Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen und deren Beziehung zu verschiedenen Kompartimenten der Zelle sind wesentliche Instrumente, um ihre Funktionen und möglichen Wechselwirkungen zu verstehen. Super-Auflösung Mikroskopie in Kombination mit Elektronenmikroskopie bietet solche Informationen¹. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie, gefolgt von einzelnen Molekül Rückkehr (GSDIM) ist eine super-Resolution-Mikroskopie-Technologie kompatibel mit einer Vielzahl von organischen und genetisch codierte Fluorophore² und erreicht eine laterale Auflösung bis zu 20 nm ³. die Einbeziehung von Methoden mit höherer Auflösung als standard Beugung begrenzte Mikroskopie verbessert die Genauigkeit der Korrelation^4,5,6. Um die beste Korrelation der Proteinexpression mit einem spezifischen subzelluläre Fach zu erreichen und die Unsicherheit⁷ die Verwendung der gleichen ultradünnen Sektion für Licht- und Elektronenmikroskopie reduzieren wird empfohlen. Unter den verschiedenen speziellen Methoden Tokuyasu Cryo-Abschnitt Protokoll erfordert keine Austrocknung oder Harz einbetten und, darüber hinaus bewahrt die Antigenität von vielen Epitopen und bietet gute Gewebe Ultrastruktur⁸. Mehrere Methoden haben gezeigt, dass die Anwendbarkeit dieser Abschnitte in korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)^4,5,9,10.

Die Zebrafisch Netzhaut ist ein wertvolles Modell, visuelle Entwicklung und menschliche Krankheitsmechanismen angesichts seiner hoch konservierte Struktur und Funktion in Wirbeltieren zu studieren. In bestimmten, retinalen Photorezeptoren Display bestehend aus die gleiche Architektur als Säugetier Photorezeptoren mit einer basalen Synapse, ein Apico-basaler länglichen Kern, clustering von Mitochondrien in dem mehr apikalen innere und eine äußere Segment Membran Festplatten in den meisten apikale Position¹¹. Protein-Lokalisierung, die vielfältigen zellulare Fächer ist zwischen Zebrafish konserviert und menschlich, so dass die Untersuchung der biologischen Funktion des menschlichen krankheitsrelevanten Proteinen^12,13.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Larven Zebrafisch Vorbereitung Netzhaut Proben, die Lokalisierung der mitochondrialen Außenmembran Protein Tom20 korrelative Höchstauflösung Licht- und Elektronenmikroskopie zu lösen. Die Methode basiert auf das Sammeln von Cryo-Abschnitte auf Silizium-Wafer und Erlangung Kontrast durch topographische Informationen nach dem Auftragen einer dünnen Schicht aus Platin hergestellt. Diese Schritte sind klare technische Verbesserungen in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit und Zeit für Experimente. Wir haben vor kurzem die Anwendbarkeit der Methode zur Erkennung von Kernporen und mitochondrialen Proteine in Maus Gewebe¹⁴gezeigt.

alle Experimente wurden gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und von den örtlichen Behörden genehmigt wurden.

1. Vorbereitung der ultradünnen Abschnitte auf Silizium-Wafer

1. Probe Fixierung
   1. Fixativ Lösung mit 0,1 % Glutaraldehyd, 4 % Formaldehyd in 0,1 M Cacodylate Puffer zubereiten.
      Hinweis: Vorsicht! Vorsicht beim Arbeiten mit Glutaraldehyd, Formaldehyd und Cacodylate Puffer, tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung und arbeiten in einer Dampfhaube.
   2. Einschläfern 5 Tage post Düngung (5 Dpf) Zebrafischlarven mit Tricaine (Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate, 0,4 % w/V mit PBS-Puffer (Phosphat-Puffer Kochsalzlösung, pH 7)) wie zuvor beschriebenen ¹⁵.
   3. Fixieren die Larven durch Eintauchen in vorgekühlt Fixativ Lösung auf Eis. Entfernen Sie den Kopf und Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit sanftes Schaukeln.
   4. Sezieren die Augen durch das Gewebe um das Auge mit feinen Pinzette und Skalpell Mikrodissektion (unter einem Feldstecher) in gekühlten Fixativ Lösung auf einem 1 % Agarose-Bett Teller trimmen. Übertragen Sie die Augen zu einem Schlauch mit frisch vorgekühlt Fixiermittel.
   5. Waschen zweimal mit PBS-Puffer (Phosphat-Puffer Kochsalzlösung, pH 7,4) für 5 min jedem Waschgang bei Raumtemperatur (RT).
2. Gelatine Infiltration und Montage
   1. Warm up 15 mL lokales Essen Marke Gelatine 12 % w/V in PB (Phosphatpuffer, 0,1 M pH 7.4) bei 40 ° c entfernen der PBS und Gelatine-Lösung in das Röhrchen mit den Augen. Tippen Sie auf das Rohr sanft um die Gelatine Infiltrate die Probe und 10-30 min bei 40 ° C in einem Thermoblock mit sanft schütteln oder im Wasserbad inkubieren.
   2. Füllen Sie 12 x 5 x 3 mm Silikon oder Polyethylen flache Einbettung Formen mit warmen Gelatine im Wasserbad 40 ° C. Fügen Sie zwei Augen pro Form mit einer Pipette, unter ein Fernglas mit einer Dissektion Nadel richtig ausrichten und lassen Sie die Gelatine bei Raumtemperatur für 1 min abkühlen und Aushärten bei 4 ° C für 20 min.
   3. Nachtrimmen den Gelatine Block unter das Fernglas ein Auge pro Block mit einer Rasierklinge passen.
   4. Übertragen die Gelatine eingebettet-Augen auf 2,3 M Saccharose in PB auf Eis. Über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
   5. Austausch neue 2,3 M Saccharoselösung und Store bei 4 ° C oder-20 ° C; nach diesem Schritt Proben sind bereit für schneiden oder kann mehrere Wochen bis Monate bei-20 ° C gelagert werden.
   6. Nachtrimmen den Gelatine Block auf fast die Größe des Auges vor der Übertragung an eine Cryo-Pin. Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Transfer zum Cryo-regungsloses.
3. Kryoschneiden
   1. Cut 110 nm dick-Abschnitte bei-120 ° C mit einem Diamant-Messer in der Cryo-regungsloses.
   2. Wählen Sie die Abschnitte mit einer kabelgebundenen Schleife mit einem Tröpfchen von 2 % Methylcellulose (im Wasser) und 2,3 M Zuckerlösung (1:1). Übertragen Sie Abschnitte auf einem 7 x 7 mm-Silizium-Wafer. Abschnitten bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung lagern.

2. Immunolabelling

1. Wash Wafer mit PBS bei 0 ° C für 20 min auf vier Tropfen indem die Wafer kopfüber auf die Tropfen. Waschen mit PBS-Puffer 2 x 2 min bei Raumtemperatur.
2. Inkubieren Sie 3 Mal in 0,15 % Glycin in PBS, für 1 Minute. 3 X 1 min. Waschen/Spülen mit PBS. Pre-incubate mit PBG (PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin BSA und 0,2 % Gelatine Typ B) für 5 min.
3. Inkubation mit Kaninchen Anti-Tom20 (siehe die Tabelle der Materialien) in PBG (4 µg/mL) für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Waschen 6 X für 1 min/Waschgang in PBG. Pre-incubate mit PBG für 5 min bei RT inkubieren mit Anti-Kaninchen-Alexa-647-F(ab')-₂ (siehe Tabelle of Materials) in PBG (7,5 µg/mL) für 30 min.
5. Waschen 6 X für 1 min/Waschgang in PBG. Waschen Sie 3 x 2 min in PBS. Inkubieren mit DAPI (4 µg/mL) mit PBS-Puffer für 10 s. Waschen 2 x 2 min in PBS.

3. Super-Auflösung Mikroskopie

1. Inkubation der Wafer kurz (10 s) durch Inverkehrbringen ein Tropfen einer 1:1 Lösung von Glycerin (80 %) und imaging-Puffer mit einem Sauerstoff Aufräumvorgang System (200 mM Phosphatpuffer mit 10 % Glukose, 0,5 mg/mL Glucoseoxidase, 40 µg/mL Katalase, 15 mM Beta-Mercaptoethylamine-Hydrochlorid (MEA HCL), pH 8,0).
2. Übertragen die Wafer (Abschnitt nach unten) auf einer Petrischale von Glas unten (Dicke 170 ± 5 µm) auf einen frischen Tropfen der 1:1 Mischung von Glycerin (80 %) und imaging-Puffer (wie in Schritt 3.1).
3. Entfernen von allen Seiten mit einer Pipette, die meisten der Flüssigkeit unter der Wafer. Silikon-Streifen verwenden, um den Wafer auf den Boden der Petrischale beheben.
   Hinweis: Silikon-Streifen bestehen aus zwei-Komponenten-Silikon-Kleber (3 x 12 mm).
4. Bild Abschnitte auf einem inversen Mikroskop mit hoher numerischer Apertur (z. B. 160 X / NA 1,43; siehe Tabelle of Materials) Öl eintauchen Superresolution engagierte Ziel. Vor der Bildgebung, lassen Sie die Probe auf Mikroskop Temperatur Reduzierung minimieren/laterale und axiale Drift equilibrate.
5. Zentrieren Sie den gewünschten Bereich und erste Weitfeld Epifluoreszenz Referenzbilder zu erwerben. Ändern Sie in die Betriebsart super Auflösung. Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 15 ms und setzen das Elektron Multiplikation (EM) zu gewinnen, um das Maximum von 300.
6. Leuchten Proben mit den 642 nm kontinuierliche Welle Laser auf maximale Laserleistung (entsprechend ~2.8 kW/cm ²) in Epifluoreszenz-Modus. Sobald die einzelnen Moleküls blinkt sind gut in jedem Frame getrennt, so dass die Wahrscheinlichkeit gering ist, dass die einzelnen Signale überlappen, legen Sie die Laserleistung auf ~0.7 kW/cm ². Notieren Sie die raw-Bild in Epifluoreszenz-Modus durch den Erwerb von mindestens 30.000 Bilder.
   Hinweis: Diese Parameter kann variieren, abhängig von verschiedenen Proben und Kennzeichnung dichten.
7. Aus den Rohdaten erzeugen eine Wiederaufbau-Event-Liste (Lokalisierungen von jedem Einzelmolekül blinzeln in die raw-Bild) mit einer Nachweisgrenze von 30 Photonen (muss angepasst werden, entsprechend der Probe) durch Klicken auf " Evaluate " in der ' t-Serie Analyse ' unter ' Tools '.
8. Visualisieren die super Auflösung durch "glockenförmig" passende ¹⁶ Anwendung eine Rendering-Pixel-Größe von 4 nm durch Klicken auf " Create Image " in der ' Event Liste Verarbeitung Panel ' unter ' Werkzeuge. '
   Hinweis: Für die Erzeugung von super gelöst Bild waren die integrierten Software-Tools des Systems in dieser Studie verwendeten beschäftigt. Jedoch die beschriebenen Superresolution Bildgebung auf anderen Einzelmolekül Lokalisierung basierten Systemen durchgeführt werden konnte und der Datenverarbeitung konnte mit open-Source-Software-Tools wie Gewitter ¹⁷.

4. Platin Shadowing

1. Silikon-Streifen zu entfernen und einen Tropfen PBS nah an den Rändern des Wafers, lift it up aus der Petrischale. Die Wafer 2 x 2 min in PBS, waschen, dann Post fix it mit 0,1 % Glutaraldehyd mit PBS-Puffer für 5 min. Waschen 2 X 2 min/waschen in PBS.
2. Inkubieren den Wafer zweimal für 5 min/Inkubation in 1 Tropfen von Methylcellulose 2 % in Wasser auf dem Eis. Legen Sie die Wafer in einem Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 14.100 x g 90 S. Mount es auf ein SEM-Aluminium-Stub mit der Durchführung von Kohlenstoff Zement.
3. Fügen Sie eine Schicht von 2 bis 10 nm von Platin/Kohlenstoff auf der Probe von rotary Beschattung bei 8°, mit einem Elektron Lichtstrahl Verdunstung Geräteeinstellungen: 1,55 kV 55 mA, bei 0,3 nm/s und einem Winkel von 8°, Rotationsebene 4.

5. Rasterelektronenmikroskopie

1. Bildausschnitten mit einem scanning Electron mIcroscope bei 1,5 kV, 2 mm arbeiten Abstand und mit einer In Objektiv Sekundär-Elektronen-Detektor.

6. Ausrichtung der Licht- und Elektronenmikroskopie Bilder

1. Öffnen beide Arten von Bildern mit Fidschi ¹⁸ klicken Sie " Datei | Offene ". Leinwandgröße anpassen, indem Sie auf " Bild | Anpassen | Leinwand Größe " und beide Bilder zu einem Stapel zu bringen, indem Sie auf " Bild | Stapel | Bilder stapeln ". Speichern Sie den Stapel als TIFF-Datei-Typ.
2. In Fidschi, öffnen eine neue TrackEM2- ¹⁹-Schnittstelle, indem " Datei | neu | TrackEM2 (neu) ". Importieren Sie den Stapel mit den beiden Bildern durch Rechtsklick auf das schwarze Fenster und Auswahl " Import Stack ".
3. Align Licht Mikroskopie Bild Elektronenmikroskopie Bild manuell mit Sehenswürdigkeiten, indem mit Hilfe der rechten Maustaste auf das Bild und " ausrichten | Richten Sie Layer manuell mit Wahrzeichen ".
   1. Pick Select Tool (schwarzer Pfeil) Sehenswürdigkeiten hinzufügen. Verwenden Sie die Form der Kerne, die gleichen Kanten in beiden Bildern (ergänzende Abbildung1) wählen Sie als Referenz. Fügen Sie mehrere Punkte (mindestens drei Punkte müssen ausgewählt werden). Ausrichtung mit einem affinen Modell anwenden, indem Rechte Maustaste klicken und auswählen " wenden Transformation | Affine Modell ".
4. Layer-Transparenz zu ändern (siehe ergänzende Abbildung1) zur Bewertung der Qualität der Achse.

Die Expression des Proteins Tom20, eine Untereinheit der Translocase mitochondrialen Außenmembran Komplex20, war entschlossen, in Dünnschliffen Larven Zebrafisch Netzhaut, durch Höchstauflösung Lichtmikroskopie (Abbildung 1) und diese Information war ergänzt mit dem topographischen Signal durch Rasterelektronenmikroskopie nach Platin Schattierung von die gleiche Abschnitte erhalten. Diese korrelativen Daten bestätigen die Lokalisation eines Proteins in Verbindung mit einem bestimmten Fach, der mitochondrialen Außenmembran und darüber hinaus Auskunft über das Verhältnis des Proteins mit anderen Organellen der Zelle.

Abbildung 1: CLEM auf Zebrafisch Netzhaut. A. geringer Vergrößerung Weitfeld Bild eines 5 Dpf Zebrafisch retinalen Abschnitts, Kerne gebeizt mit DAPI (Cyan). B. Rasterelektronenmikroskopie des gleichen Gebietes. C. höhere Vergrößerung Weitfeld-Bild des Rahmens in B. Kerne gebeizt mit DAPI (Cyan) und Tom20 mitochondriale Färbung wird in rot angezeigt. D. Weitfeld Bild des gleichen Abschnitts bei höherer Vergrößerung. Das Muster der Tom20 Ausdruck ist in den Clustern von Mitochondrien. E. Ausdruck von Tom20 (rote Punkte) von GSDIM Mikroskopie erkannt. Kerne gebeizt mit DAPI (Cyan). F. gleichen Abschnitt als E Kombination korrelative Höchstauflösung und Rasterelektronenmikroskopie. Tom20 Färbung (rote Punkte) erscheint am mitochondriale Cluster (M) an der äußeren Membranen von Mitochondrien. DAPI Fluoreszenzsignal in den Kernen (N) entspricht mit der Topographie des SEM Bild. G. hohe Vergrößerung Bild des Frames in F. Das scanning Electron Microscopy Bild bietet Zusammenhang GSDIM (rote Punkte). Mitochondrien Cristae sind deutlich sichtbar und die Tom20 Färbung an den äußeren Membranen der Mitochondrien lokalisiert ist. Die Membranen der äußeren Segment die Photorezeptoren (OS) eindeutig gelöst werden. Bild Pixel Größe 5 nm. Skalieren Sie Bars: A, B und C: 10 µm; D: 2 µm; E und F: 1 µm und G: 0,2 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung1: Ausrichtung der Licht- und Elektronenmikroskopie Bilder. A. Screenshot von TrackEM2 Schnittstelle mit SEM Bild und nummerierten Sehenswürdigkeiten entlang verschiedenen Kernen (gelb). B. Screenshot von TrackEM2 Schnittstelle mit Fluoreszenzbild und nummerierten Sehenswürdigkeiten (gelb) entlang verschiedenen DAPI gefärbt Kerne. Layer-Transparenz ändern können die Schieberegler auf der linken oberen Teil des Menüs verwendet werden. Maßstab: 1 µm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.