Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroskopiemethode ist es, die Proteinexpression in Bezug auf verschiedene subzelluläre Organellen in der Netzhaut von Zebrafischlarven durch Korrelation von hochauflösenden und rasterelektronenmikroskopischen Bildern genau zu lokalisieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Netzhautentwicklung und im zellulären Signalweg zu beantworten, wie z.B. die Untersuchung der Proteinfehllokalisierung in Mutanten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Superauflösung mit Rasterelektronenmikroskopie kombiniert, um hochgenaue Proteinlokalisierungsdaten im strukturellen Kontext der Probe zu erhalten.

Die Entnahme von Tokuyasu-Schnitten auf Silikonwafern erleichtert die Handhabung erheblich und die Verwendung von Platin-Shadowing für den Kontrast sorgt für eine gute Topographie der Probe. Diese Methode kann also einen Einblick in Studien an der Netzhaut von Larven-Zebrafischen geben. Einer seiner großen Vorteile ist, dass es auch auf viele andere biologische Systeme angewendet werden kann, wie z. B. die Identifizierung der Proteinexpression im Mausgewebe.

Nachdem Sie die Augen von fixierten Zebrafischlarven gemäß dem Textprotokoll präpariert haben, erwärmen Sie 15 Milliliter 12%ige Gelatine der lokalen Lebensmittelmarke in PBS bei 40 Grad Celsius. Saugen Sie dann das PBS aus den Augenröhrchen ab und fügen Sie die Gelatinelösung hinzu. Klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um sicherzustellen, dass die Gelatine in die Probe eindringt, und inkubieren Sie es 10 bis 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius in einem Thermoblock unter leichtem Schütteln oder in einem Wasserbad.

Füllen Sie in einem 40 Grad Celsius heißen Wasserbad 12 x fünf mal drei Millimeter große flache Einbettformen aus Silikon oder Polyethylen mit warmer Gelatine. Fügen Sie dann mit einer Pipette zwei Augen pro Form hinzu und verwenden Sie unter einem Fernglas eine Seziernadel, um sie richtig auszurichten. Nachdem Sie die Gelatine eine Minute lang bei Raumtemperatur abkühlen gelassen haben, legen Sie sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius zum Aushärten.

Schneide den Gelatineblock unter dem Fernglas mit einer Rasierklinge wieder ab, sodass ein Auge pro Block passt. Übertragen Sie die in Gelatine eingebetteten Augen auf 2,3 molare Saccharose in PBS auf Eis. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius.

Tauschen Sie dann die Proben gegen frische 2,3 molare Saccharoselösung aus. Und lagern Sie das Gewebe bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius für eine Lagerung bis zu mehreren Monaten. Schneiden Sie den Gelatineblock wieder auf fast die Größe des Auges zu, bevor Sie ihn auf einen Kryo-Stift übertragen.

Frieren Sie dann den Block in flüssigem Stickstoff ein und überführen Sie ihn in ein Kryo-Ultramikrotom. Mit einem Diamantmesser schneiden Sie im Kryo-Ultramikrotom 110 Nanometer dicke Abschnitte bei minus 120 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Abschnitte mit einer Drahtschlaufe, die einen Tropfen 2%ige Methylcellulose und 2,3 molare Saccharoselösung enthält.

Anschließend werden die Abschnitte auf einen sieben mal sieben Millimeter großen Silikonwafer übertragen. Um die Wafer zu waschen, pipettieren Sie vier Tropfen und legen Sie die Wafer kopfüber auf die Tropfen. Inkubieren Sie die Wafer auf den Tropfen bei null Grad Celsius für 20 Minuten.

Anschließend die Wafer zweimal in PBS bei Raumtemperatur jeweils zwei Minuten waschen. Inkubieren Sie die Proben dreimal jeweils eine Minute lang in 0,15 % Glycin in PBS. Verwenden Sie dann PBS, um die Proben dreimal eine Minute lang pro Waschgang zu waschen.

Inkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang mit PBG vor. Fügen Sie als nächstes Kaninchen Anti-Tom20 in PBG zu den Abschnitten hinzu. Und inkubieren Sie die Wafer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie das Tuch bei PBG sechsmal für eine Minute pro Waschgang. Anschließend werden die Proben fünf Minuten lang mit PBG bei Raumtemperatur vorinkubiert. Ersetzen Sie das PBG durch Alexa 647 anti-Kaninchen-divalente Fab-Fragmente in PBG und inkubieren Sie es 30 Minuten lang.

Waschen Sie die Proben sechsmal pro Waschgang eine Minute lang in PBG. Anschließend die Wafer mit PBS dreimal für zwei Minuten waschen. Fügen Sie DAPI und PBS zu den Wafern hinzu und inkubieren Sie sie 10 Sekunden lang.

Waschen Sie die Proben dann mit PBS zweimal für jeweils zwei Minuten. Legen Sie den Wafer auf einen Tropfen einer Eins-zu-Eins-Lösung aus 80 % Glycerin und Imaging-Puffer, der ein Sauerstofffängersystem enthält, und inkubieren Sie es kurz. Übertragen Sie die Wafer mit der Gewebeseite nach unten auf einen frischen Tropfen der Eins-zu-Eins-Mischung aus 80 % Glycerin und Imaging-Puffer auf einer Petrischale mit Glasboden.

Verwenden Sie eine Pipette von allen Seiten, um den größten Teil der Flüssigkeit unter dem Wafer zu entfernen. Verwenden Sie dann Silikonstreifen, um den Wafer am Boden der Petrischale zu befestigen. Platzieren Sie die montierten Schnitte auf einem inversen Mikroskop mit einem Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur.

Lassen Sie die Probe vor der Bildgebung auf die Mikroskoptemperatur ausgleichen, um die laterale und axiale Drift zu minimieren oder zu reduzieren. Zentrieren Sie den Interessenbereich und erfassen Sie Weitfeld-Epifluoreszenz-Referenzbilder. Wechseln Sie in den Betriebsmodus Superauflösung.

Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 15 Millisekunden ein und stellen Sie die Elektronenmultiplikationsverstärkung auf das Maximum von 300 ein. Beleuchten Sie anschließend die Probe im Epifluoreszenzmodus mit dem 642-Nanometer-Laser bei maximaler Laserleistung. Sobald die einzelnen Molekülblinker in jedem Frame gut voneinander entfernt sind, so dass die Wahrscheinlichkeit gering ist, dass sich einzelne Signale überlappen, reduzieren Sie die Laserleistung auf fast 1/3.

Nehmen Sie das Rohbild in Epifluoreszenz auf, indem Sie mindestens 30.000 Bilder aufnehmen. Aus den Rohdaten unter Werkzeuge wird für die t-Reihenanalyse eine Nachweisschwelle von 30 Photonen verwendet. Klicken Sie auf Auswerten, um eine Liste von Lokalisierungsereignissen zu erstellen.

Klicken Sie unter "Werkzeuge" im Bedienfeld "Ereignislistenverarbeitung" auf "Bild erstellen", um das Bild mit hoher Auflösung durch Gaußsche Anpassung zu visualisieren und dabei eine Rendering-Pixelgröße von vier Nanometern anzuwenden. Entfernen Sie die Silikonstreifen und fügen Sie einen Tropfen PBS in der Nähe der Ränder des Wafers hinzu, um ihn aus der Petrischale zu heben. Nachdem Sie den Wafer zweimal für jeweils zwei Minuten mit PBS gewaschen haben, verwenden Sie 0,1 % Glutaraldehyd in PBS, um ihn fünf Minuten lang zu fixieren.

Waschen Sie die Probe dann erneut zweimal für zwei Minuten pro Waschgang in PBS. Inkubieren Sie den Wafer in einem Tropfen 2%iger Methylcellulose in Wasser auf Eis zweimal für fünf Minuten pro Inkubation. Setzen Sie dann den Wafer in ein Zentrifugenröhrchen ein und zentrifugieren Sie ihn 90 Sekunden lang bei 14, 100 mal g.

Nach dem Schleudern verwenden Sie leitenden Kohlenstoffzement, um den Wafer auf einen REM-Aluminiumstummel zu montieren. Mit einem Elektronenstrahlverdampfungsgerät wird eine Schicht von zwei bis 10 Nanometern Platinkohlenstoff durch Rotationsabschattung mit den folgenden Einstellungen auf die Probe aufgebracht. Bildausschnitte mit einem Rasterelektronenmikroskop bei 1,5 Kilovolt, zwei Millimeter Arbeitsabstand und mit einem Sekundärelektronendetektor in der Linse.

Verwenden Sie Fidschi, um sowohl Licht- als auch Elektronenmikroskopie-Bilder zu öffnen, indem Sie auf Datei, Öffnen klicken. Passen Sie die Leinwandgröße an, indem Sie auf Bild, Anpassen, Leinwandgröße klicken. Bringen Sie dann beide Bilder in einen Stapel, indem Sie auf Bild, Stapel, Zu stapelnde Bilder klicken.

Öffnen Sie in Fidschi eine neue Spur-EM2-Schnittstelle, indem Sie auf Datei, Neu, Spur EM2 neu klicken. Importieren Sie den Stapel mit beiden Bildern, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das schwarze Fenster klicken und Stapel importieren auswählen. Richten Sie das Lichtmikroskopiebild manuell mit Landmarken an dem Elektronenmikroskopiebild aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken und Ausrichten, Layer manuell an Landmarken ausrichten auswählen.

Wählen Sie das Auswahlwerkzeug aus, um Orientierungspunkte hinzuzufügen. Verwenden Sie die Form der Kerne als Referenz, um die gleichen Kanten in beiden Bildern auszuwählen und mehrere Punkte hinzuzufügen. Wenden Sie die Ausrichtung mit einem affinen Modell an, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und Transformation anwenden, Affines Modell auswählen.

Ändern Sie abschließend die Layer-Transparenz, um die Qualität der Ausrichtung zu bewerten. Dieses Bild zeigt ein Weitwinkelbild mit geringer Vergrößerung eines Zebrafisch-Netzhautschnitts fünf Tage nach der Befruchtung. Den gleichen Bereich zeigt hier die Rasterelektronenmikroskopie.

Diese Bilder mit höherer Vergrößerung zeigen Tom20 bei roter Färbung mit Clustern an den Mitochondrien. Hier ist die Expression von Tom20 dargestellt, wie sie mit GSDIM-Mikroskopie nachgewiesen wurde. In diesem Bild kombiniert der gleiche Schnitt korrelative Superauflösungsmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie.

Die Tom20-Färbung tritt innerhalb des mitochondrialen Clusters an den äußeren Membranen der Mitochondrien auf. Das Fluoreszenz-DAPI-Signal in den Zellkernen stimmt mit der Topographie des REM-Bildes überein. Dieses REM-Bild stellt den Kontext zur Tom20-Färbung im GSDIM-Bild dar.

Mitochondriale Crista sind deutlich sichtbar, und die Tom20-Färbung ist an den äußeren Membranen der Mitochondrien lokalisiert. Die Membranen des äußeren Segments der Photorezeptoren sind deutlich aufgelöst. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Beschriftungs- und Bildgebungsparameter so gut wie möglich zu optimieren.

Nur optimal markierte Proben eignen sich für die Superauflösung. Die Proben dürfen während des Etikettierungsvorgangs zu keinem Zeitpunkt trocknen. Dieses Verfahren könnte auf die doppelmarkierende Immunfluoreszenz ausgeweitet werden und so die Lokalisierung von zwei verschiedenen Proteinen innerhalb einer spezifischen Struktur ermöglichen.

Bei komplexeren Proben wird die Verwendung von Passermarken empfohlen, um eine präzise Ausrichtung der Bilder zu erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man korrelative Studien zur Lokalisierung von Proteinen in Bezug auf die verschiedenen Organellen der Zelle in einer komplexen Gewebeprobe mit hochauflösender Präzision durchführt.