Eine einfache neuronale mechanische Verletzungsmethodik zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache und weit zugängliche Methode, um die Segmentnerven in Drosophila- Larven zu verletzen, um die Neurodegeneration von motorischen Neuronen an der neuromuskulären Kreuzung (NMJ) der dritten Larven der Larven zu visualisieren und zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Die Degeneration von Neuronen tritt während der normalen Entwicklung und als Reaktion auf Verletzungen, Stress und Krankheit auf. Die zellulären Merkmale der neuronalen Degeneration sind bei Menschen und Invertebraten bemerkenswert ähnlich wie die molekularen Mechanismen, die diese Prozesse antreiben. Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster , bietet einen mächtigen, aber einfachen genetischen Modellorganismus, um die zellulären Komplexität neurodegenerativer Erkrankungen zu untersuchen. Tatsächlich haben etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog und eine Fülle von Werkzeugen und Assays wurden beschrieben, indem sie fliegt, um menschliche neurodegenerative Erkrankungen zu untersuchen. Genauer gesagt hat sich der neuromuskuläre Knotenpunkt (NMJ) in Drosophila als wirksames System erwiesen, um neuromuskuläre Erkrankungen zu untersuchen, da die Fähigkeit besteht, die strukturellen Verbindungen zwischen dem Neuron und dem Muskel zu analysieren. Hier berichten wir über einen in vivo motorischen Neuronenverletzungsassay in DrosophilaReproduzierbar neurodegeneration am NMJ um 24 h induziert. Mit dieser Methodik haben wir eine zeitliche Abfolge von zellulären Ereignissen beschrieben, die zu einer motorischen Neuronendegeneration führen. Die Verletzungsmethode hat vielfältige Anwendungen und wurde auch verwendet, um spezifische Gene zu identifizieren, die für die Neurodegeneration erforderlich sind, und die Transkriptionsreaktionen auf neuronale Verletzungen zu zerlegen.

Einleitung

Neuronale Degeneration tritt während der normalen Entwicklung auf und kann durch den natürlichen Alterungsprozess, die Verletzung, den Stress oder die Krankheitszustände verursacht werden. Drosophila melanogaster , die gemeinsame Fruchtfliege, bietet einen einfachen und leistungsfähigen Modellorganismus, um die Neurodegeneration aufgrund der bemerkenswerten Ähnlichkeiten in den molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Degeneration von Neuronen antreiben. Diese Ähnlichkeiten werden durch die Tatsache hervorgehoben, dass etwa 70% der krankheitsassoziierten menschlichen Gene ein Drosophila- Homolog haben. ¹ Darüber hinaus....

Protokoll

1. Vorbereitung von Reagenzien und Geräten

1. 1 × Dissektionspuffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl ₂ , 20 mM MgCl ₂ , 10 mM NaHCO ₃ , 115 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES, pH 7,2) herstellen.
2. 40 Phosphat-gepufferte Saline (PBS) zubereiten.
3. Vorbereitung von 1x PBT mit 1x PBS mit 0,01% Triton X-100.
4. Fruchtsaft-Agarplatten vorbereiten. ¹⁴ Mischen Sie 30 g Agar in 700 ml H ₂ O und Autoklav. 0,5 g Methylparaben in 10 ml Ethanol auflösen und 300 ml Fruchtsaftkonzentrat (Traube oder Apfel) zugeben. Konzentrieren Sie das Konzentrat in eine autoklavierte Aga....

Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten Verfahren haben wir gezeigt, dass mechanische neuronale Verletzungen eine zeitliche Dissektion von neurodegenerativen Ereignissen ermöglichen. ^{14 , 18} Die Reihenfolge der Ereignisse wurde zuvor charakterisiert und beginnt mit einer sofortigen Unterbrechung des Zytoskeletts, gefolgt von axonalen Menschenhandlungsdefekten, einer Anhäufung von ubiquitinierten Proteinen und anschließender Neurodegeneration .......

Diskussion

Die hier beschriebene neuronale mechanische Verletzung kann hier verwendet werden, um Verletzungen / Stress in den Segmentnerven der Drosophila- Larven zu induzieren. ^{4 , 5 , 6 , 14} Diese experimentelle Technik wurde bisher verwendet, um die zeitliche Abfolge von Ereignissen, die zur Neurodegeneration führen, zu sezieren, sowie die Transkriptionsänderungen in den motorischen Neuronzel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikro-Präparierschere	Fine Science Tools	15000-08
Dumont #3 Pinzette	Fine Science Tools	11231-30	Manche bevorzugen Größe 3, andere bevorzugen Größe 5
Dumont #5 Pinzette	Fine Science Tools	11251-30	Manche bevorzugen Größe 3, während andere Größe 5 bevorzugen
CO2 Air Tank	Tech Air	UN 1013	Es können verschiedene Tankgrößen erworben werden
CO2 Anästhesieapparat	Genesee Scientific	59-114
Edelstahlstifte, Größe 0,1	Fine Science Tools	26002-10
SylGard 184 Silikonelastomer, Basis und Härter	Dow Corning	3097358-1004	Zum Gießen von Präparierplatten
Bouin's Solution	Sigma	HT 10132-1L	Antikörper sollten auf ihre Wirksamkeit in Bouin's und PFA
4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)	werdenAffymetrix	FLY-8030-20	Antikörper sollten auf ihre Wirksamkeit in Bouin's und PFA
Dissecting Stereo MIcroscope	AmScope	SM-1BZ
Lichtquelle	AmScope	HL150-AY-220V
Anti-nc82 Antikörper getestet werden	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	nc82-s
Anti-Scheiben große Antikörper	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank	AF3
Alexa Fluor Anti-Meerrettich-Peroxidase	Jackson Immunresearch	123-545-021; 123-585-021; 123-605-021	One can you Alexa Fluor® 488, 594 oder 647
Flystuff Grape Juice Agar Premix	Genesee Scientific	47-102
Objektträger	Genesee Scientific	29-101
Eindeckgläser aus Glas	Fisher Scientific	12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility Box	Fisher Scientific	03-484C	Wird verwendet, um eine Feuchtkammer für die Wiederherstellung der Larven zu schaffen

getestet