefähre Multiplizität der Infektion (MOI) von rund 2 (siehe Diskussion für Details)
  3. Virusinfektion des Pankreas Inselchen
    Achtung: Arbeiten mit Adenoviren erfordert Biosafety Level 2 (BSL2) Verfahren und Zertifizierung. Überprüfen Sie mit dem institutionellen Biosafety Officer für Beratung und Schulung auf BSL2 Verfahren.
    1. Mensch/Maus Inselchen vorbereiten, wie oben beschrieben.
    2. 5-10 µL Lager Virus hinzufügen jede 35 mm Petrischale mit Mensch/Maus Inselchen in 2 mL CMRL Nährmedien (mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin).
      Hinweis: Stellen Sie die Lautstärke des Virus nach der viralen Titer verwendet, wie es von der Firma Datenblatt.
    3. Kultur der Inseln in Virus-haltigen Medien bei 37 °C/5% CO 2 für 24 Std.
    4. Nach 24 h, aspirieren Sie die Virus-haltigen Medien und ersetzen durch 2 mL CMRL Nährmedien (mit 10 % FBS und 2 mM L-Glutamin).
    5. Kultur der Inseln für 4-6 Tage bei 37 °C/5% CO 2, Austauschen der Medien alle 3 Tage.
    6. Nach 4 - 6 Tagen Kultivierung, erwarten rund 30 % der Inselzellen, angesteckt zu werden. Inselchen können dann für live-imaging-Experimente verwendet werden.

2. Confocal Imaging von infizierten Inselchen

Hinweis: beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Materialien und Ausrüstung für die konfokale Bildgebung erforderlich.

  1. Reagenz Vorbereitung und Versuchsaufbau
    1. bereiten extrazelluläre Lösung: Fügen Sie 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % BSA, pH 7,4, steril gefiltert.
      Hinweis: Dieser Puffer wird normalerweise ohne Glukose vorbereitet und kann bis zu 1 Monat bei 4 ° C gelagert werden. Glukose wird am Tag des Experiments zu erreichen die gewünschte Endkonzentration hinzugefügt.
      1. Prepare basalen Glukose (3 mM) Medium: 50 mL extrazelluläre Lösung 75 µL 2 M Glukose Bestand hinzufügen.
      2. Hyperglycemic (16 mM) Medium: extrazelluläre Lösung 50 mL 400 µL 2 M Glukose Bestand hinzufügen
    2. Zusätzliche Anreize (z.B., KCl oder Adenosintriphosphat (ATP)) in extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose verdünnen.
    3. Vor dem Start eines Experiments vorbehandeln Deckgläsern mit Poly-D-Lysin indem das Deckglas für 1 h 30 µL Poly-D-Lysin-Lösung (1 mg/mL) hinzufügen und gründlich spülen es mit H 2 O.
      Hinweis: Die Poly-Lysin beschichtet Deckgläsern können bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gespeichert werden.
    4. Mindestens 1 h vor dem Experiment, mit einer 1-mL-Pipette, übertragen die Inseln auf einer 35-mm-Petrischale, extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose enthält. Halten Sie die kleinen Inseln auf 37 ° C und 5 % CO 2.
      Hinweis: Bei Bedarf können die Plasmamembran in diesem Arbeitsschritt beschriftet werden. Fügen Sie 2 µM di-8-ANEPP Farbstoff um die Plasmamembran zu beschriften hinzu, die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Inkubieren Sie die Inseln in Farbstofflösung für 1 h bei 37 °C/5% CO 2. Der Plasmamembran Farbstoff kann begeistert sein, auf 488 nm und entdeckt bei 620 nm.
    5. min vor dem Start ein Experiment, das Deckglas zuordnen der bildgebenden Kammer durch mit Vakuum Silikonfett abdichten. Die bildgebende Kammer zur imaging Plattform zu beheben. Mit einer Pipette legen Sie 20-30 Inselchen auf Poly-D-Lysin-behandelten Bereich das Deckglas und lassen die kleinen Inseln an der Oberfläche für 20 min. haften
      Hinweis: Es ist wichtig, nicht das Deckglas zur Vermeidung von Beschädigungen der Insel vollständig trocknen lassen.
    6. , Während die kleinen Inseln das Deckglas einhalten bereiten die Perfusion System durch gründlich mit Wasser spülen. Fügen Sie jede Lösung auf einen anderen Kanal: 3 mM Glukose (Kanal 1), 16 mM Glukose (Kanal 2), 16 mM Glukose mit 100 µM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 10 µM Forskolin (Kanal 3), 25 mM KCl 3 mM Glukose (Kanal 4), 10 µM ATP in Glukose () 3 mM Kanal 5). Entfernen Sie alle Luftblasen aus dem System durch jeden Kanal separat öffnen und die Lösung fließen zu lassen, für ein paar Minuten, und stellen Sie sicher, dass die Strömung konsistent (0,5 mL/min) und der Schlauch ist nicht undicht.
    7. Verbinden die einzelnen Inline-Lösung Heizung der Perfusion Ablaufrohr ins freie ab und stellen Sie die Temperatur des Puffers abfließende auf 37 ° c
    8. Bereiten die Saugpumpe. Alle Luftblasen aus dem System entfernen, und stellen Sie sicher, dass die Strömung und der Schlauch ist nicht undicht.
    9. Sobald die Inseln an die Oberfläche Deckglas haften sanft Auffüllen der bildgebenden Kammer die extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Zu vermeiden, waschen Sie die Inseln weg von der Oberfläche des Deckglases.
    10. Legen Sie die Image Plattform mit den Inseln auf den Mikroskoptisch und verbinden Sie es mit der Perfusion System und Saugpumpe.
    11. Wiederum auf den Fluss und ständig durchspülen der Inseln mit der 3G extrazelluläre Lösung. Das System ist nun bereit für die konfokale Bildgebung.
  2. Confocal Imaging
    1. Suchen Sie die kleinen Inseln im Feld Mikroskop mit geringerer Vergrößerung. Nachdem auf den kleinen Inseln konzentriert, wechseln Sie zu höheren Vergrößerung Ziele (z.B., 63 X Wasser eintauchen Ziel (63 X / 0.9 NA)).
    2. Den Erwerb mit Software (Table of Materials) öffnen und die resonante Scanner-Modus zu aktivieren.
    3. Den XYZT-imaging-Modus wählen und konfigurieren Sie die Übernahme Einstellungen wie folgt:
      1. biegen Sie auf die Argon Laser 488 nm Laser Linie und passen Sie die Leistung des Lasers zu 50 % bei pHluorin Erregung.
      2. Sammeln Emission bei 505-555 nm.
      3. Wählen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixel. Drücken Sie die " Live " Schaltfläche Starten Sie Imaging und passen den Gewinn (typische Gewinn beträgt rund 600 V).
      4. Set, Beginn und Ende der Z-Stapel: konzentrieren Sie sich auf der Spitze der Insel und wählen Sie " Begin " und wechseln zur letzten Ebene, die konzentriert werden, und wählen Sie " Ende ". Verwenden einer Z-Schrittweite von 5 µm. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der konfokalen Flugzeuge.
      5. Legen Sie das Zeitintervall für den Erwerb von jedem Z-Stapel in der Nähe von 1,5-2 s und wählen Sie die Option " erwerben bis " für die kontinuierliche Bildgebung.
      6. Drücken Sie den " Start " Schaltfläche "ini"tialize.
    4. Verwenden verschiedene Protokolle Stimulation induzieren Granulat Exozytose Vorrichtung die Inseln mit den gewünschten reizen. Stimulation-Protokolle können angepasst werden die gewünschten wissenschaftlichen Zweck (siehe unten).
  3. Stimulation Protokolle
    Hinweis: In jedem Protokoll Stimulation beginnen, durch die Aufnahme von mindestens 2 min Inselchen Hintergrundaktivität während konstante Perfusion mit extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose. Durchspülen Sie mit ein Stimulans für den gewünschten Zeitraum. Die Reihenfolge der Stimulanzien, Dauer der Stimulation sowie Dauer der Aufnahmen kann der gewünschte wissenschaftliche Zwecke angepasst werden. Achten Sie auf Inseln mit extrazelluläre Lösung mit 3 mM Glukose vor Beginn einer neuen Stimulation gründlich waschen. Unten finden Sie die Probe-Stimulation-Protokolle, die verwendet wurden, um die Methode-Fähigkeiten unter Beweis.
    1. Stimulieren mit Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) als Positivkontrolle für pHluorin pH-Wert Empfindlichkeit und Virusinfektion Effizienz ( Abbildung 3): 3 mM Glukose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) in 3 mM Glukose → 3 mM Glukose (2 min)
      Hinweis: im NH 4 Cl Lösung ersetzen NaCl äquimolaren Gesundheitsprüfungen.
    2. Stimulieren Insulin Granulat Exozytose durch Erhöhung der Glukosekonzentration ( Abbildung 5 und Abbildung 6): 3 mM Glukose (2 min) → 16 mM Glukose (15-30 min) → 3 mM Glukose (2 min
      Hinweis: Um mehrere Aktivitätsspitzen sehen, durchspülen der Inseln ständig mit 16 G Lösung für mindestens 15 min.
      Hinweis: Um die Konsistenz der sekretorischen Antworten 17 zu erhöhen, können Benutzer Erhöhung der cAMP Agenten (100 µM IBMX und 10 µM Forskolin) die 3 G und 16 G Lösungen hinzufügen. Dies ändert nicht die zeitlichen Muster der Granulat-Sekretion. 15 und Diskussion siehe.

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Ergebnisse

Der gesamte Workflow von der Technik ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz, Maus oder menschliche Inseln können mit Adenoviren NPY-pHluorin-Codierung infiziert und abgebildet, nach paar Tagen in Kultur unter einem confocal Mikroskop. Als Granulat mit Plasmamembran und offenen Sicherung, eine Zunahme der Fluoreszenz wird beobachtet und quantifiziert werden kann (Abbildung 1). Um festzustellen, ob NPY-pHluorin in der Tat ein geeignet...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt eine Technik, die Exozytose von Insulin-Granulat in Beta-Zellen in intakten pankreatischen kleinen Inseln zu visualisieren von konfokalen Mikroskopie verwendet werden kann. NPY-pHluorin verwendet als der fluoreszierenden Reporter in Adenovirus kloniert um eine hohe Transfektion Effizienz zu gewährleisten.

Obwohl die Methode höchst effizient in unseren Händen war, erfordert möglicherweise einige Änderungen, die in erster Linie von zwei Parametern abhängig sind: (1) ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Marcia Boulina aus der DRI imaging-zentrale Einrichtung für die Hilfe mit den Mikroskopen. Diese Arbeit wurde von NIH Zuschüsse 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 und R56 DK084321 (AC) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopLeica Microsystems, Wetzlar, DeutschlandTCS-SP5enthält LAS AF, die Bildaufnahmesoftware Bildaufnahmekammer
Warner instrumentsRC-26
Plattform für BildkammernWarner instrumentsPH-1
22 x 40 GlasdeckgläserDaiggerbrandG15972H
Vacuum SilikonfettSigmaZ273554-1EA
Mehrkanal-PerfusionssystemWarner InstrumentsVC-8
Einzel-Inline-LösungsheizungWarner InstrumentsSH-27B
TemperaturreglerWarner InstrumentsTC-324C
Peristaltische AbsaugpumpePharmaciaP-1
35 mm Petrischale, nicht mit Gewebekulturen behandeltVWR10861-586
CMRL Medium, kein GlutaminThermoFisher11530037
FBS, hitzeinaktiviertesThermoFisher16140071
L-Glutamin 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl-LösungSigmaS5150
3 M KCl-LösungSigma60135
1 M CaCl2 Sigma21115
1 M MgCl2 SigmaM1028
RinderserumalbuminSigmaA2153
1 M HEPESSigmaH0887
VakuumfilterVWR431098
D-GlukoseSigmaG8270
Poly-D-LysinhydrobromidSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917
, >>Lösung

Referenzen

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