Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

9K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

9. April 2018

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Zusammenfassung

Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) O157: H7, das ist ein durch Lebensmittel übertragene Erreger, Causesdiarrhea, hämorrhagische Kolitis (HS) und Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), um den Darm-Trakt des Menschen besiedeln. Um detaillierte Mechanismus der EHEC Kolonisation in vivo Studie unbedingt Tiermodellen zu überwachen und zu quantifizieren, EHEC Besiedlung haben. Wir zeigen hier ein Maus-EHEC Kolonisation Modell durch die Umwandlung der biolumineszenten mit dem Ausdruck ihrer Plasmids, EHEC zu überwachen und zu quantifizieren EHEC Kolonisation in lebenden Gastgeber. Tiere mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft zeigen intensive Biolumineszenz Signale bei Mäusen durch Erkennung mit einem nicht-invasive in Vivo imaging-System. Nach 1 bis 2 Tage-Infektion Post, konnte Biolumineszenz Signale noch bei infizierten Tieren nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass EHEC besiedeln in Gastgeber für mindestens 2 Tage. Wir zeigen auch, dass diese Biolumineszenz EHEC suchen, Maus Darm, speziell in den Blinddarm und Dickdarm, von Ex-Vivo -Bilder. Dieses Maus-EHEC Kolonisation Modell kann als ein Werkzeug, um das aktuelle Wissen des EHEC Kolonisation Mechanismus voraus dienen.

Einleitung

EHEC O157: H7 ist ein Erreger, der Durchfall1, HS2, HUS3und sogar Akutes Nierenversagen4 durch verunreinigtes Wasser oder Lebensmittel verursacht. EHEC ist eine pathogene Enterobacterium und besiedelt mit dem Magen-Darm-Trakt des Menschen1. Wenn EHEC zunächst halten an Host Darmepithel, Spritzen sie die Kolonisation Faktoren in Wirtszellen durch die Typ III-Sekretion System (T3SS), das Funktionen wie ein molekularer Spritze induzieren eine Befestigung und auszulöschen (A/E) Läsion anschließend zur Durchsetzung Adhäsion (Kolonisation)5. Diese Gene in A/E Läsion Bildung beteiligt sind durch den Ort der Enterozyten Auslöschung (LEE) Pathogenität Insel5kodiert.

Biolumineszenz ist eine Licht-produzierende chemische Reaktion in die Luciferase seine Substrat Luciferin zum sichtbaren Licht6generieren katalysiert. Dieser enzymatischen Prozess erfordert oft das Vorhandensein von Sauerstoff oder Adenosintriphosphat (ATP)6. Biolumineszenz imaging (BLI) erlaubt Forschern, die Visualisierung und die Quantisierung der Wirt-Pathogen Interaktionen in lebenden Tieren7. BLI kann bakterielle Infektionszyklus mit lebenden Tieren charakterisieren, indem Sie die folgenden biolumineszenten Bakterien, wie sie zu migrieren und dringen in verschiedenen Geweben7; Dies zeigt eine dynamische Weiterentwicklung der Infektion. Darüber hinaus bezieht sich die bakterielle Belastung bei Tieren auf die Biolumineszenz Signal8; So ist es ein bequemer Indikator, die pathologischen Zuständen von Versuchstieren in eine einfache und direkte Weise zu schätzen.

Das hier verwendete Plasmid enthaltenen Luciferase Operon, LuxCDABE, die aus dem Bakterium Photorhabdus Luminescens , die eine eigene Luciferase Substrat7,9kodiert. Durch die Umwandlung dieser Luciferase exprimierenden Plasmid in Bakterien, können die Kolonisation und Infektion Prozesse überwacht werden, durch die Beobachtung dieser biolumineszenten Bakterien mit lebenden Tieren. Insgesamt erlauben BLI und Biolumineszenz-Label Bakterien Forschern, überwachen die bakterielle Zahlen und Lage, bakterielle Lebensfähigkeit mit Antibiotika-Therapie Behandlung und bakterielle Genexpression in Infektion/Kolonisation6, 7. zahlreiche Pathogene Bakterien gemeldet wurden, äußern, die LuxCDABE -Operon, deren Infektion Zyklus und/oder Gen-Ausdruck in Infektion zu untersuchen. Diese Bakterien, einschließlich adhärent E. Coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. Coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella Typhimurium16, Listeria Monocytogenes17, Yersinia Enterocolitica18,19, und Vibrio Cholerae20, dokumentiert wurden.

Einige experimentelle Modelle wurden entwickelt, um die Studie von EHEC Kolonisation in Vitro und in Vivo21,22,23zu erleichtern. Allerdings gibt es einen Mangel an geeigneten Tiermodellen, die EHEC Kolonisation in Vivozu studieren, und damit einen daraus resultierenden Mangel an Details. Um die Studie des EHEC Kolonisation Mechanismus in Vivozu erleichtern, ist es wertvoll, Tiermodellen zu beobachten und quantifizieren EHEC Besiedlung mit lebenden Tieren in eine nicht-invasive Methode zu bauen.

Dieses Manuskript beschreibt ein Maus-EHEC-Kolonisation-Modell, das eine Biolumineszenz mit dem Ausdruck ihrer System verwendet, um EHEC Kolonisation im Laufe der Zeit unter lebenden-Hosts zu überwachen. Mäuse sind intragastrically mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft und die biolumineszente Signal bei Mäusen mit einem nicht-invasive in Vivo imaging System13erkannt wird. Mäuse mit Biolumineszenz-Label EHEC zeigten signifikante Biolumineszenz Signale in ihrem Darm, nach 2 Tagen-Infektion, die vorgeschlagen Post, dass diese Bakterien im Darm Host kolonisiert, nach 2 Tagen-Infektion Post infiziert. Ex-Vivo Bilddaten zeigte, dass diese Kolonisierung speziell in den Blinddarm und Dickdarm von Mäusen. Mithilfe dieses Maus-EHEC-Modell kann die biolumineszente EHEC Kolonisierung erkannt werden im Leben Wirt durch ein in-Vivo imaging-System, um die detaillierten Mechanismen der magensaftresistenten Bakterien Kolonisation, zu untersuchen, die in weiteren Verständnis fördern kann EHEC-induzierte physiologische und pathologische Veränderungen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Achtung: EHEC O157: H7 ist eine Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Erreger nach der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) biologische Sicherheit Anweisung (https://www.cdc.gov/). Daher müssen alle experimentellen Verfahren, die EHEC in einem BSL-2 Anlage durchgeführt werden. Kittel und Handschuhe zu tragen, während der Durchführung des Experiments. Arbeiten Sie in einem zertifizierten Biosafety Kabinett (BSC). Desinfizieren Sie die experimentelle Bank vor und nach der Versuchsdurchführung mit 70 % Ethanol. Alle Instrumente oder Geräte, die mit 70 % Ethanol oder Bleichmittel Kontakt (oder potenziell Kontakt) EHEC desinfiziert werden sollte. Kontaminierte (oder verunreinigter) Abfälle sollte sorgfältig abgedichtet und autoklaviert. Tragen Sie eine Maske, Augenschutz, doppelte Handschuhe oder einen Overall, falls erforderlich. Die 6 Wochen alten C57BL/6 weibliche Mäuse waren gekauft und im Labor Animal Center der National Cheng Kung University (NCKU) gepflegt. Die Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der NCKU (Zulassungsnummer 104-039) genehmigt.

1. Bioluciferase-Label EHEC-Bakterien-Generation

  1. Mix 50 ng Desoxyribonukleinsäure (DNA), 1 μL von 10 μM weiterleiten und reverse Primer, 2 μl 2,5 mM Deoxynucleotides (dNTPs), 2 μl 10-fach Puffer, 0,2 μl DNA Polymerase und sterile bidestilliertem Wasser (DdH2O) zu einem Endvolumen von 20 μL verstärken die Anti-Kanamycin Kassette, NptII -gen24. Das DNA-Template ist von pBSL18024, das von der nationalen BioResource Projekt (NBRP) gekauft wird. Die PCR-Bedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt und die Grundierung-Sequenz ist in Tabelle 2zur Verfügung.
  2. Verbinden Sie die PCR-Produkte zu einem kommerziellen klonen Vektor nach Kit-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Das NptII -gen-Fragment aus dem Klonen Vektor Rentenantrag und SmaI Verbrauchsteuern und Klonen in pBBR1MCS4, die von den Rentenantrag und ScaI von pAKlux29 erstelle ich beständige Kanamycin Plasmid verdaut ist, pWF27813.
  4. Verbrauchssteuern LuxCDABE -Operon, aus der Luciferase mit dem Ausdruck Plasmid9, pAKlux2, von SpeI-HF und ScaI und Klon zu SpeI-HF und SmaI verdaut pWF278 Kanamycin generieren resistent und Luciferase Plasmid, pWF27913zum Ausdruck zu bringen.
    Hinweis: Für die Plasmid-Extraktionen und die ausgeschnittenen Fragment Reinigungen, verwenden Sie die kommerzielle Plasmid-Extraktion und das Gel Extraction Kit bzw.. Mischen Sie für die Enzym-Verdauung 100 ng DNA, 1 μl 10-fach Puffer, 1 μL jeder ausgewählten Restriktionsenzym und sterile DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 10 μL und Inkubation bei 37 ° C für 2,5-3 h.
  5. Verwandeln Sie das Plasmid pWF279 in E. Coli O157: H7 EDL933 kompetente Zellen durch Elektroporation mit 2.500 V für 4 ms.
  6. Inkubieren Sie die transformierten Bakterienzellen in 1 mL Luria-Bertani (LB)-Medium bei 37 ° C für 1 h.
  7. Platte die Bakterien auf eine LB-Agar-Platte ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C für 16-18 h.
  8. Überprüfen Sie die biolumineszente Signal der Platte durch ein in-Vivo Bildgebung Maschine am nächsten Tag. Eine einzige Kolonie von der Platte nehmen und Kultur es in 3 mL LB ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C für 16-18 h.
  9. Bereiten Sie bakterielle Lager Medium durch Verdünnung 100 % Glycerin in sterilen DdH2O, die 30 % Glycerin-Lösung zu machen.
  10. Einfrieren Kanamycin-resistente E. Coli O157: H7 EDL933 Bakterien beherbergen die Luciferase-Plasmid als bakterielle Stock in eine Schraubkappe Cryoröhrchen als ein 1:1 Verhältnis von Bakterien-Kultur und 30 % Glycerin-Lösung bei-80 ° C. Die letztendliche Konzentration an Glycerin beträgt 15 %.

(2) Biolumineszenz EHEC Bakterien Vorbereitung für orale Impfung

Hinweis: Die Timeline Flussdiagramm der experimentellen Verfahren für die EHEC-Vorbereitung und Maus orale Magensonde ist in Abbildung 1 experimentelle Vorbereitung unterstützen dargestellt.

  1. Streak E. Coli O157: H7 EDL933 Bakterien beherbergen Luciferase Plasmid auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin von-80 ° C Lager. Wachsen Sie die Bakterien für 16-18 h bei 37 ° C.
  2. Wählen Sie eine einzige Kolonie von der Übernachtung Platte und Kultur in 3 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin für 16-18 h in einem 37 ° C Inkubator bei 220 u/min.
  3. Subkultur der Bakterien (1: 100 Verdünnung) in Kanamycin (50 µg/mL) mit LB Brühe für 2,5-3 h in einem 37 ° C Inkubator bei 200 u/min. (Zum Beispiel fügen Sie 2 mL über Nacht Bakterien auf 200 mL LB-Medium mit Kanamycin (50 µg/mL) ergänzt kultiviert).
  4. Die Bakterien für 2,5-3 h Inkubation und Messung den optischen Dichte-Wert bei 600 nm (OD600) bis der Wert liegt zwischen 0,9 bis 1. Die Bakterienzelle Zahl liegt bei einer Dichte von etwa 108 Kolonie bildende Einheiten (KBE) / mL.
  5. Zentrifugieren Sie die neu gebildeten Bakterien bei 8.000 x g für 30 min, 4 ° C.
  6. Verwerfen Sie den überstand, ohne zu rühren das Pellet von Bakterien und waschen Sie das Pellet mit 100 mL 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung durch sanfte Bewegung.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 einmal.
  8. Nach der Wäsche die Bakterienkultur bei 8.000 x g für 30 min, 4 ° C zentrifugiert und den überstand sanft entsorgen.
  9. Kondensat der Pellets bei 100-fold mit 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung. Zum Beispiel, wenn 200 mL Bakterien zentrifugiert werden, fügen Sie 2 mL normale Kochsalzlösung um die Pellets zu unterbrechen.
  10. Bestätigen Sie die Bakterien KBE (es sollten etwa 109 CFU/100 μL nach Kondensation in normalen Kochsalzlösung sein) durch Ausplattieren konzentrierte Bakterien durch eine 10-divisibel serielle Verdünnung25.

3. Maus orale Magensonde von EHEC

  1. 6 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen mit Streptomycin Wasser (5 g/L) für 24 h zu behandeln.
  2. Nach 24 h wechseln Sie zur regelmäßigen Trinkwasser für ein weiteres 24 h vor der Magensonde. Nach der Behandlung mit Wasser für 24 h, sind die Mäuse bereit für orale Magensonde von EHEC.
  3. Füllen Sie die Spritze mit 100 μL EHEC-Bakterien durch den Kolben zurückziehen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Spritze sind. Entfernen Sie die Luftblasen durch Einrasten der Spritze mit den Fingern.
  4. Heben Sie das Tier vorsichtig und legen Sie es auf der Oberseite Käfig mit Sorgfalt.
  5. Die Maus am Schwanz sorgfältig zu erfassen, und das Tier wird oben auf den Käfig zu greifen und versuchen, sich zu bewegen.
  6. Sanft Zurückhalten der Maus durch das Greifen der losen Haut im Nacken und Rücken des Tieres mit Daumen und Zeigefinger zu verhindern, dass der Kopf der Maus verschieben.
  7. Halten Sie die Maus in vertikaler Position die Magensonde Nadel und sicherstellen, dass der Leiter der Maus immobilisiert und senkrecht ist.
  8. Nadel die Magensonde in die Maus Mund nach dem Dach des Mundes und nach unten in die Speiseröhre und den Magen.
  9. Wenn die eingefügte Nadel die Hälfte oder zwei Drittel Länge in der Maus ist, injizieren Sie 100 μL EHEC-Bakterien, die ungefähr 109 KBE Zellen enthalten.

(4) Visualisierung

  1. Erkennen Sie nach der oralen Magensonde die Biolumineszenz Signale auf 1 bis 2 Tage.
  2. Vor der Prüfung die Biolumineszenz Signale der Tiere, sie zu betäuben, indem man sie in eine Kammer mit 2,5 % Isofluran mit 1,5 L/min Sauerstoff.
  3. 2-5 min. warten Sie, bis alle Mäuse bewusstlos und Anschlag bewegt werden. Tiere sind bereit für in Vivo Nachweis von Biolumineszenz.
  4. Erkennen und Bild Biolumineszenz Signale der Tiere durch ein in-Vivo imaging-System. Betrieb der Software finden Sie in Abschnitt 5 "Datenerfassung". Während den imaging-Prozess sind alle Tiere unter eine kontinuierliche Versorgung mit 2,5 % Isofluran mit 1,5 L/min Sauerstoff.
    1. Klicken Sie auf Datei > live und manuell fokussieren auf die Maus.
    2. Wählen Sie die Belichtung Zeit und Laser Intensität.
    3. Erwerben, klicken Sie auf > erfassen.
  5. Für die ex-Vivo Bildgebung einschläfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation und entfernen Sie den gesamten Darm von infizierten Mäusen. Legen Sie den Darm in eine 9 cm Petrischale und Bild, durch das in-Vivo imaging-System. Die Einstellung ist identisch mit der in-Vivo imaging außer das Sichtfeld ist als A/B. Weitere Informationen finden Sie Abschnitt 5 "Datenerfassung".
    Hinweis: Methode für zervikale Dislokation: zurückhalten die Mäuse auf der Oberseite Käfig durch die Rute mit einer Hand greifen, damit die Tiere den Käfig greifen. Legen Sie einen Filzstift oder Daumen und Zeigefinger der anderen Hand gegen die Rückseite des Halses an der Basis des Schädels. Schnell mit der Hand oder das Objekt während der Ruhigstellung des Kopfes nach vorne schieben und mit der Hand die Rute nach hinten ziehen.
    Prüfen Sie genau, Atemstillstand und kein Herzschlag zu bestätigen.

5. die Datenerfassung

Hinweis: Die Software für die Datenerfassung wird in der Tabelle der Materialienaufgeführt.

  1. Für die Bildaufnahme die Systemsteuerung Erwerb der Software (Abbildung 2).
  2. Wählen Sie "leuchtende" "Fotografieren" und "Overlay".
  3. Eingestellten Belichtungszeit als "Auto". Legen Sie Binning als "Medium."
  4. Ƒ/Stopp 1 für leuchtende und 8 festgelegt für Foto. Ƒ/Stop steuert die Menge des Lichtes von der CCD-Detektor empfangen.
  5. Legen Sie das Sichtfeld, basierend auf dem Feld der Bilder, die von Interesse, zu erwerben. Option "D" kann passen fünf 6 Wochen alten Mäusen und Bild sie alle gleichzeitig. "C" kann drei 6 Wochen alten Mäusen in einem Feld Bild.
  6. Wenn die Mäuse/Proben für die Bildgebung fertig sind, klicken Sie auf "Acquire" für die Bildaufnahme.
  7. Öffnen Sie die Bilddaten, die erworben wurde.
  8. Öffnen Sie die Tool-Palette (Abbildung 3).
  9. Wählen Sie die ROI-Tools. Es wird empfohlen, den Kreis (die am weitesten links ein) reichen die biolumineszenten Bereich auf Bilder (Abbildung 4).
  10. Klicken Sie auf "Maßnahme ROIs" (Stift-Symbol) zur Messung der Biolumineszenz oberflächenintensität (Abbildung 3). Das ROI-Messungen-Panel und die Quantifizierung Werte angezeigt (Abbildung 5).
  11. Verwenden Sie die konfigurieren Messung in der linken Ecke des Fensters ROI Messungen die Werte/Informationen benötigt (Abbildung 6) auswählen, andernfalls klicken Sie auf "Exportieren", um diese Datentabelle exportieren und speichern als CSV-Datei (Abbildung 5).
  12. Verwenden Sie die Werte der Spalte "Gesamtfluss (p/s)" als die Biolumineszenz Intensität Quantifizierung in der CSV-Datei.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Wir mit der Bezeichnung der Biolumineszenz EHEC verabreicht (~ 109 Bakterienzellen), 6 - Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen durch orale Magensonde. Nach der mündlichen Inokulation von EHEC Mäusen innerhalb von 1 h wurden die Tiere auf Biolumineszenz Signal durch die in-Vivo imaging-System wie in Abbildung 7dargestellt untersucht. Die Ergebnisse zeigten ein starkes Signal der biolumineszentes Magensonde Mäuse mit EHEC Biolumineszenz bez...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Es wurde berichtet, dass EHEC mit Luciferase Plasmid transformiert verwendet worden ist, um seine Lokalisierung in Hosts oder Gen Ausdruck in Vivo8,11,12zu untersuchen. Das Mausmodell demonstriert hier berichtet auch das EHEC kolonisiert Timing und die Lokalisierung in murinen Host8erkennen. Dennoch bieten wir das Detail-Protokoll wie EHEC Impfung Mäuse intragastrically verwalten und wie sorgfält...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir erkennen Chi-Chung Chen von der Abteilung der medizinischen Forschung, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) für die Hilfe bei der Maus Infektion und die Unterstützung durch das Labor Animal Center der National Cheng Kung University. Diese Arbeit wird unterstützt durch den Minister für Wissenschaft und Technologie (MOST) gewährt (die meisten 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) CC.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Schüttel-InkubatorYIH DERLM-570RBakterien-Inkubation 
Orbital-Schüttel-InkubatorFIRSTEKS300für Bakterien-Inkubation 
pBSL180Quelle des nptII-Gens
pAKlux2Quelle des luxCDABE Operons
T& Ein KlonierungskitHefe BiotechFYC001-20Pzur Verwendung für die TA-Klonierung 
Nsi INEBR0127Sfür die Klonierung von Plasmiden 
Sca INEBR0122Szur Verwendung für die Klonierung von Plasmiden 
Spe I-HFNEBR0133Szur Verwendung für die Klonierung von Plasmiden 
Sma I NEBR0141Swird für die Klonierung von Plasmiden verwendet 
T4-LigaseNEBM0202Szur Verwendung für die Klonierung von Plasmiden 
ExTaq TaKaRaRR001Azur Verwendung für die PCR-Amplifikation
10X Ex Taq PufferTaKaRaRR001Azur Verwendung für die PCR-Amplifikation
dNTP Mischung TaKaRaRR001AVerwendung für PCR-Amplifikation
PCR-Maschineangewendet Biosystem 2720 Thermocycler   für die PCR-Amplifikation
GlycerinSIGMAG5516-1LVerwendung für Bakterien Strumpflösung
NaClSigma31434-5KG-RChemikalie zur Herstellung von LB-Medium, 10 g/L
TryptonCONDA pronadisaCat 1612.00Chemikalie zur Herstellung von LB-Medium, 10 g/L
Hefeextrakt-PulverAffymetrix23547-1 KGChemikalie zur Herstellung von LB-Medium, 5 g/L
AgarCONDA pronadisaCat 1802.00Chemikalie zur Herstellung von LB Agar
Kanamycin SigmaK4000-5GAntibiotika, zur Selektion von
Streptomycin verwenden SigmaS6501-100GAntibiotika, eliminieren die Mikrobiota in Mäusen
EDL933 kompetente ZelleHausgemachteMethode ist auf ergänzendem Dokument 
ElektroporatorMicroPulserfür
die Elektroporation ElektroporationsküvettenGene Pulser/MicroPulser1652086für die Elektroporation
HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman CoulterAvanti, J-26S XPVerwendung zum Zentrifugieren von Bakterien 
FestwinkelrotorBeckman CoulterJA25.5für die Zentrifugation von Bakterien 
FestwinkelrotorBeckman CoulterJLA10.5zum Zentrifugieren von Bakterien 
ZentrifugenflaschenBeckman CoulterREF357003zum Zentrifugieren von Bakterien verwenden 
ZentrifugenflaschenThermo Fisher scientific3141-0500zur Zentrifugation von Bakterien 
Eppendorf Biophotometer Plus eppendorfAG 22331 hamburgzur Messung des OD600-Wertes von Bakterien
C57BL/6 Mäusen des Labortierzentrums der NCKU
Handschuhezum Schutz des Personals 
Isofluran Panion & BF Biotech Inc.G-8669für die Anästhesie von Mäusen,
1 ml Spritze in pharmazeutischer Qualität Verwendung für die orale Sonde von
Mäusen Wiederverwendbare 22 G Kugel-Fütterungsnadelφ 0,9 mm x L 50 mmVerwendung für die orale Sonde von Mäusen
nbsp; Schere Verwendung für Mäuseexperiment
Xenogen IVIS 200 BildgebungssystemPerkin ElmerIVIS-SpektrumVerwendung für biolumineszierende Bildaufnahme 
Living Image SoftwarePerkin ElmerVersion 4.1zur Quantifizierung der Bilddaten
Laborkittel , chirurgisch&

Referenzen

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Enterohämorrhagische Escherichia coliBiolumineszenz-ImagingIn-vivo-ImagingMaus-KolonisationsmodellOrale SondierungstechnikLumineszenzquantifizierungZökumkolonisationKolonkolonisationEx-vivo-ImagingNicht-invasive Detektion
Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.