Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

Zusammenfassung

Durch eine doppelte Behandlung mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin, das trennende Zellen tötet, kann nervenfreie Hydra vulgaris erzeugt werden. Diese Hydra können nicht selbst ernähren oder bestochen werden. Dieses Papier beschreibt eine verbesserte Methode zur Langzeitpflege von nervenfreien Hydra vulgaris im Labor.

Zusammenfassung

Die interstitielle Zelllinie von Hydra umfasst multipotenten Stammzellen und deren Derivate: Drüsenzellen, Nematocyten, Keimzellen und Nervenzellen. Die interstitiellen Zellen können durch zwei aufeinanderfolgende Behandlungen mit Colchicin, einem pflanzlichen Toxin eliminiert werden, das die Trennzellen tötet, wodurch das Potenzial für die Erneuerung der differenzierten Zellen, die aus den interstitiellen Stammzellen gewonnen werden, gelöscht wird. Dies ermöglicht die Erzeugung von Hydra , die keine Nervenzellen haben. Ein nervenfreier Polypen kann seinen Mund nicht öffnen, um den osmotischen Druck zu ernähren, zu bestrafen oder zu regulieren. Solche Tiere können jedoch überleben und auf unbestimmte Zeit im Labor kultiviert werden, wenn sie regelmäßig zwangsernährt und geplatzt werden. Der Mangel an Nervenzellen ermöglicht die Untersuchung der Rolle des Nervensystems bei der Regulierung des Tierverhaltens und der Regeneration. Bisher veröffentlichte Protokolle für nervenfreie Hydra- Instandhaltung beinhalten veraltete Techniken wie Mundpipettieren mit handgezogener Mikropipette tIps, um die Hydra zu füttern und zu reinigen. Hier wird ein verbessertes Protokoll zur Pflege von nervenfreier Hydra eingeführt. Feinspitzen werden verwendet, um den Mund zu öffnen und frisch getötete Artemia einzusetzen. Nach der Zwangsernährung wird die Körperhöhle des Tieres mit frischem Medium unter Verwendung einer Spritze und einer Injektionsnadel gespült, um unverdautes Material zu entfernen, das hier als "burping" bezeichnet wird. Diese neue Methode der Kraft-Fütterung und Aufstoßen von nervenfreien Hydra durch den Einsatz von Pinzetten und Spritzen beseitigt die Notwendigkeit für Mund-Pipettieren mit handgezogenen Mikropipettenspitzen. Damit ist der Prozess sicherer und deutlich zeitaufwändiger. Um sicherzustellen, dass die Nervenzellen im Hypostom eliminiert wurden, wird die Immunhistochemie unter Verwendung von Anti-Tyrosin-Tubulin durchgeführt.

Einleitung

Das Nervensystem von Hydra besteht aus einem Nervennetz, wobei Neuronen mit beiden Epithelgewebeschichten ¹ assoziiert sind. Das Nervennetz ist dichter im Hypostom und Stiel und weniger dicht in der Körpersäule ² . Die Nervenzellen stammen aus interstitiellen Stammzellen, die multipotenten Stammzellen sind, die zu sekretorischen Zellen, Nematocyten, Keimzellen und Neuronen führen. Es ist möglich, die interstitiellen Zellen von Hydra vulgaris durch die Behandlung mit Colchicin ^{3 , 4} , ein pflanzliches Toxin, das trennenden Zellen zu beseitigen, ....

Protokoll

1. Doppelte Colchicin-Behandlung

1. Machen Sie eine 0,4% Colchicin (Gewicht / Volumen) Lösung in Hydra Medium ^{3 , 4 , 17} .
   Achtung: Colchicin ist akut toxisch, tödlich, wenn es verschluckt wird, kann genetische Defekte verursachen und kann Augenschäden verursachen. Behandeln Sie das Pulver in einer Dunstabzugshaube und tragen Sie volle persönliche Schutzausrüstung (PSA).
2. Inkubation Hydra vulgaris (AEP-Stamm wurde hier verwendet), die für 24 h in 0,4% Colchicin in einem Verhältnis von 5 Hydra pro ml Colchici....

Ergebnisse

Unmittelbar nach der ersten 8 h colchicine Behandlung überleben alle Hydra . Einige dieser Hydra werden nur noch Tentakelstummel verbleiben ( Abbildung 3 A ), während andere ihre Tentakeln vollständig verloren haben ( Abbildung 3 B ). In den folgenden 1 oder 2 Tagen werden die Tentakeln weiter schrumpfen, bis alle Hydra ihre Tentakeln verloren haben. Etwa 1 Woche nach .......

Diskussion

Hydra interstitielle Zellen können durch eine Doppel-Colchicin-Behandlung ^{3 , 4} eliminiert werden. In den Tagen nach der ersten Behandlung ist es entscheidend, den Kontakt zwischen der einzelnen Hydra zu verhindern, um die Verschmelzung von Hydra- Stücken in deformierte Hydra zu vermeiden. Auch Tiere, die nach der ersten Behandlung unbeaufsichtigt essen können, müssen entfernt werden, da die zweite Colchicinbehandlung nicht au.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Colchicine	Acros Organics	227120010
1 mL Spritze	BD	301025
Saline Garnelen Eier	Salin Garnelen Direkt	N/A	Kann vor Ort gekauft werden
Sole Garnelen Brutschale	Sole Shrimp Direct	N/A
60 mm x 15 mm Petrischale	Celltreat	229663
30 G x 3/4" Injektionsnadel	Covidien	1188830340	Eine 27G-Nadel kann auch verwendet werden
2 x Pinzette mit feiner Spitze	Dumont	0109-5-PO
Rifampicin	EMD Millipore	557303
Ziege Anti-Maus lgG, Pab (HRP-Konjugat)	Enzo	ADI-SAB-100-J
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Skalpell	Fisher	08-920A
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	10437028
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)	Invitrogen	D1306
PBS Tabletten	MP Bio	2810305
monoklonales Anti-Tubulin, Tyrosin	Sigma	T9028
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D2650
Wasserstoffperoxid	Sigma	216763
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma	P6148
Triton X - 100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P1379
Urethan	Sigma	U2500
Luftpumpe	Tetra	77846-00
Glaspasteurpipette	VWR	53283-916	Die Länge der Pipette spielt keine Rolle
15 mL Röhrchen	VWR	89039-670
P320 Schleifpapier	3M	IBGABBV00397	Kann im örtlichen Baumarkt gekauft werden