Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, enterohämorrhagische E.coli-Besiedlung bei Mäusen mit Hilfe eines nicht-invasiven in vivo Bildgebungssystems nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der enterohämorrhagischen E.coli-Pathogenität, wie z.B. der Besiedlung, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine EHEC-Besiedlung bei lebenden Tieren nachgewiesen werden kann, ohne das Tier zu opfern.

Zu Beginn streicheln Sie einen negativen 80 Grad Celsius großen Bestand an E.coli O157:H7 EDL933-Bakterien, die ein Luciferase-Plasmid beherbergen, auf eine LB-Agarplatte mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin. Züchten Sie die Bakterien 16 bis 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der Nachtplatte und impfen Sie drei Milliliter LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin.

Inkubieren Sie die Kultur dann bei 37 Grad Celsius und 220 U/min für 16 bis 18 Stunden. Bereiten Sie am nächsten Tag eine Verdünnung von zwei Millilitern einer Verdünnung von 1 bis 100 Uhr der Nachtkultur vor und impfen Sie sie in 200 Milliliter LB mit Kanamycin. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für 2,5 bis drei Stunden oder bis die optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,9 und eins liegt.

Als nächstes zentrifugieren Sie die rekultivierten Bakterien 30 Minuten lang bei 8000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und waschen Sie die Bakterien mit 100 Millilitern 0,9% steriler normaler Kochsalzlösung durch sanftes Rühren. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur nach dem Waschen erneut und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.

Verwenden Sie dann 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung, um das Pellet 100-fach zu konzentrieren. Nachdem Sie Mäuse 24 Stunden lang gemäß dem Textprotokoll mit Streptomycin-Wasser behandelt haben, füllen Sie eine Spritze mit 100 Mikrolitern EHEC-Bakterien. Heben Sie das Tier vorsichtig an und legen Sie es vorsichtig auf die Oberseite des Käfigs.

Fassen Sie dann die Maus vorsichtig am Schwanz, so dass sich das Tier an der Oberseite des Käfigs festklammert und versucht, sich zu befreien. Halten Sie die Maus vorsichtig fest, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger die lose Haut von Hals und Rücken des Tieres greifen, um zu verhindern, dass sich der Kopf bewegt. Halten Sie dann die Maus in einer vertikalen Position und stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus in dieser Position bewegungsunfähig ist.

Führen Sie die Sondennadel entlang des Gaumens in das Maul des Tieres ein und bewegen Sie sie nach unten in die Speiseröhre in Richtung Magen. Wenn die eingeführte Nadel halb oder zwei Drittel des Weges in der Maus ist, injizieren Sie die 100 Mikroliter EHEC-Bakterien, die etwa 10 bis neun KBE von Zellen enthalten. Nachdem Sie die biolumineszierenden Zellen gemäß dem Textprotokoll visualisiert haben, öffnen Sie das Acquisition Control Panel der Software.

Wählen Sie "Lumineszierend", "Fotografieren" und "Überlagern" aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch. Stellen Sie dann das Binning auf mittel ein.

Stellen Sie die Blende auf eins für Lumineszenz und acht für das Foto. Blende steuert die Lichtmenge, die vom CCD-Detektor empfangen wird. Sobald die Mäuseproben für die Bildgebung bereit sind, klicken Sie auf "Für Bildaufnahme erfassen".

Öffnen Sie die erfassten Bilddaten und dann das Werkzeugpalettenfenster. Wählen Sie ROI-Werkzeuge wie den Kreis aus, um den biolumineszierenden Bereich auf den Bildern zu definieren. Klicken Sie anschließend mit dem Bleistiftsymbol auf ROI messen, um die Intensität der Oberflächenbiolumineszenz zu messen.

Das Fenster zur ROI-Messung und die Quantifizierungswerte werden angezeigt. Verwenden Sie dann in der linken Ecke des Bereichs ROI-Messungen die Option Messung konfigurieren, um die erforderlichen Werte/Informationen auszuwählen. Andernfalls klicken Sie auf Exportieren, um diese Datentabelle zu exportieren und als CSV-Datei zu speichern.

Verwenden Sie abschließend die Werte der Spalte Gesamtfluss p/s als Quantifizierung der Biolumineszenzintensität in der csv-Datei. Wie in diesem Bild gezeigt, wurde ein starkes Biolumineszenzsignal bei Mäusen beobachtet, die einer oralen Sonde mit einer Biolumineszenz-markierten EHEC-Inokulation ausgesetzt waren. In dieser Abbildung zeigten Mäuse, die mit Biolumineszenz-markiertem Wildtyp-EHEC EDL933 geimpft wurden, auch zwei Tage nach der Infektion intensive Biolumineszenzsignale, was darauf hindeutet, dass EHEC innerhalb von zwei Tagen Wirte besiedelte.

Mäuse, die mit einer mutierten E.coli mit Defekten in Lipopolysacchariden infiziert waren, zeigten jedoch keine Biolumineszenz, was darauf hindeutet, dass diese Mäuse nur eine reduzierte Anzahl oder keine Bakterien besiedelt haben. Um die Biolumineszenz-markierten Bakterien zu lokalisieren, wurde der Darm von getöteten Tieren ex vivo abgebildet. Die Organe von Mäusen, die mit Biolumineszenz-markiertem EHEC infiziert waren, zeigten ein signifikantes Biolumineszenzsignal im Blinddarm und Dickdarm, was auf eine Besiedlung dieser Organe hindeutet.

Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit einer LPS-Mutante infiziert waren, eine verminderte Biolumineszenz im Darmgewebe, was mit dem in vivo-Bild übereinstimmt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Experiment mit dem IV-System zur Überwachung der EHEC-Besiedlung bei Mäusen durchführen.