Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Zusammenfassung

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Zusammenfassung

Aktuelle Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führen zur Schaffung von Tausenden von Neubaustrecken in Modellorganismen, wodurch die Notwendigkeit für neue Methoden zur sicheren Aufbewahrung von genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Kryokonservierung von Frühphasen-Keimzellen von ganzen Hoden NIV bietet Möglichkeiten für die Lagerung von Zebrafisch genetische Ressourcen, vor allem, da sie nach der Transplantation zu männlichen und weiblichen Gameten heranreifen können. Hoden wurden herausgeschnitten, fixiert auf einer Akupunktur-Nadel, in zwei Cryoprotective Medien (Gleichgewichtherstellung Lösung mit 1,5 M Methanol und Propylen-Glykol 1,5 M; und Verglasung Lösung mit 3 M Dimethyl Sulfoxid und 3 M Propylenglykol) equilibriert, und stürzte sich in flüssigem Stickstoff. Proben wurden in einer Reihe von drei konsequente Erwärmung Lösungen erwärmt. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind (1) das Fehlen von Spermien nach der Verdauung der erwärmte Hoden und erleichtert so die nachgelagerte Manipulationen; (2) Ultra-schnelle Kühlung ermöglicht die optimale Belichtung der Gewebe zu flüssigem Stickstoff, also die Maximierung der Kühlung und reduziert die benötigte Konzentration der Kryoprotektanten, wodurch sich ihre Toxizität; (3) synchron Exposition von mehreren Hoden Kryoprotektanten und flüssigem Stickstoff; und (4) Wiederholbarkeit durch den Erhalt der Lebensfähigkeit von über 50 % in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme nachgewiesen.

Einleitung

Neue Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führten zur Schaffung von Tausenden von mutierten Neuanlagen von Mäusen, Drosophila, Zebrafisch und andere Arten als Modellorganismen im Biomedizin und anderen Wissenschaften¹verwendet. Darüber, wie neue Technologien entwickelt und zur Verfügung stehen, die Nummern der mutierten Linien ständig steigen². Dies führt zu der Notwendigkeit für eine sichere Lagerung der genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Als eine Methode, die sichere Lagerung von genetischen Ressourcen für eine unbestimmte Zeit ermöglicht, Kryokonservierung bietet....

Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den ungarischen Tierschutzgesetz genehmigt.

(1) Reagenz Vorbereitung

1. Stammlösungen
   1. Bereiten Sie 1 M Trehalose durch Zugabe von 0,378 g Trehalose Dihydrat in 1 mL der dH₂O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.
   2. Bereiten Sie 1 M Saccharose durch Zugabe von 0,342 g Saccharose in 1 mL der dH₂O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.
   3. Bereiten Sie 1 M HEPES durch Zugabe von 0,238 g HEPES zu 1 mL von dH₂O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.
   4. Bereiten Sie 20 mg/mL Kollagenase (290 U/mg vor) durch Zugabe von 100 mg bis 5 mL PB....

Ergebnisse

Im Durchschnitt der Zahl der Frühphasen-Keimzellen isoliert von einem einzigen frischen Zebrafisch Hoden variiert zwischen 40.000 und 200.000 Zellen abhängig von der Größe des Fisches. Als frische Zebrafisch Hoden in allen 5 Stämme zu verdauen, waren frühen Keimzellen nicht die einzigen Zellen in der Zellsuspensionen (Abbildung 2). Neben dem Frühstadium Keimzellen fanden sich zahlreiche Spermien sowie. Auf der anderen Seite gab es weit weniger Spermien nach d.......

Diskussion

Das Hauptziel dieser Studie war Anpassung die Nadel ultra-schnelles Kühlungs Verfahren entwickelt für Vögel und Säugetiere Arten^10,11,12 , die Kryokonservierung von Fisch Hoden (Zebrafisch als Modell eingetaucht Organismus). Die meisten der bisherigen Studien zur Kryokonservierung von Zebrafisch genetischer Ressourcen konzentrierten sich in erster Linie auf Kryokonservierung von Zebrafisch Sperma^2,

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Leibovitz media (L-15)	Sigma-Aldrich	L1518	Ergänzt mit L-Glutamin
Fetales Rinderserum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Tricain-Methansulfonat (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Saccharose	Acros Organics	57-50-1
Trehalose	Acros Organics	99-20-7	Dihydrat
Methanol	Reanal	20740-0-08-65
Propylenglykol	Reanal	08860-1-08-65
Dimethylsulfoxid	Reanal	00190-1-01-65
Kollagenase	Gibco	9001-12-1
Trypsin	Sigma-Aldrich	T8003
DNase I	Panreac AppliChem	A3778
Trypanblau	Sigma-Aldrich	T6146
Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	Tabletten zur Herstellung von 200 ml PBS-Lösung