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Methodenartikel

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

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DOI:

10.3791/56132

⸱

5. Oktober 2017

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Am häufigsten Darm Inhaltsanalysen der Makroinvertebraten sind visuell. Intensive Kenntnisse über morphologische Vielfalt der Beute Organismen erfordern, sie vermissen weichen vollmundigen Beute und durch starke Zerkleinerung von Beute, sind fast unmöglich für einige Organismen, einschließlich Amphipoden. Wir bieten detaillierte, neuartigen gentechnische Ansätze für Soisgrabenbaches Identifikation in der Ernährung der Amphipoden Beute.

Zusammenfassung

Analyse von Nahrungsketten ist essentiell für ein besseres Verständnis von Ökosystemen. Nahrungsnetz-Interaktionen können zum Beispiel schwere Veränderungen verursacht durch die Invasion der nicht heimischer Arten unterziehen. Eine genaue Identifizierung der Feld-Räuber-Beute-Interaktionen ist jedoch in vielen Fällen schwierig. Diese Analysen basieren häufig auf eine visuelle Beurteilung der Darm Inhalt oder die Analyse der stabile Isotopenverhältnisse (δ15N und δ-13C). Solche Methoden erfordern umfassende Kenntnisse über, bzw. morphologische Vielfalt oder isotopische Unterzeichnung von einzelnen Beute Organismen, zu Hindernissen bei der genauen Identifizierung von Beute Organismen. Visuelle Darm Inhaltsanalysen unterschätzen besonders weichen vollmundigen Beute Organismen, weil Mazeration, Nahrungsaufnahme und Verdauung der Beute Organismen Identifizierung von spezifischen Arten erschweren. Daher Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierte Strategien, zum Beispiel die Verwendung von gruppenspezifischen Primer setzt, bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Nahrungsnetz-Interaktionen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Darminhalt der Verbraucher denkt vom Feld mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomale Desoxyribonukleinsäure (rDNA). DNA kann entweder vom ganzen Exemplare (bei kleinen Taxa) extrahiert oder aus Darminhalt im Feld gesammelten Exemplare. Präsenz und Funktionstüchtigkeit der DNA Vorlagen direkt von der getesteten Person bestätigt werden müssen mit universal Primer setzt gezielt die jeweiligen Untereinheit der DNA. Wir zeigen auch, dass verbrauchte Beute bestimmt werden kann, weiter bis auf Artniveau über PCR mit unveränderten gruppenspezifischen Primer, verbunden mit nachfolgenden Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mittels Polyacrylamid-Gele. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten parallel Screening für DNA-Fragmente unterschiedlicher Beute Gruppen aus mehreren Darm Inhalt Proben über automatisierte Fragment Analyse ermöglicht.

Einleitung

Räuber-Beute-Interaktionen, die die Mehrheit der trophischen Interaktionen und Nahrungsnetz Dynamik darstellen, sind wichtige Aspekte charakterisieren die Fluten von Materie und Energie im gesamten Nahrungsnetze innerhalb und zwischen den Ökosystemen, die eines der wichtigsten Ziele der Ökologie ist 1. die Bestimmung der Quelle und Fluss von Kohlenstoff und Nährstoffen fördert das Verständnis der ökologischen Vernetzung zwischen Ökosystemen2. Ökosysteme, wie Flüsse und ihre Einzugsgebiete werden jedoch nicht nur durch Fluten von organischen Stoffen und Nährstoffen, sondern auch durch die Bewegungen der Organismen3verknüpft. So können Lebensraum Änderungen unterbrechen die Ressourcen, die diese Systeme verbinden stark Nahrungsketten der beiden Ökosysteme nicht nur direkt, sondern indirekt auch ändern, indem Änderung der jeweiligen Zusammensetzung der Räuber-Beute-Gemeinschaften. Zum Beispiel wurden Änderungen der Nahrungsnetze gezeigt, um die Bewegungen der einzelnen Raubtier Arten (z.B., Regenbogenforelle)4verknüpft werden. Solche Veränderungen drohen möglicherweise biologische Vielfalt und das funktionieren aquatischer Ökosysteme. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen von Menschen verursachten Umweltveränderungen, wie Wasser-Management-Praktiken, auf die Einheimischen Biodiversität aquatischer Ökosysteme, Räuber-Beute-Interaktionen im Bereich Analyse.

Da tracking trophische Beziehungen schwierig in komplexen Systemen, entstanden mehrere Ansätze, die es ermöglichen die Beurteilung der Fütterung Interaktionen in Feld5. Traditionell, Untersuchungen der Fütterung Interaktionen im Bereich basieren auf visuelle Identifizierung der Beute bleibt in seziert Mut und erfordern ein umfangreiches Wissen über die Vielfalt der morphologischen Beute. Visuelle Darm Inhaltsanalysen haben Einblicke in die Nutzung der Ressourcen von mehreren Gruppen von Verbrauchern (z. B. jahreszeitliche Variation in der Ernährung der Hummer6 und Fisch7,8 oder Fütterung Präferenzen von Copepoden) zur Verfügung gestellt. Jedoch der physikalischen Prozess der Verdauung erschwert die visuelle Darm Inhaltsanalysen und in der Regel weichen vollmundigen Beute-Organismen9vermisst. Für die Arten Fütterung durch flüssige Einnahme oder für einige wirbellose Verbraucher, die ihre Nahrung vor der Einnahme, wie Amphipoden, intensiv zerkleinern ist visuelle Identifizierung von Beutetieren im Darminhalt unmöglich10. Aufgrund dieser Einschränkungen bietet die molekulare Analyse eine viel versprechende Alternative.

Molekulare Analysen haben jetzt ein gemeinsames Instrument ermöglicht schnelle und präzise Beute Nachweis im Darminhalt geworden. Solche Techniken sind vielfältig: Strategien basierend auf monoklonalen Antikörpern oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden häufig verwendet, wegen ihrer hohen Spezifität und Sensitivität11. Die Entwicklung von neuen monoklonalen Antikörpern ist Zeit- und kostenintensiv, daher die Anwendung der anderen molekularen Techniken ist nützlich, wenn Antikörper11nicht bereits vorhanden sind. Eine andere Möglichkeit ist die Verstärkung der Regionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA), wie ribosomale Ribonukleinsäure (RNA) Gene bei den meisten Arten, universelle Grundierung mit12,13. Wenn Sie diese Technik verwenden, ist es oft nicht möglich, das gesamte Spektrum der Beute Organismen in verschiedenen Quellen von DNA-14zu identifizieren. Ein effektiver Ansatz, diesen Nachteil zu vermeiden setzt gruppenspezifischen Primer verwenden für genetische Darm Inhaltsanalysen. Entwickelt, um nur DNA-Abschnitte bestimmter Zielgruppen zu verstärken und schließen alle anderen Arten15,16, ermöglichen gruppenspezifischen Primer Beute Organismen auf der taxonomischen Ebene der angegebenen Gruppen ohne Zeit- und kostenintensive Sekundäranalysen. Wie alle Inhaltsanalyse ausnehmen, bieten solche Analysen jedoch nur eine Momentaufnahme der Fressverhalten. Daher gilt als Kombination von molekularen Darm Inhaltsanalysen mit Analysen von Zeit-Integration von natürliche Tracer (z. B. stabile Isotope) vorteilhaft1,2.

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode für PCR-basierte Untersuchungen der Räuber-Beute-Interaktionen mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomalen DNA (rDNA) Regionen mit stabilen Isotopen-Analysen der gleichen Probe kombiniert werden. Wir beschreiben den Nachweis der DNA des einzigen Beute Gruppen durch Agarose-Gelelektrophorese. Darüber hinaus präsentieren wir eine Gelegenheit für weitere nachgelagerte Analysen der PCR-Produkte von solchen gruppenspezifischen Primer anwendbar, wenn eine höhere taxonomische Auflösung als die Primer Spezifität erforderlich ist. Da einzelne stranded DNA (SsDNA) Form tertiären Konformationen, die durch ihre primäre Sequenz17bestimmt sind Fragmente, führen kleine Variationen in Fragmenten, die durch solche gruppenspezifischen Primer verstärkt zu Konformationsänderungen. Solche Änderungen können durch Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mit Polyacrylamid-Gele17,18, ermöglichen eine genauere Identifizierung der Beute Organismen (bis auf Artniveau) erkannt werden.

Während Agarose-Gelelektrophorese ist ein gemeinsamer und preiswerte Werkzeug, um DNA-Fragmente zu visualisieren und bestimmen ihre ungefähre Länge19, die Auflösung hängt von der DNA und der Färbung Farbstoff verwendet20. In der Regel die Visualisierung ist geradlinig beim Arbeiten mit reiner DNA-Proben, aber potenziell geringe Mengen an Beute DNA in den Darminhalt der Verbraucher kann das Punktesystem von Agarose-Gel-Elektrophorese-Ergebnisse erschweren. Dennoch diese Nachweismethode ist möglich, eine geringe Anzahl von Verbraucher-Proben aus dem Bereich für einen Bildschirm oder ein paar Beute Gruppen, aber Komplikation in der Wertung macht das Screening eine hohe Anzahl von Proben für mehrere Beute Taxa sehr Zeit intensiv und damit nicht praktikabel. Ein empfindlicher Nachweisverfahren ist die automatisierte Analyse von Fragmenten über Kapillarelektrophorese, wodurch zusätzlich die Bestimmung der genauen Länge des Fragmente21. Mehreren Mikrosatelliten basierten Studien haben gezeigt, dass mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten, es möglich ist zu erkennen und zu bestimmen, verschiedene Fragmente von vergleichbarer Länge durch automatisierte Fragment Analyse22,23, 24. Daher stellen wir auch ein detailliertes Protokoll für parallelen Detektion von DNA aus mehreren Beute Gruppen mittels PCR mit beschrifteten gruppenspezifischen Primer und Erkennung über automatisierte Fragment Analyse mit einem automatisierten Sequenzer. Darüber hinaus präsentieren wir die Ergebnisse aus einer Fallstudie demonstriert, dass die Erkennung von Beute DNA über automatisierte Fragment Analyse Ansatz ermöglicht auch eine relative Quantifizierung von angesaugte Beute.

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Protokoll

1. Makroinvertebraten aus dem Feld zu sammeln und bereiten die Proben für genetische Darm Inhaltsanalysen.

  1. Sammeln Makroinvertebraten an jedem Standort sortieren Individuen Verbraucher Art von Interesse in einzelne Rohre und direkt Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis, Darm-Clearance und Abbau der DNA zu verhindern.
    Hinweis: Vermeiden Sie Proben in Alkohol, zu speichern, weil einige Makroinvertebraten Erbrechen tendenziell vor der Alkohol tötet.
  2. Verwenden Sie nur den Magen-Darmtrakt von mittelgroßen und großen (ca. > 3 mm) denkt Arten für genetische Darm Inhaltsanalysen, sodass die verbleibenden Angelegenheit der Probe für andere Verfahren (z. B. stabiler Isotope verwendet werden kann -Analyse). Beachten Sie, dass dies nicht zutrifft, bei der Untersuchung von sehr kleinen Taxa wie Wasser Milben. Daher können Schritte 1.2.1 und 1.2.2 übersprungen werden.
    1. Etwas auftauen Individuum und seine Magen-Darm-Trakt unter einem Stereomikroskop mit feinem Edelstahl Pinzette sorgfältig zu sezieren. Achten Sie darauf, nicht den Magen-Darmtrakt zur Vermeidung von Verlust der Materie Punktion.
    2. Clean-Zange mit Dekontaminationslösung um DNA und RNA Verunreinigungen nach der Zubereitung von jeder Magen-Darm-Trakt zu entfernen. Daher brüten Sie Zange für 10 min in die Dekontaminationslösung. Danach spülen Sie sie mit sterilem Wasser Restspuren entfernen und mit einem fusselfreien Papiertuch abwischen.
    3. Übertragung der seziert Magen-Darm-Trakt zu einer 2,0 mL-Safe-Lock-Reaktion Rohr mit 440 µL (450 µL möglich für den Einsatz von sich wiederholenden Pipette) Salz Extraktionspuffer [SEB; 0,4 M Natriumchlorid (NaCl), 10 mM Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethane Hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0 und 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure Binatrium Salz entwässern (EDTA) pH 8.0]. Geschäft bereit Proben bei − 20 ° C sofort bis die Extraktion von DNA. Sicherzustellen, dass innerhalb von wenigen Tagen DNA extrahiert werden.
  3. Verwenden eine modifizierte hohem Salzgehalt Extraktion Protokoll 25 DNA extrahieren.
    1. Nehmen Sie Proben aus der Tiefkühltruhe. Verwenden Sie Zange, um jede Probenröhrchen ein 5 mm Edelstahl Korn hinzufügen, und lassen Sie gefrorenen Proben auf der Bank bei Raumtemperatur (RT) Auftauen. Verwenden Sie eine Rührwerksmühle, um Proben für 1 min bei 15 Hz zu homogenisieren.
    2. Spin-down Proben mit einem kurzen Lauf einer Zentrifuge. Mithilfe von Mikroliter Pipetten hinzu 90 µL (100 µL möglich für den Einsatz von sich wiederholenden Pipette) 10 % Sodium Dodecyl Sulfat-Lösung (SDS) und 5 µL 10 mg/mL Proteinase K.
    3. Vortex Proben gründlich und inkubieren Sie Mischungen für 1 h bei 60 ° C mit konstanter Schütteln bei 400 u/min auf einen Thermomixer. Darüber hinaus gründlich Wirbel Proben alle 10 Minuten zur weiteren Förderung der Lyse.
    4. Spin down Proben mit einem kurzen Lauf einer Zentrifuge hinzufügen 350 µL 5 M NaCl ein Mikroliter-Pipette mit Vortex gründlich für ca. 0,5 - 1 min. Zentrifuge Proben für 40 min bei 16.200 x g bei 5 ° c
      Hinweis: Wenn mehrere hintereinander zu erfolgen haben, muss die Temperatureinstellung der Zentrifuge (nicht höher als 10 ° C) leicht angehoben werden, weil SDS zum Verklumpen neigt, wenn die Temperatur zu niedrig ist.
    5. Einsatz Mikroliter Pipetten ca. 600 µL Überstand in ein neues 1,5 mL Reaktionsgefäß übertragen. Seien Sie vorsichtig, nicht alles aus dem Pellet entfernen.
    6. Spitze Edelstahl Perlen aus Reaktionsgefäßen in ein Teesieb aus Edelstahl mit fließendem Wasser reinigen und inkubieren sie in einer Petrischale mit der Dekontaminationslösung für 10 min. gründlich abspülen Dekontaminationslösung mit sterilen Wasser und gereinigte Perlen in Ethanol (> 99 %, p.a. Grade) oder trocken bis Wiederverwendung.
      Hinweis: Reinigung von Perlen muss nicht direkt in diesem Schritt getan werden, sondern vielmehr kann getan werden, wenn in den folgenden Schritten gibt es Wartezeiten.
    7. Fügen Sie 600 µL eiskalte Isopropanol (p.a. Klasse), der Überstand mit einem Mikroliter pipette und sorgfältig Invertieren der Röhre ein paar Mal. Speichern von Proben über Nacht bei-20 ° c
    8. Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und für 20 min bei 16.200 × g und Raumtemperatur zentrifugieren. Sorgfältig den Überstand verwerfen und das Rohr sorgfältig mit fusselfreien Papiertuch trocken. Hinweis das Zentrifugieren Sie wenn die Umgebungstemperatur hoch (mehr als 25 ° C), ist bei 5 ° C, die Pellets Rutschen während den Überstand verwerfen zu vermeiden.
    9. Waschen Holzpellets enthaltende DNA mit 70 % Ethanol. Um dies zu tun, fügen Sie 200 µL eiskaltes Ethanol (70 %, p.a.-Grade) mit einem Mikroliter-Pipette und Zentrifuge Proben für 10 min bei 16.200 x g und Raumtemperatur (oder 5 ° C, bei Bedarf). Sorgfältig den Überstand verwerfen und das Rohr sorgfältig mit fusselfreien Papiertuch trocken. Verwendung einer 10 µL Pipette auf ca. 8 µL, pipette vorsichtig aus der restlichen überstand angepasst. Achten Sie darauf, nicht zu stören das Pellet.
    10. Trocknen das Pellet für ca. 5-20 min bei 60 ° C oder bei Raumtemperatur an der Bank, bis das Ethanol verdampft wird.
    11. Auflösen Pellet in 50-100 µL Nuklease-frei (Dampf sterilisiert und DEPC behandelt) Wasser (DdH 2 O), warten Sie mindestens 1 h (obwohl bessere Resultate werden über Nacht bei 4 ° C erreicht werden).
    12. Messen die Menge an DNA in jeder Probe mit einem Mikro-Volume Spektralphotometer enthalten nach Angaben des Herstellers ' Anweisungen. Machen eine arbeiten-Verdünnung jeder Probe mit ca. 2 bis 10 ng DNA / µL der Stammlösung in der Tiefkühltruhe halten. Die Arbeitslösung im Kühlschrank aufbewahren und stellen Sie sicher, dass weitere Probe Verarbeitung erfolgt in Kürze.

2. Funktionstüchtigkeit des DNA-Extrakte für die spätere Erkennung von kürzlich aufgenommenen Beute zu überprüfen.

  1. , Um sicherzustellen, das Vorhandensein und die Funktionstüchtigkeit der Vorlagen, Testen jedes DNA-Extrakt (Schritte 1.1 bis 1.3.11) mit universal Primer setzt für die jeweiligen Nahrungsquelle geeignet (z. B. Wirbellosen 16 , 26), die gezielt die gleichen nuklearen Untereinheit als gruppenspezifischen Primer, verwendet für die spätere Erkennung von Beute 25 , 27. Die folgenden Schritte beziehen sich auf die Verwendung von universal Grundierung Sätze NSF1419/20 und NSR1642/16 16 und LSU D1, D2 fw1 und LSU D1, D2 rev2 oder LSU D1, D2 rev4 26. Um zu beweisen, dass die PCR-Reaktion erfolgreich war und, dass keine Verunreinigungen auftreten, verwenden Sie eine Positivkontrolle mit DNA, die bereits erfolgreich verstärkt worden war und eine Kontrollprobe mit DdH 2 O anstelle von DNA innerhalb jeder PCR ausführen.
    1. , Grundierung vorzubereiten funktionierende Lösungen, die enthalten eine Endkonzentration 10 µM des Primers, pipette die entsprechende Menge des jeweiligen Primer Lager Lösung und DdH 2 O (abhängig von der Konzentration der Vorratslösung) in einem frisch 1,5 mL Reaktionsgefäß mit Mikropipetten.
    2. Primer, Deoxynucleotide Mischung (dNTPs), Reaktion Puffer, Taq DNA Polymerase und DdH 2 O in einem 1,5 oder 2,0 mL (abhängig von der Anzahl der zu bearbeitenden Proben) Reaktionsgefäß, dann Wirbel fügen Sie dieser Mischung. Detaillierte Volumes für das standard Reaktionsgemisch für eine 10 µL-PCR-Reaktion sind in Tabelle 1 angegeben (für Details von Chemikalien verwendet, siehe Tabelle of Materials).
    3. Einsatz Mikroliter Pipetten übertragen jeweils 1 µL DNA extrahieren in 9 µL the standard Reaktionsgemisch innerhalb einer PCR-Röhre (oder einen Brunnen einer PCR-Platte). Schließen Sie das Reaktionsgefäß oder die Reaktion Vertiefungen der Platte (mit Kappe Streifen).
    4. Programm der Thermocycler: ist das Standardprotokoll für das NSF1419/20 und NSR1642/16 16 Grundierung Set: 94 ° C für 4 min (Denaturierung), gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 50 ° C (Temperatur Glühen) für 30 s, 72 ° C für 90 s und letzte Erweiterung bei 72 ° C für 10 Minuten. Für die LSU Grundierung 26 Sätze, verwenden Sie die folgenden: 94 ° C für 4 min, gefolgt von 45 Zyklen von 94 ° C für 20 s, 52,5 ° C für 20 s, 72 ° C für 90 s und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 8 min.
    5. Ort PCR Schläuche oder Platten in den Thermocycler, schließen Sie den Deckel von der Cycler, und starten Sie das jeweilige Programm.
    6. Bereiten Sie eine 1,5 % Agarose-gel mit einer Pufferlösung mit Tris-base, Borsäure und EDTA (TBE Puffer) und Agarose. Wiegen Sie für die Zubereitung von 1,5 % Agarosegel, ein Gel Gießen Tablett mit Abmessungen von 10 cm × 7,5 cm × 3 cm 0,45 g Agarose in einem konischen Kolben, verwenden Sie ein Messzylinder, 30 mL 1 X TBE Puffer (89 mM Tris messen pH 7.6, Borsäure 89 mM und 2 mM EDTA, pH 8,0) und gießen Sie sie in den konischen Kolben. Erhitzen Sie die Mischung mit Hilfe einer Mikrowelle. Die Mikrowelle zu stoppen, wann immer es größere Luftblasen gibt und sorgfältig die Küvette schwenken, bis die Lösung nur eine Phase hat.
    7. Lösung auf etwa 60 ° C abkühlen wirbeln die Flasche in ein Wasserbad. Schnell Gießen Sie die Lösung in ein Gel Gießen Tablett, entfernen Sie Luftblasen zu, und legen Sie Kämme. Warten Sie ca. 20 min, bis Gel ausgehärtet wird.
    8. Füllung Elektrophorese Einheit mit 0,5 x TBE und einfügen Gel Casting Tablett, enthält das Agarosegel. Stellen Sie sicher, dass die Gel-Slots frei von Luftblasen sind.
    9. Spin-down die PCR-Produkte mit dem kurzen Lauf Option einer Zentrifuge Mini (Platte). Verwenden Sie eine Mikroliter-Pipette, um mischen jede 3 µL des PCR-Produkt mit 1 µL 6 x laden Farbstoff (40 % Saccharose und 0,25 % Bromophenol blue) und laden Sie sie in die Gel-Slots die Agarose-Gel. Pipette 1,5 µL einer 100 bp DNA-Leiter in einem Schlitz der jede Zeile mit einem Mikroliter-Pipette als standard Größe. Setzen Sie den Deckel des Referats Elektrophorese korrekt und anschließen Sie führt an ein Netzteil. Führen Sie das Gel mit 100 V/cm für 35 min.
    10. , Eine Färbung Bad vorzubereiten pour 1.000 mL 1 X TBE in einer quadratischen Kunststoff-Box lichtundurchlässig. Fügen Sie 50 µL Interkalation Bromid mit einem Mikroliter-Pipette, schließen Sie den Deckel von der Kunststoff-Box und schütteln Sie sie dafür Gleichverteilung der Interkalation Bromid.
    11. Das Gel aus dem Elektrophorese-Gerät entfernen und legen Sie sie in der Färbung Bad für etwa 10 Minuten. Anschließend nehmen Sie das Gel aus dem Flecken Bad und platzieren Sie es auf ein Gel-Dokumentations-System entsprechend der Bedienungsanleitung zu visualisieren.
    12. Analysieren nur Proben, die positive Ergebnisse (Fragmente von ausreichender Größe visuelle in Agarosegel) in Bezug auf Vorhandensein und Funktionsfähigkeit von Vorlagen für die spätere Erkennung von kürzlich aufgenommenen Beute gezeigt.
< t d > 0,25 µl
PCR-MixKonzentration ArbeitslösungMix für 10 µl PCR-ReaktionEndkonzentration in PCR
Primer FW10 µM0,5 µl0,5 µM
Primer RW10 µM0,5 & #956 ; l0,5 µM
Reaktion Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 mM (NH4) 2SO4 und 2 mM MgCl2 Endkonzentrationen)1 µM1 µl1 µM
dNTP10 mM0,25 mM
Taq Polymerase5 U0,1 μl0,05 U
DdH 2 06.65 μl
< Stro NG > gesamt Betrag Reaktionsgemisch9 μl
DNA1 μl

Tabelle 1: ausführliche Protokoll für die Vorbereitung des Reaktionsgemisches standard für 10 µL PCR Reaktion.

3. erkennen kürzlich aufgenommenen Beute/Lebensmittel mit gruppenspezifischen Primer-Sets mit Gelelektrophorese.

  1. Durchführung von PCR verwenden, die die Arbeitslösung DNA extrahiert (zubereitet nach Schritte 1.1 bis 1.3.11) und die gruppenspezifischen Primer (unbeschriftete, d. h. ohne Änderung) für die Beute Zielgruppe wie beschrieben in 2.1.1 bis 2.1.3 Schritte (für Variationen im Reaktionsgemisch für den jeweiligen Primer-Satz, siehe Tabelle 2). Führen Sie PCR Standardprotokolls in Schritt 2.1.4 angegeben (annealing Temperaturen für den jeweiligen Primer-Satz, siehe Tabelle 2).
    1. Verwenden Sie ein Steuerelement mit reiner DNA aus einer Probe, die Zugehörigkeit zu der jeweiligen Zielgruppe (Positivkontrolle) und eine Negativkontrolle mit reiner DNA von der Verbraucher-Arten in jeder PCR ausführen.
  2. Überprüfen den Erfolg der PCR-Reaktion unter Verwendung der Agarose-Gelelektrophorese in Schritten 2.1.6, 2.1.11 beschrieben. Die PCR-Reaktion war erfolgreich, wenn ein Fragment der entsprechenden Länge (siehe Tabelle 2) sichtbar ist für die positive Kontrolle aber nicht für die negativ-Kontrolle. Wenn eine oder beide der diese Kriterien nicht erfüllten, wiederholen Sie PCR.
  3. Einsatz Agarose gel Elektrophorese, wie 2.1.6, 2.1.11 beschrieben um festzustellen, ob die Beute Zielgruppe verbraucht hatte, durch die verschiedenen Verbraucher Proben getestet (per Urteil vom ob das Fragment von geeigneter Länge sichtbar ist). Achten Sie darauf, keine Fragmente mit geringen optischen Auflösung verpassen.
  4. Store PCR-Produkte bei 4 ° C, wenn weitere Analysen innerhalb der nächsten 24 h erfolgen werden, oder bei-20 ° C wenn Analysen später durchgeführt werden sollen.

4. Anschließend bestimmen verbrauchten Beute mit weiter flussabwärts SSCP Analyse über Polyacrylamid-Gel.

  1. Eine 9 % Acrylamid-Gel für SSCP Elektrophorese vorbereiten. Vorbereiten der Gebrauchslösungen in einem Labor Abzug.
    1. , Eine 200 mL Acrylamid funktionierende Lösung vorzubereiten, füllen ein Messzylinder mit 20 mL 10 X TBE (109 g Tris-Base, 55 g Borsäure und 40 mL 0,50 M EDTA, pH 8.0 aufgelöst in 1000 mL DdH 2 O) und ein weiteres mit 45 mL von 40 % (29,1) Acrylamid-Mix. FSME und Acrylamid-Mix in einem Messkolben (eine abgestufte Glasflasche mit einer 200 mL-Markierung ist hier auch entsprechende) gießen und DdH 2 O bis 200 mL Markierung hinzufügen. Arbeiten Sie weiter Lösung im Kühlschrank (4 ° C), bis benötigt. Verwenden Sie keine funktionierende Lösung älter als eine Woche.
    2. Wiegen 0,1 g Ammonium Bleichen (APS, Gebrauch ein Gleichgewicht mit mindestens 0,01 g Genauigkeit) in eine 1 mL volumetrischen Kolben und auflösen, die es durch Zugabe von DdH 2 O bis die Graduierung markieren Sie eine 10 % APS-Stammlösung vorbereiten. Übertragen Aliquote (ca. 350 µL) in frischem Reaktionsgefäßen.
      Hinweis: Eine aliquote ist für jedes Polyacrylamid-Gel benötigt. Speichern Sie die verbleibenden aliquOTS bei-20 ° C und nur Aliquote Auftauen, kurz bevor sie benötigt werden.
    3. Montieren eine Gel-Kassette zwei Glasplatten, ein Leerzeichen und einer gekerbten Glasplatte (je 20 cm x 20 cm), mit Abstandhalter (1,5 mm dick) zwischen ihnen gefährdet laufen herauf die Seiten des Glases. Verwenden Sie jede drei Fold-Back-Clips (32 mm) auf der rechten und linken Seite Gel Kassette ( Abbildung 1) zu fixieren.
    4. Mix 5 g Agarose und 250 mL 1 X TBE-Puffer in einem konischen Kolben vorzubereiten Lösung für ein 2 % Agarose-gel. Erhitzen Sie und kühlen Sie danach Mischung ab, wie in den Schritten 2.1.6 und 2.1.7 beschrieben. Gießen Sie rasch die Lösung in einer quadratischen Kunststoff-Box (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) und legen Sie das untere Ende der Gel-Kassette (Schritt 4.1.3) in die Agarose-Lösung. Einstellen Sie die Fold-Back-Clips am unteren Ende der Gel-Kassette bis zu einer Höhe so, dass sie auf dem Rand des quadratischen Kunststoffbox ( Abbildung 1 sitzen). Ca. 20-30 min warten, bis die Agarose-Stecker vollständig ausgehärtet ist.
    5. Füllen Sie eine 100 mL Messzylinder mit Acrylamid Arbeitslösung (Schritt 4.1.1) bis zur 60 mL-Markierung und Lösung in ein Becherglas gießen. Verwenden einer Mikropipette 300 µL ein Aliquot der Vorratslösung APS (Schritt 4.1.2) hinzufügen und anschließend 37,5 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) hinzufügen. Schnell, Gießen Sie die Lösung zwischen den Glasplatten der Gel-Kassette. Alternativ die Lösung zwischen den Glasplatten mit einer 100 mL Einwegspritze mit einem 1.000 µL Pipettenspitze angepasst an die Spitze der Injektion der Spritze Spritzen.
    6. Vorsichtig einsetzen einen 1,5 mm dicken standard-Kamm am oberen Ende zwischen den Glasplatten. Der Kamm muss durch die Polyacrylamid-Lösung eingeschlossen werden. Warten Sie ca. 1 h, bis das Polyacrylamid-Gel polymerisiert wird. Belüftung während der Polymerisation so weit wie möglich vermeiden, denn es erhöht sich den Zeitaufwand für das Gel zu polymerisieren.
      Hinweis: Es ist möglich, gegossene Gele in verschlossenen Plastiktüten mit einem feuchten Tuch im Kühlschrank bis zu 3 Tage speichern.

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Abbildung 1: Bild zur Veranschaulichung der Bau, Polyacrylamid-Gele gießen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

  1. legen Sie die Gel-Kassette enthält das Polyacrylamid-Gel vorbereitet, zu einer vertikalen Elektrophorese-Einheit. Füllen Sie die Elektrophorese-Einheit mit den entsprechenden Betrag (abhängig von der Art der Elektrophorese Einheit) von 0,5 x TBE und kühlt das Gerät bis zu 10 ° C mit einer gekühlten Zirkulator.
  2. Für DNA Denaturierung, Heizen Sie ein Thermal-Block /-Cycler bis 96 ° C. Prepare Denaturierung Puffer mit 95 % Formamid (99,5 % p.a. Klasse) und 5 % igen wässrigen Lösung mit 0,25 % Bromophenol blue und 40 % (w/V) Saccharose.
  3. Die PCR-Produkte aus dem Kühlschrank oder der Tiefkühltruhe nehmen und Auftauen. Spin-down die PCR-Produkte mit dem kurzen Lauf Option einer Zentrifuge Mini (Platte). Mixen Sie jeweils 4 µL des PCR-Produkt mit 4 µL Denaturierung Puffer. Erhitzen Sie Mischungen für 5 min bei 96 ° C unmittelbar gefolgt von einem kühlenden Schritt in Eiswasser für 10 min.
    Hinweis: Proben sollten auf das Polyacrylamid-Gel (Schritt 4.5) sofort im Anschluss geladen werden.
  4. Kamm aus dem Polyacrylamid-Gel (Schritt 4.1.6) zu entfernen und mit einer Mikropipette vollständig jede Probe in ein Gel-Steckplatz geladen. 8 W pro Gel Elektrophorese Laufzeit während ständig die Kühleinheit der Elektrophorese, 10 ° C. laufen benötigte Zeit hängt von der Größe des Fragments getrennt werden. Für Fragment Größen von ca. 210 bp, die Laufzeit beträgt ca. 3,5 h angemessen.
  5. , Eine Färbung Bad vorzubereiten Gießen 1.000 mL 1 X TBE in einem quadratischen Kunststoff box lichtundurchlässig und hinzufügen 30 µL Farbstoff (geeignet, einzelne stranded DNA zu beflecken) Färbung mit einem Mikroliter-Pipette. Schließen Sie den Deckel von der Kunststoff-Box und schütteln Sie sie dafür Gleichverteilung der Färbung Färbung.
  6. Entfernen die Gel-Kassette aus der Elektrophorese-Kammer und trennen Sie die eingekerbte Glasplatte vorsichtig aus dem Gel. Schieben Sie das Polyacrylamid-Gel von der leere Glasplatte in der Färbung Bad. Legen Sie die Färbung Bad auf ein Schütteln Plattform und Fleck Gel für 20 bis 30 min. mit konstanter schütteln.
  7. Nimm das Gel vorsichtig aus dem Flecken Bad und lege ihn auf den UV-Tisch eines Dokumentationssystems.
    Hinweis: Aufgrund der Instabilität des Gels ist es ratsam, den vorherige Schritt mit zwei Personen zu behandeln. Eine Person sollte die Färbung Bad neben dem UV-Tisch halten und ein anderes unter das Gel mit beiden Händen greifen, nehmen Sie es heraus und schieben Sie es auf den UV-Tisch sollte.
  8. Schließen den Deckel oder Tür das Dokumentationssystem und fotografieren Sie laut Hersteller ' Bedienungsanleitung s.

5. Mehrere kürzlich eingenommen Beute Gruppen parallel mit automatisierten Fragment Analysen zu erkennen.

  1. Analysieren, die der Darm Inhalt DNA extrahiert mit den 16 gruppenspezifischen Primer setzt gemäß Tabelle 2, mit einer Zündkapsel eines Satzes durch Modifikation mit einer Färbung Färbung gekennzeichnet (siehe Tabelle 2 Spalte mit der Überschrift Änderung), und verwenden Sie die Methoden der parallelen Detektion von einem automatisierten Sequenzer.
    1. Beschriebenen nutzen die Arbeitslösung des DNA-Extrakte (zubereitet nach Schritte 1.1 bis 1.3.11) und Verhalten zu trennen PCRs für jede Grundierung wie in Schritten 2.1.1 bis 2.1.5 (Variationen in der Mischung sind in Tabelle 2 angegeben). Verwenden Sie mindestens ein Steuerelement mit reiner DNA aus einer Probe, die Zugehörigkeit zu der jeweiligen Zielgruppe (Positivkontrolle) und eine Negativkontrolle mit reiner DNA von der Verbraucher-Arten in jeder PCR ausführen.
    2. Laufen PCRs in den Thermocycler Standardprotokolls der PCR gegeben im Schritt 2.1.4, angepasst an die jeweiligen Anlasstemperatur (und die Anzahl der Zyklen) für jedes set in Tabelle 2 angegebenen Grundierung.
      Hinweis: Verwenden Sie die gleichen DNA-Verteilung der Reaktion Brunnen für die PCR mit jedem der 16 verschiedenen Grundierung Sets zu vereinfachen, spätere Zusammenlegung von PCR-Produkte für zusammengefasst Fragment Analysen automatisierte.
    3. Store PCR Produkte bei-20 ° C bis alle PCRs Zugehörigkeit zu einer Charge für die automatisierte Fragment-Analysen (siehe Tabelle 2) fertig sind. PCR-Produkte im Dunkeln halten und lagern Sie sie nicht länger als 1 Woche vor dem Fragment Analysen.

figure-protocol-2
Tabelle 2: Details der 2 Chargen von 15 gruppenspezifischen Primer-Paaren gegründet von Koester Et al. (2013) und der neu gestalteten Jae28S Primerpaar Regionen der 18 oder 28 s rDNA aus 16 Zielgruppen aquatische Makroinvertebraten verstärken. f, forward Primer; R, reverse Primer; 18, zielt Grundierung 18 s rDNA Untereinheit; 28 s, Zündkapsel zielt auf die 28 s rDNA Untereinheit. " Hydrobiologia, Dikerogammarus Villosus (Crustacea, Gammaridae) ist ein ' killer Shrimp ' im Rhein-System?, 768, 2016, Tabelle S1, ergänzendes Material Seite 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer International Publishing Schweiz 2015) " mit freundlicher Genehmigung des Springer-Verlags. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Tabelle.

  1. zu erkennen, die amplifizierten Fragmente aller 16 Grundierung Sets führen Sie Analysen durch automatisierte Fragment in den 2 Chargen in Tabelle 2 angegeben. Verwenden einen interne Größe Standard (DNA-Größe Standard Kit - 400 [Charge B] und -600 [Charge A], beziehungsweise) Fragmentlänge bestimmen. Bereiten Sie die Sequenzierung Platte und automatischen Sequenzer, wie in den folgenden Schritten beschrieben. Beachten Sie, dass dieses Verfahren eingestellt werden, wenn eine andere Plattform als die angegebenen Materialien verwenden könnte.
    1. Laufen jede Charge-Probe, bereiten Sie eine Mischung mit Probe laden Lösung (SLS) und der jeweiligen Größe standard. Pipette 21,6 µL SLS und 0.4 µL DNA Größe Standard-Kit - 600 pro Probe eines Batch und bzw. 21,7 µL SLS und 0,3 µL DNA Größe Standard-Kit- 400 pro Probe Charge b
    2. Die PCR-Produkte von den 8 PCRs Zugehörigkeit zu der jeweiligen Charge aus dem Gefrierschrank nehmen und Auftauen. Stellen Sie sicher, dass sie immer noch im Dunkeln gehalten werden.
    3. Verwenden eine Mikroliter-Pipette, die Anzahl der Vertiefungen der Sequenzierung Platte benötigt (Anzahl der zu analysierenden Proben) laden mit jeweils 22 µL der jeweiligen Mischung im Schritt 5.2.1 beschrieben. Spin-down die PCR-Produkte von jedem der 8 PCRs mit dem kurzen Lauf Option einer Zentrifuge Mini (Platte). Jeweils 1 µL pro PCR Produkt von jeweils 8 PCRs in die jeweiligen Vertiefungen der Sequenzierung Platte mit einem Mikroliter-Pipette übertragen.
    4. Sorgfältig spin-down diese Mischung in die Sequenzierung Platte mit einem kurzen Lauf einer Mini-Platte-Zentrifuge und jeder der Brunnen mit einem Tropfen Mineralöl verwendet zu überlagern. Jeweiligen Reaktion Brunnen einer Puffer-Platte mit 250-300 µL DNA Trennung Puffer füllen.
    5. Die Software für die Kapillare Sequenzer verwenden, um erstellen Sie eine Beispiel-Setup nach Angaben des Herstellers ' Anweisungen. Weisen Sie die Methoden zum Sample-Sets zu steuern und bestimmen die Reihenfolge der Methoden verwendet, um Daten zu verarbeiten (siehe Tabelle 3 für die Ausführung von Bedingungen für die Nutzung mit der Größe Standard in der Materialtabelle angegeben). Beachten Sie, dass es entscheidend ist, dass die Verteilung der Proben innerhalb der Beispiel-Setup die Probe-Zuordnung in der Sequenzierung Platte entspricht (einschließlich positive und negative Kontrollen, siehe Schritt 5.1.1) und die Methode ausreichend für Fragment mit den jeweiligen analysiert Größe Standard gewählt wird.
    6. Füllen Sie ein Tablett Benetzung mit entionisiertem Wasser und legen Sie die Sequenzierung Platte, Platte Puffer und Benetzung Tablett in der Kapillare Sequencer. Setzen Sie eine Gel-Patrone mit einer ausreichenden Menge an frischen DNA Trennung Gel, welches für die Probe laufen benötigt wird. Führen Sie die Sequenzierung Platte mit dem vorbereiteten Probe Setup.
denaturieren Seperate Kapillare injizieren
TemperaturZeitSpannungZeitSpannungZeit
Größe standard 60090 ° C120 s4,8 kV60 min50 ° C warten auf Temp: Ja2,0 kV30 s
Größe standard 40090 ° C120 s6 kV45 min50 ° C warten auf Temp: Ja2,0 kV30 s

Tabelle 3: spezifische Bedingungen für Fragment Analysen auf den automatisierten Sequenzer mit Hilfe der Größe Standards gegeben in der Materialtabelle.

  1. die Ergebnisse analysieren raw-Daten zu exportieren und diese Daten auf ein Fragment-Analyse-Programm hochladen. Wählen Sie standard Farbstoff Farbe Aufträge des jeweiligen Herstellers festzulegende Farbstoff Farbkanäle.
    1. Erstellen eine Gliederung des erwarteten Bereichs Fragmentlänge verstärkt durch die einzelnen gruppenspezifischen Primer Panel innerhalb einer Charge gemäß der Bedienungsanleitung des Programms setzt.
    2. Zur Verarbeitung der Daten wählen Sie das entsprechende Feld, angemessene Größe Standard, Standardfarbe und Art der Analyse und Prozedur ausführen. Wählen Sie die Electropherogram-Option Fluoreszenzsignal Intensitäten von Kapillarelektrophorese Instrumente als eine einzige Zeile Spur für jede Farbe angezeigt. Markierungen/Primer-Sets der jeweiligen Fragment Anzeigebereich angezeigt werden und die genaue Länge des gefundenen Fragments verbunden mit dem Zentrum der jeweils genannte Gipfel wird (in den meisten Programmen durch Färbung oder zugewiesene Name) markiert automatisch.
    3. Für jede Probe berechnen, wie eng die Probe ' s interne Größe standard entspricht den gewählten Größe Standard um den Erfolg der Größe Berufung zu beruhigen. Die meisten Fragment-Analysen-Programme haben eine Option, um automatisch berechnen und visualisieren dieses Match. Wenn der Größe-Aufruf fehlgeschlagen ist, wiederholen Sie Fragment Analysen für diese Proben.
    4. Visuell überprüfen Sie die Electropherogram jeder Probe und bestätigen/unconfirm jeder Gipfel namens für jede Markierung/Grundierung separat festgelegt. Fügen Sie manuell unangebracht Gipfeln, die passen der Kriterien eines Satzes Marker/Primer oder falschen entsprechend der Gebrauchsanweisung des verwendeten Programms löschen. Die Basenpaare Größe oder Lagerplatz Namen in das ' Allel Label '. Berechnung und Anzeige der Peak-Spezifikationen in der ' Peak Tisch '.

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Ergebnisse

Wir haben erfolgreich in diesem Protokoll für Diät-Analysen im Rahmen verschiedener Studien beschriebenen Schritte. In diesem Abschnitt zeigen wir Beispiele beschreiben die Anwendbarkeit der einzelnen Abschnitte des Protokolls.

Als Beispiel um die Wirksamkeit von gruppenspezifischen Primer-Sets von der Autoren-28 und das Potenzial der nachgeschalteten Analysen der PCR-Produkte von SSCP Analysen, gegründet...

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Diskussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode für PCR-basierte Bestimmung der Räuber-Beute-Interaktionen von Feldproben über gruppenspezifischen Primer für rDNA Regionen, die mit anderen nicht-molekulare Analysen der gleichen Proben kombiniert werden können. Allerdings gibt es einige wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens ist es wichtig, versichert die Spezifität der Primer verwendet. Zweitens ist es wichtig zur Vermeidung von Verschmutzung und Verlust der Darm Inhalt Material bei der ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken Silke Classen vom Forschungsinstitut für Ökosystem Analyse und Bewertung (Gaiac), RWTH Aachen für ihre Hilfe bei der Schaffung der in diesem Protokoll verwendeten gruppenspezifischen Primer-Sets. Wir danken auch Peter Martin und Laura Schynawa von der Universität Kiel für die Zusammenarbeit in der Wasser-Milben-Experimente. Wir danken auch der technische Laboranten zur Aufbewahrung Labor reibungslos läuft und das Register der Unternehmen und Katalognummern vorbereiten. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Projekt GE 2219/3-1) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
flüssiger StickstoffBeliebigNAFür den Transport von Feldproben von Makroinvertebraten ins Labor.
1,5 ml Reaktionsgefäße - SafelockAnyNAFür die Entnahme von Verbraucherproben im Feld und die anschließende Konservierung in flüssigem Stickstoff müssen Reaktionsröhrchen nicht unbedingt PCR-sauber sein. Um ein Explodieren der Röhrchen zu vermeiden, sollte der Deckel der Röhrchen mit einer Nadel durchstochen werden.
StereomikroskopBeliebigNAStellen Sie sicher, dass die Vergrößerung geeignet ist, um den Magen-Darm-Trakt der Größe des interessierenden Verbrauchers vorzubereiten.
PetrischalenBeliebigNAZum Sezieren des Magen-Darm-Trakts von Verbraucherproben unter dem Stereomikroskop.
Edelstahl-Foceps: Dumont Pinzette Nr. 7BioformB40dDiese gebogene Pinzette aus Edelstahl kann manchmal sehr leicht sein, um die Probe zwischen dem gebogenen Teil zu halten, ohne den Magen-Darm-Trakt zu durchstechen.
Edelstahl-Foceps: Dumont Pinzette Electronic Nr. 5BioformB40bDiese feine Edelstahl-Pinzette eignet sich hervorragend für die Aufbereitung des Magen-Darm-Trakts von Verbraucherproben.
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409,1000RFDekontaminationslösung zur Entfernung von DNA- und RNA-Kontaminationen
fusselfreies PapiertuchJedeNA
LaborwaageJedeNADie Genauigkeit muss mindestens 0,01 g betragen.
Mikroliter-Pipetten (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)AlleNA
Safe-Lock Röhrchen 2,0 mlVWR211-2165Es ist entscheidend, dass diese Röhrchen frei von DNA, DNase, RNase und PCR-Inhibitoren sind (PCR clean)!
Safe-Lock Röhrchen 1,5 mlVWR211-2164Es ist entscheidend, dass diese Röhrchen frei von DNA, DNase, RNase und PCR-Inhibitoren sind (PCR clean)!
Natriumchlorid ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISOCarlroth3957.3Für Salzextraktionspuffer (SEB) und 5M NaCl-Lösung, die für die Extraktion von DNA benötigt wird.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Triscarlroth4855.2Für Salzextraktionspuffer (SEB) und FSME-Puffer
Mikroliterpipetten (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)carlroth8043.1Für Salzextraktionspuffer (SEB) und FSME-Puffer
Borsäure ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISOCarlroth6943.2Für TBE-Puffer. Nicht erforderlich, wenn kommerziell verfügbarer FSME-Puffer bezogen wird.
Natriumdodecylsulfat (SDS)carlroth4360.1Zur Extraktion von DNA,
Proteinase K, Lyophil.Carlroth7528.1Arbeitslösung mit einem Inhalt von 10 mg/ml herstellen.
TissueLyser IIQuiagen85300Kugelmühle zur Homogenisierung der Proben.
Edelstahlperlen, 5 mmQuiagen69989Zum Homogenisieren von Proben.
Heizung ThermoshakerJederNA
Vortex-MischerJederNA
Kühlzentrifuge: himac CT 15 REHitachiNAKühlzentrifuge für die Zentrifugation während der Extraktion von DNA (Protokoll 1).
IsopropanolCarlroth6752,5
Ethanol 99,8 %, p.a.Jedes
Wasser Molekularbiologisches Wasser (ddH2O)AppliChemA7398,1000nukleasefreies (stromsterilisiertes und DEPC-behandeltes) Wasser, das zur Resuspension von DNA verwendet wird, und wann immer im Manuskript auf ddH2O Bezug genommen
wird Unmodifizierte OlegonukleotideEurofins MWG OperonNAPrimer unmarkiert
Modifizierte OlegonukleotideMetabion International AGNAPrimer gelabelt
peqGOLD Taq all inclusiveVWR Peqlab01-1000Taq all inclusive für PCR-Reaktionsgemische (Reaktionspuffer Y und S, dNTPs und MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler oder peqStar96x Universal GradientPeqlabNADie Primer-Sets wurden ursprünglich auf einem Primus 96 Advanced Gradient Thermocycler erstellt. Da dieser Cycler schon recht alt war, haben wir dann mit dem peqSta96x (der auch das ältere Modell simulieren konnte) überprüft, ob unsere Primer-Sets unter den gleichen Bedingungen effizient und spezifisch sind. Tests haben jedoch gezeigt, dass unsere Primer gut funktionieren und immer noch spezifisch sind (vgl. Koester et al. 2013), ohne die Simulation der alten Maschine zu verwenden.
Standard 96-Well-PCR-PlattenVWR Peqlab732-2879Wird für PCR-Reaktionen verwendet.
Low Profile Tube Stripes 0,15 ml mit Flat Cap StripesVWR Peqlab732-3223Cap Stripes zum Verschließen der PCR-Platten.
AgarosePeqlab35-1020Wird für die Gelelektrophorese verwendet.
MikrowelleBeliebigNA
KonuskolbenBeliebigNA
MesszylinderBeliebigNA
Horizontale Elektrophoreseeinheit und entsprechende Kämme mit ZähnenBeliebigNAFür die Agarose-Gelelektrophorese.
Elektrophorese-Netzteil PS3002Life TechnologiesNA
Ethidiumbromidlösung 1 %Carlroth2218.1Wird zur Herstellung eines Färbebades für Agarosegele verwendet.
FormamidCarlroth6749.1Wird für den Denaturierungspuffer für SSCP-Analysen benötigt.
BromphenolblauAppliChemA3640.0010Wird für den Ladefarbstoff für die Agarose-Gelelektrophorese benötigt.
SaccharoseCarlroth4621.1Wird für den Ladefarbstoff für die Agarose-Gelelektrophorese benötigt.
100 bp-DNA-Leiter verlängertesCarlrothT835.1Als Größenstandard für die Agarose-Gelelektrophorese.
UV-DokumentationssystemBeliebigNAZur Visualisierung von Gelelektrophorese-Ergebnissen.
Rotiphorese NF-Acrylamid/Bis-Lösung 40 % (29:1)CarlrothA121.1Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
AmmoniumperoxydissulfatCarlroth9592.2Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
Foldback-Clips (32 mm)BeliebigNAFür die Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
quadratische Kunststoffdose (21 x 6,5 x 5 cm)AlleNAZur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
Tetramethylethylendiamin (TEMED)carlroth23.67.1Zur Herstellung von Polyacrylamid-Gelen.
BecherAnyNA
RC 10 Digitaler KühlerVWR462-0138Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Vertikale Elektrophoreseeinheit P10DS (OWL Separation Systems)VWR700-2361Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Gekerbte GlasplatteVWR730-0261Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Blinde GlasplatteVWR730-0260Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
SpacerVWR730-0262Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
Kamm mit 25 ZähnenVWR730-0294Für SSCP-Analysen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
RüttelplattformBeliebigNAZum ständigen Schütteln des Färbebades.
GelStar Nukleinsäure-Fleck (Lonza Rockland, Inc.)Biozym850535 (50535)Zum Färben von Polyacrylamid-Gelen.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bpAB Sciex608098Für automatisierte Fragmentanalysen. Größenstandard für Charge B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bpAB Sciex608095Für automatisierte Fragmentanalysen. Größenstandard für Charge A.
Sample Loading Solution (SLS)AB Sciex608082Für automatisierte Fragmentanalysen.
Sequenzierungsplatte - 96 Well Polypropylen-PCR-MikroplatteCostar6551Für automatisierte Fragmentanalysen.
Plattenzentrifuge, PerfectSpin PVWR PeqlabNAMini-Plattenzentrifuge zum Schleudern von PCR-Produkten.
Pufferplatte - 96 Well EIA/RIA Durchsichtiges Polystyrol mit flachem Boden, unbehandelte MikroplatteCorning9017Für automatisierte Fragmentanalysen.
GenomeLab TrennpufferAB Sciex608012Für automatisierte Fragmentanalysen.
Trenngel - LPAIAB Sciex608010Für automatisierte Fragmentanalysen.
Sequenzer - CEQ8000 genetisches AnalysesystemBeckman CoulterNAFür automatisierte Fragmentanalysen.
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNAZur Analyse der Ergebnisse automatisierter Fragmentanalysen.
Eine NA

Referenzen

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