Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

Zusammenfassung

Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Zusammenfassung

In präklinischen Krankheit Parkinson Forschung unbedingt Analyse des Nigrostriatal Trakt, einschließlich Quantifizierung der dopaminergen Neuronenverlust in der Substantia Nigra. Um die gesamte dopaminergen Neuron Anzahl abschätzen zu können, gilt unvoreingenommene Stereologie mit der optischen Plasmafraktionierer-Methode heute der Goldstandard. Da die Theorie hinter der optischen Plasmafraktionierer Methode Komplex ist und Stereologie schwierig ist, ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen, sind mehrere handelsübliche komplette Stereologie-Systeme, die die notwendige Software enthalten, rein vorhanden für Zelle zählen Gründe. Da Kauf eine spezialisierte Stereologie Setup nicht immer möglich, aus vielen Gründen ist, dieser Bericht beschreibt eine Methode für die stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronale Zelle mit standard-Mikroskopie zählt, einschließlich einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, Z-Ebene) mit imaging-Software und einem Computer für Analyse. Eine schrittweise Erklärung wird zum stereologischen Quantifizierung der optischen Plasmafraktionierer Methode durchführen, und vorprogrammierte Dateien für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen werden zur Verfügung gestellt. Um die Genauigkeit dieser Methode zu bewerten, wurde ein Vergleich mit Daten aus einem handelsüblichen Stereologie Apparat durchgeführt. Vergleichbare Zellzahlen wurden durch dieses Protokoll und dem Stereologie Gerät, so zeigen die Präzision dieses Protokolls für unvoreingenommene Stereologie gefunden.

Einleitung

Die Quantifizierung der neuronalen Zellennummer ist von zentraler Bedeutung in der präklinischen Krankheit Parkinson Forschung zur Bestimmung der Höhe der Neurodegeneration in der Substantia Nigra (SN)^1,2. Die unparteiische stereologischen Schätzung der Zellzahl in einer Region von Interesse gilt als der Goldstandard^3,4,5.

Vor dem Aufkommen der unvoreingenommene Stereologie wurde die Anzahl der Neuronen in den Abschnitten bewertet, durch Manipulation der gezählten Zelle Profile für die Vari....

Protokoll

allen anwendbare internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren folgten. Das Protokoll wurde von den lokalen Behörden bei der Regierung von Unterfranken, Würzburg genehmigt.

1. Verarbeitung von Gewebe und Immunohistochemistry

1. einschläfern Mäuse mit CO ₂ oder einem anderen zugelassenen Methode.
2. Perfuse sechs 12 Wochen alten C56Bl/6N männliche Mäuse Transcardially mit 10 mL 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer 25-G-Nadel und eine Infusionspumpe, gefolgt von 70 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PBS.
   Vorsicht:

Ergebnisse

Die vorgestellte Methode, die geschätzte Anzahl der TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke SN lag zwischen 7.363 und 7.987 Zellen und in der linken SN, verwenden zwischen 7.446 und 7.904 Zellen. So war die durchschnittliche Anzahl von dopaminergen Neuronen (± SEM) 7.647 ± 83 Zellen für die Rechte SN und 7.675 ± 66 für die linke SN. Die berechneten CE für jedes Tier war niedriger als 0,08 (Bereich: 0.0.73.-0.079) (Abbildung 7). Um die Vergleichbarkeit .......

Diskussion

Stereologie beginnt mit Gewebe Verarbeitung. Das serielle Schneiden von SN Gewebe muss sorgfältig durchgeführt werden, zur Verhinderung des Verlusts der Abschnitte während der stereologischen Analyse. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Schritt, eine Hemisphäre zu kennzeichnen, um das Recht von links SN zu unterscheiden, bei der Durchführung der Stereologie. Platzieren ein kleines Loch am oberen Teil der Hirnstamm erzeugt die besten Ergebnisse in der vorgestellten Studie. Darüber hinaus schneiden da die Arbeit mit den An.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Paxinos Mausatlas			Das Mausgehirn George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer	mouse Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyd	Merck	1040051000
saccharose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
Isopentan	Roth	3927.1
Glycerin	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
>phosphatgepufferte Kochsalzlösung Inhaltsstoffe:
Natriumchlorid	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
Kaliumdihydrogenphosphat	Merck	1048731000
Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat	Merck	1065801000
Kaliumchlorid	Merck	1049360500
normales Ziegenserum	Dako	X0907
Rinderserumalbumin	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	Waschmittel
3,3-Diaminbenzidin-tetrahydrochlorid/DAB Tabletten 10mg pH 7,0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Wasserstoffperoxid 30%	Merck	1072090250
Avidin/Biotin Reagenz	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Färbekit, 1:100
Kaninchen Anti Maus Tyrosin Hydroxylase Antikörper	abcam	Ab112	1:1000
biotinylierte Ziegen-Anti-Kaninchen IgG H+L	Vektor Laboratorien	BA-1000	1:100
StereoInvestigator Version 11.07	MBF
BX53	Mikroskop Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ Software	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK OCT	Sakura	4583
Trockeneisgitter
Overlay Plugin	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
Zellzähler-Plugin	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
optischer Disektor Makro	Christopher Ward
C57Bl/6N männliche Mäuse	Charles River, Deutschland
SuperFrost Plus beschichtete Objektträger	Langenbrinck, Deutschland
25G Nadel Mikrolanze 3	BD	300400
REGLO Analoge Infusionspumpe	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator System			StereoInvestigator Version 11.07
BX53 Mikroskop			BX53 Mikroskop
selbstsortierte Stereologie			Visiview
Axiophot2			Axiophot2