Methodenartikel

Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster

DOI:

10.3791/56135

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12. September 2017

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1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Papier beschreibt behoben-Potential amperometrischen Bildaufzeichnungen mit Kohlefaser-Elektroden und enzymatische Biosensor-Technologie zur Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat mit hoher zeitlicher Auflösung während natürliche lohnende Verhalten in der weibliche Hamster.

Zusammenfassung

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Neurotransmitter-Freisetzung auf einer schnellen Zeitskala zu messen, können Muster Neurotransmission in Zusammenhang mit bestimmten Verhaltensweisen oder Manipulationen werden; ein mächtiges Werkzeug in der Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und Schaltung. Während die Technik der Mikrodialyse jahrzehntelang verwendet worden ist, um nahezu jeden Analyten von Interesse im Gehirn zu messen, ist diese Technik in zeitlicher Auflösung begrenzt. Alternativ ist Schnellscan zyklischer Voltammetrie zeitlich präzise und extrem empfindlich; Da diese technisch schwierige Methode stützt sich auf die Electroactivity des Analyten von Interesse, entfällt jedoch die Möglichkeit, Nonelectroactive Substanzen (z.B. der Neurotransmitter Glutamat) zu erkennen. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von ein Turnkey-System, das feste Potenzial strommesstechnik und enzymatische Biosensoren elektroaktive und Nonelectroactive Neurotransmitter mit zeitlichen Präzision zu messen. Die Paarung dieser beiden leistungsfähigen Methoden ermöglicht die Messung der tonischen und phasischen Neurotransmission mit relativer Leichtigkeit und ermöglicht die Aufnahme von mehreren Neurotransmittern gleichzeitig. Dieses Manuskript soll den Prozess der Messung von Dopamin und Glutamat Neurotransmission in Vivo mit einem natürlich lohnende Verhalten (d. h., Sexualverhalten) in weibliche Hamster, mit dem Ziel der Darstellung zeigen die technische Machbarkeit des Assays für die Prüfung anderer Verhaltensweisen und experimentelle Paradigmen.

Einleitung

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Die Fähigkeit zur Messung der Neurotransmitter-Freisetzung in wach Verhalten Tiere erlaubt Forschern, bestimmte Verhaltensweisen mit räumlichen und zeitlichen Muster der Neurotransmission, ein leistungsfähiges Werkzeug zu untersuchen, Mechanismen und Schaltung zugrunde liegen beide verbinden natürliche und das operante Verhalten in Echtzeit. In der Vergangenheit wurde Mikrodialyse eingesetzt, um sowohl elektrisch reaktiver und nichtreaktiven Stoffe in das extrazelluläre Milieu des Gehirns1messen. Diese Technik verwendet einen kontinuierlichen Fluss von einer wässrigen Lösung ähnlicher ionische Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit dur....

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Protokoll

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alle hier beschriebene Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Minnesota genehmigt und stehen im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren 13 .

1. Tiere und Kanülierung Chirurgie

  1. erhalten syrischen Hamster aus einer gemeinsamen Tier in ca. 55 Tage alt.
    Hinweis: Obwohl das Alter der Tiere wegen Einschränkungen der verschiedenen experimentellen Paradigmen variieren, für sexuelles Verhalten ist es wichtig, geschlechtsreifen Tiere zu erhalten, die alle etwa im gleichen Alter sind.
  2. Haus-Tiere in e....

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Ergebnisse

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Mit der elektrochemischen und Verhaltensstörungen Codierung oben beschriebenen Methodik, hat dieser Übungseinheit begonnen, tonischen und phasischen Schwankungen von Dopamin und Glutamat bei in-Vivo -Aufnahmen des Sexualverhaltens zu charakterisieren. Durch die zeitlich genaue Art dieser Methodik können wir genauer Neurotransmission während sexuelles Verhalten charakterisieren; sowie zuschreiben bestimmte Änderungen in Release-Muster mit entsprechenden tonischen Veränderungen wäh.......

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Diskussion

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Obwohl relativ einfach, können einige Probleme entstehen, wenn diese Technik beschäftigt. Erstens muss die stereotaktischen Platzierung der Sonden präzise sein: im Gegensatz zu Mikrodialyse, die einen größeren Radius das extrazelluläre Milieu rund um die Sonde zu Proben, ermöglicht diese Technik nur die Messung eines Neurotransmitters, die direkt in Berührung kommt mit der Sonde. Zweitens bei der Kohlefaser-Aufnahme durch die geringe Breite der Faser, Bruch auftreten kann, und die Sonde muss mit bewusste Sorgfalt eingese.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Autoren möchten Studenten Daniel Korus für seine Hilfe der Matlab-Code ausgeführt und Studenten Alex Boettcher für seine Hilfe bei der Durchführung der Verhaltensexperimente danken. Dieses Projekt wird unterstützt durch NSF IOS 1256799, R.L.M und durch das National Institute on Drug Abuse der National Institutes of Health unter Preis Anzahl T32DA007234.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NembutalOak Pharmaceuticals Inc.76478-501-50Pentobarbital-Natrium-Injektion, USP. Dieses Labor verwendet 8,5 mg/100 g Körpergewicht, die intraperotinal injiziert werden.
Loxicom Analgetikum Norbrook Laboratorien 6451603670NSAID, ein entzündungshemmendes und schmerzstillendes Medikament, das zur postoperativen Schmerzkontrolle verwendet wird. Generika: meloxicam. 
Enroflox Antibiotikum Norbrook Laboratorien 5552915411Fluorchinolon-Antibiotikum zur postoperativen Infektionsprävention. Generika: Enrofloxacin.
Beuthanasie-D Merck Animal Health00061047305Pentobarbital-Natrium, Phenytoin-Natrium-Euthanasiemittel.
KnochenschraubenPinnacle Technologies, Inc.8111-161/8" Knochenschraube (Packung à 16) zur Befestigung der Schädelkappe am Schädel.
Dental-Acryl (Bosworth Duz-All)Bosworth Artikel-Nr.: 166261C Selbsthärtendes Dentalacryl wird bei der Konstruktion einer Schädelkappe verwendet, um die Kanüle und die Kopfhalterung am Schädel zu befestigen.
Hardware-Biosensor-Setup Pinnacle Technologies, Inc.8400-K2Pinnacle bietet komplette Hardware-Kits für neue Benutzer unseres angebundenen Biosensorsystems für Ratten. Die Kits enthalten einen Kommutator, einen Vorverstärker sowie ein Datenaufbereitungs- und -erfassungssystem
Basis-VideocomputerpaketPinnacle Technologies, Inc.9000-K1Das Basis-Computerpaket enthält einen vorkonfigurierten Computer mit ausreichend Festplattenspeicher, einen hochauflösenden Monitor, eine Tastatur und Maus, eine unterbrechungsfreie Stromversorgung und alle erforderlichen Kabel.
Video EQ700 EverFocus Kamera VerpackungPinnacle Technologies, Inc.  9000-K10 nachtsichtfähige Box-Kamera EQ700 mit unabhängiger IR-Quelle wurde als Teil des Pinnacle Videocomputer-Pakets erworben. Dome-Kamera (9000-K9) und HD-Kamera (9000-K11) sind ebenfalls erhältlich.
Sirenia AkquisitionssoftwarePinnacle Technologies, Inc.Kostenlos zum Download bei pinnaclet.comSirenia  Die Erfassung bietet eine einzige Plattform für die Aufzeichnung von Daten von jedem Pinnacle-Hardwaresystem. Die Software bietet die Synchronisierung aller Datenströme, benutzerdefinierte Einstellungen, Datenkonsolidierung und mehrere Exportoptionen. Darüber hinaus enthält die Software grundlegende Überprüfungs- und Analysemodule für Biosensor-Aufzeichnungen. Sirenia  Bietet kostenlose LL-in-One-Software, die sich ideal für die Datenerfassung und -überprüfung eignet.
Angebundene Ratte  in vitro  KalibrierkitPinnacle Technologies, Inc.7000-K2-T-BAS Um die aktuellen Veränderungen, die von einem Biosensor gemessen werden, mit den tatsächlichen Änderungen der Analytkonzentration in Beziehung zu setzen, ist es notwendig, den Biosensor vor der Implantation in das Tier zu kalibrieren. Der Prozess bestätigt auch die Integrität und Selektivität der Sensoren. Das Kalibrierkit enthält einen 20-ml-Becher mit Mantel (#7058), einen 1/2" x 1/8" Magnetrührstab (#7059), eine rechtwinklige Klemme (#7056), eine 2-polige Klemme mit einfacher Einstellung (#7055), einen 4-Kanal-Kalibriervorverstärker (#7053) und einen Kalibrierhalter (#7051).
Rührplatte Corning6795-410DCorning digitaler Rührer, 5" x 7", 120 VAC zum Drehen des Magnetrührers in einem ummantelten Becherglas während der in vitro Kalibrierung von Glutamat-Biosensoren.
Wasserbad, das für eine geschlossene Zirkulation geeignet istPolyScience8006A11BPolyScience 8006A11B 6L Standard Digital beheiztes Umwälzbad, 120VAC Wasserbad wurde mit Kunststoffschläuchen verwendet, um den ummantelten Becher auf physiologische Temperatur zu erhitzen.
Kohlefasersensor mit BASi RattenkanülenPinnacle Technology, Inc.7002-CFSKohlefaserelektrode zur Aufzeichnung der Dopamin-Neurotransmission.
Ag/AgCl-ReferenzelektrodePinnacle Technology, Inc.7065Notwendig für Kohlefaseraufnahmen.
Glutamat-Biosensoren Pinnacle Technology, Inc.7001 Enzymatische Biosensorsonde zur Aufzeichnung der glutamatergen Neurotransmission.
BASi FührungskanülenPinnacle Technologies, Inc.7030 Führungskanülen, die in die interessierende Hirnregion implantiert werden, um die Sonde zu führen.
BASi Kanüle Kunststoff-Kopfstück für Ratten Pinnacle Technologies, Inc.7011 Die Kopfhalterung stabilisiert die Sonde und wird am Potentiostaten befestigt.
Die

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7, Unit 7.1.1-7.1.28 (2009).
  2. Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
  3. Lindsay, S....

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Schlagwörter

Fast Scan ZyklovoltammetrieFestpotenzial Amperometrieenzymatisches BiosensingMessung der NeurotransmitterfreisetzungIn vivo NeurotransmissionDopamin Glutamat DetektionAnalyse des SexualverhaltensNucleus accumbens coreTechniken der Verhaltensneurowissenschaften

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