Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Madina Makhmutova; Tao Liang; Herbert Gaisano; Alejandro Caicedo; Joana Almaça

doi:10.3791/56089

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Methodenartikel

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

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DOI:

10.3791/56089

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13. September 2017

Madina Makhmutova¹ , Tao Liang² , Herbert Gaisano² , Alejandro Caicedo¹ , Joana Almaça¹

¹Department of Medicine, University of Miami, ²Department of Medicine, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll für die Visualisierung von Insulin Exozytose in intakte Inseln mit pHluorin, eine pH-Sensitive grün fluoreszierendes Protein. Isolierte Inseln sind mit Adenoviren Codierung gekoppelt an die Vesikel Fracht Neuropeptid Y pHluorin infiziert. Dies ermöglicht für den Nachweis von Insulin Granulat Fusion Veranstaltungen konfokalen Mikroskopie.

Zusammenfassung

Insulin-Sekretion spielt eine zentrale Rolle in Glukose Homeostasis unter normalen physiologischen Bedingungen, wie bei Krankheit. Aktuelle Ansätze für Insulin Granulat Exozytose studieren entweder Elektrophysiologie oder Mikroskopie gekoppelt, um die Expression von fluoreszierenden Reporter verwenden. Aber die meisten dieser Techniken wurden optimiert für klonale Zelllinien oder erfordern abkoppelt pankreatische kleinen Inseln. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hier vorgestellte Methode für Real-Time Visualisierung von Insulin Granulat Exozytose in intakten Pankreas Inseln. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Virusinfektion isolierte pankreatische Inselchen mit Adenoviren, die ein pH-Sensitive grünes fluoreszierendes Protein (GFP), pHluorin, gekoppelt an Neuropeptid Y (NPY) kodiert. Zweitens, beschreiben wir die konfokale imaging von Inselchen fünf Tage nach Virusinfektion und Granulat Insulinsekretion zu überwachen. Kurz, die infizierten Inselchen auf ein Deckglas auf einem bildgebenden Kammer gesetzt und abgebildet unter eine aufrechte Laserscanning-confocal Mikroskop während wird kontinuierlich mit extrazelluläre Lösung, enthält verschiedene Reize durchblutet. Konfokale Bilder über 50 µm der Insel sind als Zeitraffer-Aufnahmen mit einem schnell-Resonanz-Scanner erworben. Die Verschmelzung von Insulin Granulat mit der Plasmamembran kann im Laufe der Zeit verfolgt werden. Dieses Verfahren auch erlaubt die Prüfung einer Batterie von Reizen in einem einzigen Experiment ist kompatibel sowohl mit Maus als auch mit menschlichen Inselchen und ist kombinierbar mit verschiedenen Farbstoffen für funktionelle Bildgebung (z.B. Membran potenzielle oder zytosolischen Kalzium Farbstoffe).

Einleitung

Insulin wird von den Betazellen der Bauchspeicheldrüse Insel produziert und es ist ein wichtiger Regulator der Glukose-Stoffwechsel-¹. Tod oder Dysfunktion der Betazellen stört Glukose Homöostase und führt zu Diabetes². Insulin wird in dichten Kern-Granulat, das in einem Ca^{2 +}freigesetzt werden verpackt-abhängigen Weise³. Aufklärung, wie Insulin Granulat Exozytose reguliert wird ist wichtig zu verstehen, was bestimmt Insulinsekretion und eröffnet neue Wege für die Identifizierung der neue therapeutische Targets für die Behandlung von Diabetes.

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