Name: Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Lernen Sie korrelative Höchstauflösungs- und Rasterelektronenmikroskopie zur Proteinlokalisierung in der Zebrafisch-Netzhaut. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen subzellulärer Strukturen.

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Finanzierung von Ionen und RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE zu gewähren, PZ00P3 142404/1 und PZ00P3 163979.

alle Experimente wurden gemäß der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt und von den örtlichen Behörden genehmigt wurden.
 1. Vorbereitung der ultradünnen Abschnitte auf Silizium-Wafer <ol><li>Probe Fixierung <ol><li>Fixativ Lösung mit 0,1 % Glutaraldehyd, 4 % Formaldehyd in 0,1 M Cacodylate Puffer zubereiten. 
		Hinweis: Vorsicht! Vorsicht beim Arbeiten mit Glutaraldehyd, Formaldehyd und Cacodylate Puffer, tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung und arbeiten in einer Dampfhaube.</li>
		<li>Einschläfern 5 Tage post Düngung (5 Dpf) Zebrafischlarven mit Tricaine (Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate, 0,4 % w/V mit PBS-Puffer (Phosphat-Puffer Kochsalzlösung, pH 7)) wie zuvor beschriebenen 15.</li>
		<li>Fixieren die Larven durch Eintauchen in vorgekühlt Fixativ Lösung auf Eis. Entfernen Sie den Kopf und Inkubation über Nacht bei 4 ° C mit sanftes Schaukeln.</li>
		<li>Sezieren die Augen durch das Gewebe um das Auge mit feinen Pinzette und Skalpell Mikrodissektion (unter einem Feldstecher) in gekühlten Fixativ Lösung auf einem 1 % Agarose-Bett Teller trimmen. Übertragen Sie die Augen zu einem Schlauch mit frisch vorgekühlt Fixiermittel.</li>
		<li>Waschen zweimal mit PBS-Puffer (Phosphat-Puffer Kochsalzlösung, pH 7,4) für 5 min jedem Waschgang bei Raumtemperatur (RT).</li>
	</ol></li> <li>Gelatine Infiltration und Montage <ol><li>Warm up 15 mL lokales Essen Marke Gelatine 12 % w/V in PB (Phosphatpuffer, 0,1 M pH 7.4) bei 40 ° c entfernen der PBS und Gelatine-Lösung in das Röhrchen mit den Augen. Tippen Sie auf das Rohr sanft um die Gelatine Infiltrate die Probe und 10-30 min bei 40 ° C in einem Thermoblock mit sanft schütteln oder im Wasserbad inkubieren.</li>
		<li>Füllen Sie 12 x 5 x 3 mm Silikon oder Polyethylen flache Einbettung Formen mit warmen Gelatine im Wasserbad 40 ° C. Fügen Sie zwei Augen pro Form mit einer Pipette, unter ein Fernglas mit einer Dissektion Nadel richtig ausrichten und lassen Sie die Gelatine bei Raumtemperatur für 1 min abkühlen und Aushärten bei 4 ° C für 20 min.</li>
		<li>Nachtrimmen den Gelatine Block unter das Fernglas ein Auge pro Block mit einer Rasierklinge passen.</li>
		<li>Übertragen die Gelatine eingebettet-Augen auf 2,3 M Saccharose in PB auf Eis. Über Nacht bei 4 ° C inkubieren.</li>
		<li>Austausch neue 2,3 M Saccharoselösung und Store bei 4 ° C oder-20 ° C; nach diesem Schritt Proben sind bereit für schneiden oder kann mehrere Wochen bis Monate bei-20 ° C gelagert werden.</li>
		<li>Nachtrimmen den Gelatine Block auf fast die Größe des Auges vor der Übertragung an eine Cryo-Pin. Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Transfer zum Cryo-regungsloses.</li>
	</ol></li> <li>Kryoschneiden <ol><li>Cut 110 nm dick-Abschnitte bei-120 ° C mit einem Diamant-Messer in der Cryo-regungsloses.</li>
		<li>Wählen Sie die Abschnitte mit einer kabelgebundenen Schleife mit einem Tröpfchen von 2 % Methylcellulose (im Wasser) und 2,3 M Zuckerlösung (1:1). Übertragen Sie Abschnitte auf einem 7 x 7 mm-Silizium-Wafer. Abschnitten bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung lagern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunolabelling <ol><li>Wash Wafer mit PBS bei 0 ° C für 20 min auf vier Tropfen indem die Wafer kopfüber auf die Tropfen. Waschen mit PBS-Puffer 2 x 2 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie 3 Mal in 0,15 % Glycin in PBS, für 1 Minute. 3 X 1 min. Waschen/Spülen mit PBS. Pre-incubate mit PBG (PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin BSA und 0,2 % Gelatine Typ B) für 5 min.</li>
	<li>Inkubation mit Kaninchen Anti-Tom20 (siehe die Tabelle der Materialien) in PBG (4 µg/mL) für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen 6 X für 1 min/Waschgang in PBG. Pre-incubate mit PBG für 5 min bei RT inkubieren mit Anti-Kaninchen-Alexa-647-F(ab&#39;)-2 (siehe Tabelle of Materials) in PBG (7,5 µg/mL) für 30 min.</li>
	<li>Waschen 6 X für 1 min/Waschgang in PBG. Waschen Sie 3 x 2 min in PBS. Inkubieren mit DAPI (4 µg/mL) mit PBS-Puffer für 10 s. Waschen 2 x 2 min in PBS.</li>
</ol> 3. Super-Auflösung Mikroskopie <ol><li>Inkubation der Wafer kurz (10 s) durch Inverkehrbringen ein Tropfen einer 1:1 Lösung von Glycerin (80 %) und imaging-Puffer mit einem Sauerstoff Aufräumvorgang System (200 mM Phosphatpuffer mit 10 % Glukose, 0,5 mg/mL Glucoseoxidase, 40 µg/mL Katalase, 15 mM Beta-Mercaptoethylamine-Hydrochlorid (MEA HCL), pH 8,0).</li>
	<li>Übertragen die Wafer (Abschnitt nach unten) auf einer Petrischale von Glas unten (Dicke 170 ± 5 µm) auf einen frischen Tropfen der 1:1 Mischung von Glycerin (80 %) und imaging-Puffer (wie in Schritt 3.1).</li>
	<li>Entfernen von allen Seiten mit einer Pipette, die meisten der Flüssigkeit unter der Wafer. Silikon-Streifen verwenden, um den Wafer auf den Boden der Petrischale beheben. 
	Hinweis: Silikon-Streifen bestehen aus zwei-Komponenten-Silikon-Kleber (3 x 12 mm).</li>
	<li>Bild Abschnitte auf einem inversen Mikroskop mit hoher numerischer Apertur (z. B. 160 X / NA 1,43; siehe Tabelle of Materials) Öl eintauchen Superresolution engagierte Ziel. Vor der Bildgebung, lassen Sie die Probe auf Mikroskop Temperatur Reduzierung minimieren/laterale und axiale Drift equilibrate.</li>
	<li>Zentrieren Sie den gewünschten Bereich und erste Weitfeld Epifluoreszenz Referenzbilder zu erwerben. Ändern Sie in die Betriebsart super Auflösung. Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 15 ms und setzen das Elektron Multiplikation (EM) zu gewinnen, um das Maximum von 300.</li>
	<li>Leuchten Proben mit den 642 nm kontinuierliche Welle Laser auf maximale Laserleistung (entsprechend ~2.8 kW/cm 2) in Epifluoreszenz-Modus. Sobald die einzelnen Moleküls blinkt sind gut in jedem Frame getrennt, so dass die Wahrscheinlichkeit gering ist, dass die einzelnen Signale überlappen, legen Sie die Laserleistung auf ~0.7 kW/cm 2. Notieren Sie die raw-Bild in Epifluoreszenz-Modus durch den Erwerb von mindestens 30.000 Bilder. 
	Hinweis: Diese Parameter kann variieren, abhängig von verschiedenen Proben und Kennzeichnung dichten.</li>
	<li>Aus den Rohdaten erzeugen eine Wiederaufbau-Event-Liste (Lokalisierungen von jedem Einzelmolekül blinzeln in die raw-Bild) mit einer Nachweisgrenze von 30 Photonen (muss angepasst werden, entsprechend der Probe) durch Klicken auf &#34; Evaluate &#34; in der &#39; t-Serie Analyse &#39; unter &#39; Tools &#39;.</li>
	<li>Visualisieren die super Auflösung durch "glockenförmig" passende 16 Anwendung eine Rendering-Pixel-Größe von 4 nm durch Klicken auf &#34; Create Image &#34; in der &#39; Event Liste Verarbeitung Panel &#39; unter &#39; Werkzeuge. &#39; 
	Hinweis: Für die Erzeugung von super gelöst Bild waren die integrierten Software-Tools des Systems in dieser Studie verwendeten beschäftigt. Jedoch die beschriebenen Superresolution Bildgebung auf anderen Einzelmolekül Lokalisierung basierten Systemen durchgeführt werden konnte und der Datenverarbeitung konnte mit open-Source-Software-Tools wie Gewitter 17.</li>
</ol> 4. Platin Shadowing <ol><li>Silikon-Streifen zu entfernen und einen Tropfen PBS nah an den Rändern des Wafers, lift it up aus der Petrischale. Die Wafer 2 x 2 min in PBS, waschen, dann Post fix it mit 0,1 % Glutaraldehyd mit PBS-Puffer für 5 min. Waschen 2 X 2 min/waschen in PBS.</li>
	<li>Inkubieren den Wafer zweimal für 5 min/Inkubation in 1 Tropfen von Methylcellulose 2 % in Wasser auf dem Eis. Legen Sie die Wafer in einem Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 14.100 x g 90 S. Mount es auf ein SEM-Aluminium-Stub mit der Durchführung von Kohlenstoff Zement.</li>
	<li>Fügen Sie eine Schicht von 2 bis 10 nm von Platin/Kohlenstoff auf der Probe von rotary Beschattung bei 8°, mit einem Elektron Lichtstrahl Verdunstung Geräteeinstellungen: 1,55 kV 55 mA, bei 0,3 nm/s und einem Winkel von 8°, Rotationsebene 4.</li>
</ol> 5. Rasterelektronenmikroskopie <ol><li>Bildausschnitten mit einem scanning Electron mIcroscope bei 1,5 kV, 2 mm arbeiten Abstand und mit einer In Objektiv Sekundär-Elektronen-Detektor.</li>
</ol> 6. Ausrichtung der Licht- und Elektronenmikroskopie Bilder <ol><li>Öffnen beide Arten von Bildern mit Fidschi 18 klicken Sie &#34; Datei | Offene &#34;. Leinwandgröße anpassen, indem Sie auf &#34; Bild | Anpassen | Leinwand Größe &#34; und beide Bilder zu einem Stapel zu bringen, indem Sie auf &#34; Bild | Stapel | Bilder stapeln &#34;. Speichern Sie den Stapel als TIFF-Datei-Typ.</li>
	<li>In Fidschi, öffnen eine neue TrackEM2- 19-Schnittstelle, indem &#34; Datei | neu | TrackEM2 (neu) &#34;. Importieren Sie den Stapel mit den beiden Bildern durch Rechtsklick auf das schwarze Fenster und Auswahl &#34; Import Stack &#34;.</li>
	<li>Align Licht Mikroskopie Bild Elektronenmikroskopie Bild manuell mit Sehenswürdigkeiten, indem mit Hilfe der rechten Maustaste auf das Bild und &#34; ausrichten | Richten Sie Layer manuell mit Wahrzeichen &#34;.
	<ol><li>Pick Select Tool (schwarzer Pfeil) Sehenswürdigkeiten hinzufügen. Verwenden Sie die Form der Kerne, die gleichen Kanten in beiden Bildern (ergänzende Abbildung1) wählen Sie als Referenz. Fügen Sie mehrere Punkte (mindestens drei Punkte müssen ausgewählt werden). Ausrichtung mit einem affinen Modell anwenden, indem Rechte Maustaste klicken und auswählen &#34; wenden Transformation | Affine Modell &#34;.</li>
	</ol></li> <li>Layer-Transparenz zu ändern (siehe ergänzende Abbildung1) zur Bewertung der Qualität der Achse.</li></ol>

<ol><li>Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+Super-Resolution+Microscopy%3A+New+Dimensions+and+New+Opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities.</a> Chem Rev. , (2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Methode verbindet super gelöst Protein Lokalisierung mit Kontextinformationen zu bestimmen, die genaue Position der Proteine in einer Organelle. Wir zeigen hier die Beendigung des Experiments, die Expression von Tom20 in der äußeren Membran der Mitochondrien und seine Beziehung zu anderen Organellen wie Kerne oder Außensegmenten der Sehzellen in der Netzhaut Larven Zebrafisch zu visualisieren.
Tokuyasu Cryo-Schneiden erfordert einige Übung, gut erhaltene Abschnitte zu erwerben. Dies ist jedoch eine Methode, die in vielen Laboratorien mit Erfolg21eingesetzt. Übertragung der Abschnitte auf dem Silizium-Wafer ist sehr einfach und benötigt keine besonderen Überlegungen. Die Verwendung von Glycerin in der bildgebenden Puffer ist ein sehr wichtiger Schritt um zu vermeiden, Trocknen der Abschnitte. Für Super-Resolution Imaging sind die besten Ergebnisse erzielt, wenn der Wafer in unmittelbarer Nähe der Glasboden der Petrischale befindet. Die Silikon-Streifen helfen Aufrechterhaltung des Wafers in dieser Position. Besonderer Sorgfalt ist geboten beim Entfernen der Streifen um die Abschnitte Schäden zu vermeiden.
Die Dicke der Cryo-Abschnitte, rund 100 nm, dünner als die optische Auflösung in der Z-Dimension, erleichtert zusätzlich die Genauigkeit dieser korrelativen Methode, wie die Super-Resolution-Mikroskopie-Signal nur diese dünne Schicht stammt und die Raster-Elektronenmikroskop Signal zeigt die Topografie der Probe. Diese Methode könnte auch mit mehrfarbigen Bildgebung kombiniert werden. Allerdings muss besondere Vorsicht geboten, dass die Probe unter gleichen Bedingungen (z. B. bildgebende Puffer) abgebildet kann und Übersprechen verhindert werden sollte.
Eine Einschränkung der Methode ist die zweidimensionale nähern, da nur eine begrenzte Anzahl von Schnittserien (ca. 3 bis 7 pro Wafer) gesammelt werden kann. Projekte zum Thema Volumen Analyse wäre so nicht ideal. Es ist jedoch eine Methode, die angewendet werden kann, um Protein-Expression in jede Art von Gewebe zu erkennen, durch einfaches Schneiden der Probe. Wir bieten eine Methode ohne Einsatz von klassischen Kontrastmittel wie Uranyl-Acetat oder Blei-Citrat. Der Kontrast von Platin Schattierung bietet sehr informativ topographischen Kontrast, aber in einigen Fällen Membranen sind schwer zu lösen. Dies kann Probleme für Projekte darstellen, die, zum Beispiel die Expression von Proteinen in kleinen Vesikeln zu bestimmen müssen.
Unser Protokoll basierend auf Tokuyasu Cryo-Abschnitte, nutzt Serienausstattung Höchstauflösung und Rasterelektronenmikroskope korrelative Ergebnisse erhalten. Die Sammlung von Abschnitten auf Silizium-Wafern und die Verwendung von Platin für Kontrast sind einfache Schritte, um Stabilität und Reproduzierbarkeit für die Probenvorbereitung.

Methoden zur Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen und deren Beziehung zu verschiedenen Kompartimenten der Zelle sind wesentliche Instrumente, um ihre Funktionen und möglichen Wechselwirkungen zu verstehen. Super-Auflösung Mikroskopie in Kombination mit Elektronenmikroskopie bietet solche Informationen1. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie, gefolgt von einzelnen Molekül Rückkehr (GSDIM) ist eine super-Resolution-Mikroskopie-Technologie kompatibel mit einer Vielzahl von organischen und genetisch codierte Fluorophore2 und erreicht eine laterale Auflösung bis zu 20 nm 3. die Einbeziehung von Methoden mit höherer Auflösung als standard Beugung begrenzte Mikroskopie verbessert die Genauigkeit der Korrelation4,5,6. Um die beste Korrelation der Proteinexpression mit einem spezifischen subzelluläre Fach zu erreichen und die Unsicherheit7 die Verwendung der gleichen ultradünnen Sektion für Licht- und Elektronenmikroskopie reduzieren wird empfohlen. Unter den verschiedenen speziellen Methoden Tokuyasu Cryo-Abschnitt Protokoll erfordert keine Austrocknung oder Harz einbetten und, darüber hinaus bewahrt die Antigenität von vielen Epitopen und bietet gute Gewebe Ultrastruktur8. Mehrere Methoden haben gezeigt, dass die Anwendbarkeit dieser Abschnitte in korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)4,5,9,10.
Die Zebrafisch Netzhaut ist ein wertvolles Modell, visuelle Entwicklung und menschliche Krankheitsmechanismen angesichts seiner hoch konservierte Struktur und Funktion in Wirbeltieren zu studieren. In bestimmten, retinalen Photorezeptoren Display bestehend aus die gleiche Architektur als Säugetier Photorezeptoren mit einer basalen Synapse, ein Apico-basaler länglichen Kern, clustering von Mitochondrien in dem mehr apikalen innere und eine äußere Segment Membran Festplatten in den meisten apikale Position11. Protein-Lokalisierung, die vielfältigen zellulare Fächer ist zwischen Zebrafish konserviert und menschlich, so dass die Untersuchung der biologischen Funktion des menschlichen krankheitsrelevanten Proteinen12,13.
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Larven Zebrafisch Vorbereitung Netzhaut Proben, die Lokalisierung der mitochondrialen Außenmembran Protein Tom20 korrelative Höchstauflösung Licht- und Elektronenmikroskopie zu lösen. Die Methode basiert auf das Sammeln von Cryo-Abschnitte auf Silizium-Wafer und Erlangung Kontrast durch topographische Informationen nach dem Auftragen einer dünnen Schicht aus Platin hergestellt. Diese Schritte sind klare technische Verbesserungen in Bezug auf Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit und Zeit für Experimente. Wir haben vor kurzem die Anwendbarkeit der Methode zur Erkennung von Kernporen und mitochondrialen Proteine in Maus Gewebe14gezeigt.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd EM Grade</td><td>EMS, USA</td><td>#16220</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylat</td><td>Merck</td><td>#8.20670</td><td></td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, peqGOLD Universal</td><td>VWR International GmbH</td><td>35-1020</td><td></td></tr><tr><td>Flacheinbettformen</td><td>BEEM Flat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lokale Lebensmittelmarke Gelatine</td><td>Dr.Oetker</td><td>Extra Gold</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>#1.07687</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>#M-6385</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>#G-7126</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine Typ B</td><td>Sigma</td><td>#G-6650</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applichem</td><td>#A6588.0050</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>Si-Mat Siliziummaterialien</td><td></td><td>Typ: P/Bor; Ausrichtung < 111> AUF; Wachstumsmethode: CZ; Spezifischer Widerstand: 1-30 Ohm/cm; Oberfläche: poliert; Lasergeschnitten bei 7 x7 mm</td></tr><tr><td>Kryo-Pin</td><td>Baltische Vorbereitung</td><td>#16701950</td><td></td></tr><tr><td>Drahtschlaufe "Perfect loop"</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonstreifen</td><td>Picodent</td><td>Twinsil 22</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G8270</td> Glukoseoxidase Sigma-Aldrich#G7141 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#C40</tr><tr><td>Beta-Mercaptoethylaminhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tom20</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>#sc - 11415</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Esel Anti Kaninchen IgG</td><td>Jackson Immuno-Research</td><td>#711-606-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ROCHE, Schweiz</td><td>#10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#49782</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale mit Glasboden</td><td>Ibidi, Deutschland</td><td>u-Schale 35mm, hoher Glasboden, #81158</td><td></td></tr><tr><td>REM Aluminium-Stummel</td><td>Agar Scientific#G301F</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Leitender Kohlenstoffzement Leit-C</td><td>Plano, Deutschland</td><td>AG3300</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife (Cryo Immuno)</td><td>Kieselalge</td><td>DCIMM3520</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica EM FCS</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-TIRF-Mikroskop GSD Leica SR GSD 3D</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>160x 1.43 TIRF Objektiv</td><td>Leica Microsystems</td><td>11523048</td><td></td></tr><tr><td>REM - Zeiss Supra 50 VP</td><td>Zeiss</td><td>Supra 50 VP</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM - Zeiss Auriga 40</td><td>Zeiss</td><td>Auriga 40</td><td></td></tr></tbody></table>

korrelative höchstauflösung und elektronenmikroskopie protein lokalisierung im zebrafisch netzhaut zu lösen

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, um die subzelluläre Protein-Lokalisierung in der Larven Zebrafisch Netzhaut zu untersuchen, durch die Kombination Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie. Die Sub-Beugung begrenzt Auflösung Fähigkeiten von Lichtmikroskopen Höchstauflösung zulassen Verbesserung der Genauigkeit der korrelierten Daten Kurz gesagt, 110 Nanometer Dicke Cryo-Abschnitte werden auf einem Silizium-Wafer übertragen und nach Immunfluoreszenz-Färbung, durch Lichtmikroskopie Höchstauflösung abgebildet sind. Anschließend sind die Abschnitte in Methylcellulose und Platin beschattet vor Bildgebung in einem Rasterelektronenmikroskop (REM) erhalten. Die Bilder von diesen zwei Mikroskopie-Modalitäten sind leicht zusammengeführt mit Gewebe Wahrzeichen mit open-Source-Software. Hier beschreiben wir die angepasste Methode für die Larven Zebrafisch-Netzhaut. Diese Methode ist jedoch auch für andere Arten von Geweben und Organismen. Wir zeigen, dass die ergänzende Informationen durch diese Korrelation in der Lage, den Ausdruck der mitochondrialen Proteine im Zusammenhang mit den Membranen und Cristae der Mitochondrien sowie zu anderen Abteilungen der Zelle zu lösen ist.

Die Expression des Proteins Tom20, eine Untereinheit der Translocase mitochondrialen Außenmembran Komplex20, war entschlossen, in Dünnschliffen Larven Zebrafisch Netzhaut, durch Höchstauflösung Lichtmikroskopie (Abbildung 1) und diese Information war ergänzt mit dem topographischen Signal durch Rasterelektronenmikroskopie nach Platin Schattierung von die gleiche Abschnitte erhalten. Diese korrelativen Daten bestätigen die Lokalisation eines Proteins in Verbindung mit einem bestimmten Fach, der mitochondrialen Außenmembran und darüber hinaus Auskunft über das Verhältnis des Proteins mit anderen Organellen der Zelle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56113/56113fig1.jpg"> 
Abbildung 1: CLEM auf Zebrafisch Netzhaut. A. geringer Vergrößerung Weitfeld Bild eines 5 Dpf Zebrafisch retinalen Abschnitts, Kerne gebeizt mit DAPI (Cyan). B. Rasterelektronenmikroskopie des gleichen Gebietes. C. höhere Vergrößerung Weitfeld-Bild des Rahmens in B. Kerne gebeizt mit DAPI (Cyan) und Tom20 mitochondriale Färbung wird in rot angezeigt. D. Weitfeld Bild des gleichen Abschnitts bei höherer Vergrößerung. Das Muster der Tom20 Ausdruck ist in den Clustern von Mitochondrien. E. Ausdruck von Tom20 (rote Punkte) von GSDIM Mikroskopie erkannt. Kerne gebeizt mit DAPI (Cyan). F. gleichen Abschnitt als E Kombination korrelative Höchstauflösung und Rasterelektronenmikroskopie. Tom20 Färbung (rote Punkte) erscheint am mitochondriale Cluster (M) an der äußeren Membranen von Mitochondrien. DAPI Fluoreszenzsignal in den Kernen (N) entspricht mit der Topographie des SEM Bild. G. hohe Vergrößerung Bild des Frames in F. Das scanning Electron Microscopy Bild bietet Zusammenhang GSDIM (rote Punkte). Mitochondrien Cristae sind deutlich sichtbar und die Tom20 Färbung an den äußeren Membranen der Mitochondrien lokalisiert ist. Die Membranen der äußeren Segment die Photorezeptoren (OS) eindeutig gelöst werden. Bild Pixel Größe 5 nm. Skalieren Sie Bars: A, B und C: 10 µm; D: 2 µm; E und F: 1 µm und G: 0,2 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/56113fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Abbildung1: Ausrichtung der Licht- und Elektronenmikroskopie Bilder. A. Screenshot von TrackEM2 Schnittstelle mit SEM Bild und nummerierten Sehenswürdigkeiten entlang verschiedenen Kernen (gelb). B. Screenshot von TrackEM2 Schnittstelle mit Fluoreszenzbild und nummerierten Sehenswürdigkeiten (gelb) entlang verschiedenen DAPI gefärbt Kerne. Layer-Transparenz ändern können die Schieberegler auf der linken oberen Teil des Menüs verwendet werden. Maßstab: 1 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56113/Supplementary_Figure_1.tif">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroskopiemethode besteht darin, die Proteine Lokalisation präzise in Bezug auf verschiedene subzelluläre Organellen in der Netzhaut von Zebrafischlarven durch die Korrelation von Super-Auflösungs- und Rasterelektronenmikroskopie-Bildern zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Netzhautentwicklung und zelluläre Signalwege zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung einer fehlerhaften Proteine Lokalisation bei Mutanten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Super-Auflösungsmikroskopie mit Rasterelektronenmikroskopie kombiniert, um äußerst genaue Daten zur Proteine Lokalisation innerhalb des strukturellen Kontexts der Probe zu erhalten.Die Sammlung von Tokuyasu-Schnitten auf Silikonwafern erleichtert erheblich die Handhabung, und die Verwendung von Platin-Schattenkontrast liefert eine gute Topographie der Probe. Dadurch kann diese Methode Einblicke in Studien der Zebrafischarten-Larvenretina ermöglichen. Einer ihrer wesentlichen Vorteile ist, dass sie auch auf viele andere biologische Systeme angewendet werden kann, beispielsweise auf die Identifizierung der Proteinausprägung in Mausgewebe.Nachdem die Augen gemäß dem Textprotokoll aus fixierten Zebrafischembryonen präpariert wurden, erwärmen Sie 15 Milliliter einer 12%igen Gelatine aus einer lokalen Lebensmittelmarke in PBS auf 40 Grad Celsius. Danach saugen Sie das PBS aus den Röhrchen mit den Augen ab und geben die Gelatinelösung hinzu. Klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um sicherzustellen, dass die Gelatine in die Probe eindringt, und inkubieren Sie diese 10 bis 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in einem Thermoblock mit sanftem Schütteln oder in einem Wasserbad.In einem Wasserbad mit 40 Grad Celsius füllen Sie flache Einbettformen aus Silikon oder Polyethylen mit den Abmessungen 12 mal 5 mal 3 Millimeter mit warmer Gelatine. Fügen Sie anschließend mit einer Pipette zwei Augen pro Form hinzu und richten Sie diese unter einem Binokular mit einer Dissektionsnadel korrekt aus. Nachdem die Gelatine eine Minute lang bei Raumtemperatur abgekühlt ist, stellen Sie sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius zum Aushärten ab.Verwenden Sie unter dem Binokular ein Rasiermesser, um den Gelatineblock erneut zuzuschneiden, sodass jeweils ein Auge pro Block passt. Überführen Sie die in Gelatine eingebetteten Augen in 2,3-molare Saccharose in PBS auf Eis. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius.Danach die Proben in frische 2,3-molare Saccharoslösung überführen und das Gewebe bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius für eine Lagerung von mehreren Monaten aufbewahren. Den Gelatineblock vor dem Übertragen auf eine Kryopinne auf nahezu die Größe des Auges neu zuschneiden.Anschließend den Block in flüssigem Stickstoff einfrieren und in ein Kryo-Ultramikrotom überführen. Mit einem Diamantmesser im Kryo-Ultramikrotom 110 Nanometer dicke Schnitte bei minus 120 Grad Celsius schneiden. Die Schnitte mit einer Drahtschleife aufnehmen, die einen Tropfen einer 2%igen Methylcellulose- und 2,3-molaren Saccharoselösung enthält.Überführen Sie die Schnitte anschließend auf einen sieben mal sieben Millimeter großen Silikonwafer. Zum Waschen der Wafer pipettieren Sie vier Tropfen und legen die Wafer umgedreht auf die Tropfen. Inkubieren Sie die Wafer auf den Tropfen bei null Grad Celsius für 20 Minuten.Anschließend die Wafer zwei Mal je zwei Minuten bei Raumtemperatur in PBS waschen. Die Proben dreimal je eine Minute in 0,15 % Glycin in PBS inkubieren. Danach die Proben dreimal je eine Minute mit PBS waschen.Präinkubieren Sie das Gewebe fünf Minuten lang mit PBG. Fügen Sie anschließend Kaninchen-Anti-Tom20 in PBG zu den Schnitten hinzu und inkubieren Sie die Wafer 30 Minuten bei Raumtemperatur.Spülen Sie das Gewebe mit PBG insgesamt sechsmal, wobei jede Spülung eine Minute dauert. Inkubieren Sie die Proben anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur mit PBG vor. Ersetzen Sie dann das PBG durch Alexa-647-markierte, anti-kaninchen Divalent-Fab-Fragmente in PBG und inkubieren Sie 30 Minuten lang.Die Proben sechsmal mit PBG waschen, wobei jede Waschung eine Minute dauert. Anschließend die Wafer dreimal mit PBS waschen, wobei jede Waschung zwei Minuten dauert. DAPI und PBS zu den Wafern hinzufügen und 10 Sekunden lang inkubieren.Waschen Sie die Proben anschließend zweimal mit PBS, jeweils zwei Minuten lang. Legen Sie den Wafer auf einen Tropfen einer 1:1-Lösung aus 80 % Glycerin und Imaging-Puffer, die ein Sauerstoff-Scavenging-System enthält, und inkubieren Sie kurz. Übertragen Sie die Wafer mit der Gewebeseite nach unten auf einen frischen Tropfen der 1:1-Mischung aus 80 % Glycerin und Imaging-Puffer in einer Petrischale mit Glasboden.Entfernen Sie mit einer Pipette von allen Seiten die meiste Flüssigkeit unterhalb des Wafers. Befestigen Sie den Wafer anschließend mit Silikonstreifen am Boden der Petrischale. Platzieren Sie die montierten Schnitte auf einem umgekehrten Mikroskop mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur und Ölimmersion.Vor der Bildaufnahme sollte die Probe auf die Temperatur des Mikroskops eingestellt werden, um laterale und axiale Drift zu minimieren oder zu verringern. Zentrieren Sie den Bereich von Interesse und nehmen Sie Breitfeld-Epifluoreszenz-Referenzbilder auf. Wechseln Sie in den Super-Auflösungs-Betriebsmodus.Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 15 Millisekunden ein und setzen Sie die elektronische Verstärkung auf das Maximum von 300. Beleuchten Sie als Nächstes die Probe im Epifluoreszenzmodus mit dem 642 Nanometer Laser bei maximaler Laserleistung. Sobald die Einzelmolekül-Blinks in jedem Bild gut getrennt sind, sodass die Wahrscheinlichkeit gering ist, dass einzelne Signale überlappen, verringern Sie die Laserleistung auf fast 1/3.Nehmen Sie das Rohbild mittels Epifluoreszenz auf, indem Sie mindestens 30.000 Einzelbilder aufzeichnen. Wenden Sie auf die Rohdaten unter Werkzeuge, t-Series Analyse einen Erkennungsschwellenwert von 30 Photonen an. Klicken Sie auf Auswerten, um eine Liste der Lokalisierungsereignisse zu generieren.Unter Werkzeuge klicken Sie im Bereich Eventlist Processing auf Bild erstellen, um das Super-Auflösungs-Bild durch Gaußsche Anpassung zu visualisieren und wenden dabei eine Rendering-Pixelgröße von vier Nanometern an. Entfernen Sie die Silikonstreifen und geben Sie einen Tropfen PBS nahe an die Kanten des Wafers, um ihn aus der Petrischale anzuheben. Nachdem Sie den Wafer zweimal für jeweils zwei Minuten mit PBS gewaschen haben, verwenden Sie 0,1 % Glutaraldehyd in PBS, um ihn für fünf Minuten nachzu-fixieren.Waschen Sie die Probe anschließend zwei Mal je zwei Minuten in PBS. Inkubieren Sie das Wafer zwei Mal je fünf Minuten lang in einem Tropfen 2 % Methylcellulose in Wasser auf Eis. Danach geben Sie das Wafer in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren es bei 14.100 × g für 90 Sekunden.Nach dem Zentrifugieren montieren Sie die Probe mit leitendem Kohlenstoffzement auf einen Aluminium-SEM-Stub. Tragen Sie mithilfe einer Elektronenstrahl-Verdampfungsanlage durch rotierende Schattenbeschichtung eine Schicht von zwei bis zehn Nanometern Platin-Kohlenstoff auf die Probe auf, und verwenden Sie dabei die folgenden Einstellungen. Bildabschnitte mit einem Rasterelektronenmikroskop bei 1,5 Kilovolt, zwei Millimeter Arbeitsabstand und mit einem In-Lens-Sekundärelektronendetektor aufnehmen.Öffnen Sie mit Fiji sowohl Licht- als auch Elektronenmikroskopiebilder, indem Sie auf Datei, Öffnen klicken. Passen Sie die Leinwandgröße an, indem Sie auf Bild, Anpassen, Leinwandgröße klicken. Bringen Sie anschließend beide Bilder in einen Stapel, indem Sie auf Bild, Stapel, Bilder zu Stapel klicken.Öffnen Sie in Fiji eine neue Track-EM2-Schnittstelle, indem Sie auf Datei, Neu, Track EM2 neu klicken. Importieren Sie den Stack mit beiden Bildern, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das schwarze Fenster klicken und Stack importieren auswählen. Richten Sie das Lichtmikroskopiebild manuell anhand von Markern an das Elektronenmikroskopiebild aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken und Ausrichten, Ebene manuell mit Markern ausrichten auswählen.Wählen Sie das Auswahlwerkzeug, um Landmarken hinzuzufügen. Verwenden Sie die Form der Kerne als Referenz, um in beiden Bildern dieselben Kanten auszuwählen und mehrere Punkte hinzuzufügen. Wenden Sie die Ausrichtung mit einem affinen Modell an, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und „Transformationsanwendung, Affines Modell“ auswählen.Schließlich die Transparenz der Ebene verändern, um die Qualität der Ausrichtung zu beurteilen. Dieses Panel zeigt ein Weitfeldbild mit niedriger Vergrößerung eines Netzhautschnitts von einem Zebrafisch fünf Tage nach der Befruchtung. Derselbe Bereich wird hier mittels Rasterelektronenmikroskopie dargestellt.Diese Aufnahmen mit höherer Vergrößerung zeigen die rot gefärbte Tom20-Anfärbung mit Ansammlungen an den Mitochondrien. Die Expression von Tom20 wird hier mittels GSDIM-Mikroskopie nachgewiesen. In diesem Bild kombiniert der gleiche Ausschnitt korrelative Super-Auflösungs-Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie.Die Tom20-Färbung erscheint innerhalb des mitochondrialen Clusters an den äußeren Membranen der Mitochondrien. Das fluoreszierende DAPI-Signal in den Kernen entspricht der Topographie des REM-Bildes. Dieses REM-Bild liefert einen Kontext für die Tom20-Färbung im GSDIM-Bild.Die mitochondrialen Cristae sind deutlich sichtbar, und die Tom20-Färbung lokalisiert sich an den äußeren Membranen der Mitochondrien. Die Membranen des äußeren Segments der Photorezeptoren sind klar aufgelöst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Markierungs- und Bildgebungsparameter so gut wie möglich zu optimieren.Nur optimal markierte Proben eignen sich für die Super-Auflösung. Während des Markierungsverfahrens dürfen die Proben zu keinem Zeitpunkt austrocknen. Dieses Verfahren könnte auf eine Doppelmehrfachmarkierung mittels Immunfluoreszenz erweitert werden und so die Lokalisierung von zwei verschiedenen Proteinen innerhalb einer bestimmten Struktur ermöglichen.Für komplexere Proben wird die Verwendung von Referenzmarkern empfohlen, um eine präzise Ausrichtung der Bilder zu erzielen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie korrelative Untersuchungen durchgeführt werden, um Proteine in Bezug auf die verschiedenen Organellen der Zelle in einer komplexen Gewebeprobe mit Super-Auflösungsgenauigkeit zu lokalisieren.

correlative-super-resolution-electron-microscopy-to-resolve-protein

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

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