Name: Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Lernen Sie die nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung zur Detektion von Enterohemorrhagic Escherichia coli in lebenden Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Erforschung von EHEC-Kolonisation ohne Tieropfer.

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Wir erkennen Chi-Chung Chen von der Abteilung der medizinischen Forschung, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) für die Hilfe bei der Maus Infektion und die Unterstützung durch das Labor Animal Center der National Cheng Kung University. Diese Arbeit wird unterstützt durch den Minister für Wissenschaft und Technologie (MOST) gewährt (die meisten 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) CC.

Achtung: EHEC O157: H7 ist eine Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Erreger nach der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) biologische Sicherheit Anweisung (https://www.cdc.gov/). Daher müssen alle experimentellen Verfahren, die EHEC in einem BSL-2 Anlage durchgeführt werden. Kittel und Handschuhe zu tragen, während der Durchführung des Experiments. Arbeiten Sie in einem zertifizierten Biosafety Kabinett (BSC). Desinfizieren Sie die experimentelle Bank vor und nach der Versuchsdurchführung mit 70 % Ethanol. Alle Instrumente oder Geräte, die mit 70 % Ethanol oder Bleichmittel Kontakt (oder potenziell Kontakt) EHEC desinfiziert werden sollte. Kontaminierte (oder verunreinigter) Abfälle sollte sorgfältig abgedichtet und autoklaviert. Tragen Sie eine Maske, Augenschutz, doppelte Handschuhe oder einen Overall, falls erforderlich. Die 6 Wochen alten C57BL/6 weibliche Mäuse waren gekauft und im Labor Animal Center der National Cheng Kung University (NCKU) gepflegt. Die Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der NCKU (Zulassungsnummer 104-039) genehmigt.
1. Bioluciferase-Label EHEC-Bakterien-Generation
<ol><li>Mix 50 ng Desoxyribonukleinsäure (DNA), 1 μL von 10 μM weiterleiten und reverse Primer, 2 μl 2,5 mM Deoxynucleotides (dNTPs), 2 μl 10-fach Puffer, 0,2 μl DNA Polymerase und sterile bidestilliertem Wasser (DdH2O) zu einem Endvolumen von 20 μL verstärken die Anti-Kanamycin Kassette, NptII -gen24. Das DNA-Template ist von pBSL18024, das von der nationalen BioResource Projekt (NBRP) gekauft wird. Die PCR-Bedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt und die Grundierung-Sequenz ist in Tabelle 2zur Verfügung.</li>
	<li>Verbinden Sie die PCR-Produkte zu einem kommerziellen klonen Vektor nach Kit-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Das NptII -gen-Fragment aus dem Klonen Vektor Rentenantrag und SmaI Verbrauchsteuern und Klonen in pBBR1MCS4, die von den Rentenantrag und ScaI von pAKlux29 erstelle ich beständige Kanamycin Plasmid verdaut ist, pWF27813.</li>
	<li>Verbrauchssteuern LuxCDABE -Operon, aus der Luciferase mit dem Ausdruck Plasmid9, pAKlux2, von SpeI-HF und ScaI und Klon zu SpeI-HF und SmaI verdaut pWF278 Kanamycin generieren resistent und Luciferase Plasmid, pWF27913zum Ausdruck zu bringen. Hinweis: Für die Plasmid-Extraktionen und die ausgeschnittenen Fragment Reinigungen, verwenden Sie die kommerzielle Plasmid-Extraktion und das Gel Extraction Kit bzw.. Mischen Sie für die Enzym-Verdauung 100 ng DNA, 1 μl 10-fach Puffer, 1 μL jeder ausgewählten Restriktionsenzym und sterile DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 10 μL und Inkubation bei 37 ° C für 2,5-3 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie das Plasmid pWF279 in E. Coli O157: H7 EDL933 kompetente Zellen durch Elektroporation mit 2.500 V für 4 ms.</li>
	<li>Inkubieren Sie die transformierten Bakterienzellen in 1 mL Luria-Bertani (LB)-Medium bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Platte die Bakterien auf eine LB-Agar-Platte ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C für 16-18 h.</li>
	<li>Überprüfen Sie die biolumineszente Signal der Platte durch ein in-Vivo Bildgebung Maschine am nächsten Tag. Eine einzige Kolonie von der Platte nehmen und Kultur es in 3 mL LB ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C für 16-18 h.</li>
	<li>Bereiten Sie bakterielle Lager Medium durch Verdünnung 100 % Glycerin in sterilen DdH2O, die 30 % Glycerin-Lösung zu machen.</li>
	<li>Einfrieren Kanamycin-resistente E. Coli O157: H7 EDL933 Bakterien beherbergen die Luciferase-Plasmid als bakterielle Stock in eine Schraubkappe Cryoröhrchen als ein 1:1 Verhältnis von Bakterien-Kultur und 30 % Glycerin-Lösung bei-80 ° C. Die letztendliche Konzentration an Glycerin beträgt 15 %.</li>
</ol>(2) Biolumineszenz EHEC Bakterien Vorbereitung für orale Impfung
Hinweis: Die Timeline Flussdiagramm der experimentellen Verfahren für die EHEC-Vorbereitung und Maus orale Magensonde ist in Abbildung 1 experimentelle Vorbereitung unterstützen dargestellt.
<ol><li>Streak E. Coli O157: H7 EDL933 Bakterien beherbergen Luciferase Plasmid auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin von-80 ° C Lager. Wachsen Sie die Bakterien für 16-18 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzige Kolonie von der Übernachtung Platte und Kultur in 3 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin für 16-18 h in einem 37 ° C Inkubator bei 220 u/min.</li>
	<li>Subkultur der Bakterien (1: 100 Verdünnung) in Kanamycin (50 µg/mL) mit LB Brühe für 2,5-3 h in einem 37 ° C Inkubator bei 200 u/min. (Zum Beispiel fügen Sie 2 mL über Nacht Bakterien auf 200 mL LB-Medium mit Kanamycin (50 µg/mL) ergänzt kultiviert).</li>
	<li>Die Bakterien für 2,5-3 h Inkubation und Messung den optischen Dichte-Wert bei 600 nm (OD600) bis der Wert liegt zwischen 0,9 bis 1. Die Bakterienzelle Zahl liegt bei einer Dichte von etwa 108 Kolonie bildende Einheiten (KBE) / mL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die neu gebildeten Bakterien bei 8.000 x g für 30 min, 4 ° C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand, ohne zu rühren das Pellet von Bakterien und waschen Sie das Pellet mit 100 mL 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung durch sanfte Bewegung.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 einmal.</li>
	<li>Nach der Wäsche die Bakterienkultur bei 8.000 x g für 30 min, 4 ° C zentrifugiert und den überstand sanft entsorgen.</li>
	<li>Kondensat der Pellets bei 100-fold mit 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung. Zum Beispiel, wenn 200 mL Bakterien zentrifugiert werden, fügen Sie 2 mL normale Kochsalzlösung um die Pellets zu unterbrechen.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Bakterien KBE (es sollten etwa 109 CFU/100 μL nach Kondensation in normalen Kochsalzlösung sein) durch Ausplattieren konzentrierte Bakterien durch eine 10-divisibel serielle Verdünnung25.</li>
</ol>3. Maus orale Magensonde von EHEC
<ol><li>6 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen mit Streptomycin Wasser (5 g/L) für 24 h zu behandeln.</li>
	<li>Nach 24 h wechseln Sie zur regelmäßigen Trinkwasser für ein weiteres 24 h vor der Magensonde. Nach der Behandlung mit Wasser für 24 h, sind die Mäuse bereit für orale Magensonde von EHEC.</li>
	<li>Füllen Sie die Spritze mit 100 μL EHEC-Bakterien durch den Kolben zurückziehen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Spritze sind. Entfernen Sie die Luftblasen durch Einrasten der Spritze mit den Fingern.</li>
	<li>Heben Sie das Tier vorsichtig und legen Sie es auf der Oberseite Käfig mit Sorgfalt.</li>
	<li>Die Maus am Schwanz sorgfältig zu erfassen, und das Tier wird oben auf den Käfig zu greifen und versuchen, sich zu bewegen.</li>
	<li>Sanft Zurückhalten der Maus durch das Greifen der losen Haut im Nacken und Rücken des Tieres mit Daumen und Zeigefinger zu verhindern, dass der Kopf der Maus verschieben.</li>
	<li>Halten Sie die Maus in vertikaler Position die Magensonde Nadel und sicherstellen, dass der Leiter der Maus immobilisiert und senkrecht ist.</li>
	<li>Nadel die Magensonde in die Maus Mund nach dem Dach des Mundes und nach unten in die Speiseröhre und den Magen.</li>
	<li>Wenn die eingefügte Nadel die Hälfte oder zwei Drittel Länge in der Maus ist, injizieren Sie 100 μL EHEC-Bakterien, die ungefähr 109 KBE Zellen enthalten.</li>
</ol>(4) Visualisierung
<ol><li>Erkennen Sie nach der oralen Magensonde die Biolumineszenz Signale auf 1 bis 2 Tage.</li>
	<li>Vor der Prüfung die Biolumineszenz Signale der Tiere, sie zu betäuben, indem man sie in eine Kammer mit 2,5 % Isofluran mit 1,5 L/min Sauerstoff.</li>
	<li>2-5 min. warten Sie, bis alle Mäuse bewusstlos und Anschlag bewegt werden. Tiere sind bereit für in Vivo Nachweis von Biolumineszenz.</li>
	<li>Erkennen und Bild Biolumineszenz Signale der Tiere durch ein in-Vivo imaging-System. Betrieb der Software finden Sie in Abschnitt 5 "Datenerfassung". Während den imaging-Prozess sind alle Tiere unter eine kontinuierliche Versorgung mit 2,5 % Isofluran mit 1,5 L/min Sauerstoff.<ol>
<li>Klicken Sie auf Datei > live und manuell fokussieren auf die Maus.</li>
		<li>Wählen Sie die Belichtung Zeit und Laser Intensität.</li>
		<li>Erwerben, klicken Sie auf > erfassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die ex-Vivo Bildgebung einschläfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation und entfernen Sie den gesamten Darm von infizierten Mäusen. Legen Sie den Darm in eine 9 cm Petrischale und Bild, durch das in-Vivo imaging-System. Die Einstellung ist identisch mit der in-Vivo imaging außer das Sichtfeld ist als A/B. Weitere Informationen finden Sie Abschnitt 5 "Datenerfassung". Hinweis: Methode für zervikale Dislokation: zurückhalten die Mäuse auf der Oberseite Käfig durch die Rute mit einer Hand greifen, damit die Tiere den Käfig greifen. Legen Sie einen Filzstift oder Daumen und Zeigefinger der anderen Hand gegen die Rückseite des Halses an der Basis des Schädels. Schnell mit der Hand oder das Objekt während der Ruhigstellung des Kopfes nach vorne schieben und mit der Hand die Rute nach hinten ziehen. Prüfen Sie genau, Atemstillstand und kein Herzschlag zu bestätigen.</li>
</ol>5. die Datenerfassung
Hinweis: Die Software für die Datenerfassung wird in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
<ol><li>Für die Bildaufnahme die Systemsteuerung Erwerb der Software (Abbildung 2).</li>
	<li>Wählen Sie "leuchtende" "Fotografieren" und "Overlay".</li>
	<li>Eingestellten Belichtungszeit als "Auto". Legen Sie Binning als "Medium."</li>
	<li>Ƒ/Stopp 1 für leuchtende und 8 festgelegt für Foto. Ƒ/Stop steuert die Menge des Lichtes von der CCD-Detektor empfangen.</li>
	<li>Legen Sie das Sichtfeld, basierend auf dem Feld der Bilder, die von Interesse, zu erwerben. Option "D" kann passen fünf 6 Wochen alten Mäusen und Bild sie alle gleichzeitig. "C" kann drei 6 Wochen alten Mäusen in einem Feld Bild.</li>
	<li>Wenn die Mäuse/Proben für die Bildgebung fertig sind, klicken Sie auf "Acquire" für die Bildaufnahme.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilddaten, die erworben wurde.</li>
	<li>Öffnen Sie die Tool-Palette (Abbildung 3).</li>
	<li>Wählen Sie die ROI-Tools. Es wird empfohlen, den Kreis (die am weitesten links ein) reichen die biolumineszenten Bereich auf Bilder (Abbildung 4).</li>
	<li>Klicken Sie auf "Maßnahme ROIs" (Stift-Symbol) zur Messung der Biolumineszenz oberflächenintensität (Abbildung 3). Das ROI-Messungen-Panel und die Quantifizierung Werte angezeigt (Abbildung 5).</li>
	<li>Verwenden Sie die konfigurieren Messung in der linken Ecke des Fensters ROI Messungen die Werte/Informationen benötigt (Abbildung 6) auswählen, andernfalls klicken Sie auf "Exportieren", um diese Datentabelle exportieren und speichern als CSV-Datei (Abbildung 5).</li>
	<li>Verwenden Sie die Werte der Spalte "Gesamtfluss (p/s)" als die Biolumineszenz Intensität Quantifizierung in der CSV-Datei.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es wurde berichtet, dass EHEC mit Luciferase Plasmid transformiert verwendet worden ist, um seine Lokalisierung in Hosts oder Gen Ausdruck in Vivo8,11,12zu untersuchen. Das Mausmodell demonstriert hier berichtet auch das EHEC kolonisiert Timing und die Lokalisierung in murinen Host8erkennen. Dennoch bieten wir das Detail-Protokoll wie EHEC Impfung Mäuse intragastrically verwalten und wie sorgfält...

EHEC O157: H7 ist ein Erreger, der Durchfall1, HS2, HUS3und sogar Akutes Nierenversagen4 durch verunreinigtes Wasser oder Lebensmittel verursacht. EHEC ist eine pathogene Enterobacterium und besiedelt mit dem Magen-Darm-Trakt des Menschen1. Wenn EHEC zunächst halten an Host Darmepithel, Spritzen sie die Kolonisation Faktoren in Wirtszellen durch die Typ III-Sekretion System (T3SS), das Funktionen wie ein molekularer Spritze induzieren eine Befestigung und auszulöschen (A/E) Läsion anschließend zur Durchsetzung Adhäsion (Kolonisation)5. Diese Gene in A/E Läsion Bildung beteiligt sind durch den Ort der Enterozyten Auslöschung (LEE) Pathogenität Insel5kodiert.
Biolumineszenz ist eine Licht-produzierende chemische Reaktion in die Luciferase seine Substrat Luciferin zum sichtbaren Licht6generieren katalysiert. Dieser enzymatischen Prozess erfordert oft das Vorhandensein von Sauerstoff oder Adenosintriphosphat (ATP)6. Biolumineszenz imaging (BLI) erlaubt Forschern, die Visualisierung und die Quantisierung der Wirt-Pathogen Interaktionen in lebenden Tieren7. BLI kann bakterielle Infektionszyklus mit lebenden Tieren charakterisieren, indem Sie die folgenden biolumineszenten Bakterien, wie sie zu migrieren und dringen in verschiedenen Geweben7; Dies zeigt eine dynamische Weiterentwicklung der Infektion. Darüber hinaus bezieht sich die bakterielle Belastung bei Tieren auf die Biolumineszenz Signal8; So ist es ein bequemer Indikator, die pathologischen Zuständen von Versuchstieren in eine einfache und direkte Weise zu schätzen.
Das hier verwendete Plasmid enthaltenen Luciferase Operon, LuxCDABE, die aus dem Bakterium Photorhabdus Luminescens , die eine eigene Luciferase Substrat7,9kodiert. Durch die Umwandlung dieser Luciferase exprimierenden Plasmid in Bakterien, können die Kolonisation und Infektion Prozesse überwacht werden, durch die Beobachtung dieser biolumineszenten Bakterien mit lebenden Tieren. Insgesamt erlauben BLI und Biolumineszenz-Label Bakterien Forschern, überwachen die bakterielle Zahlen und Lage, bakterielle Lebensfähigkeit mit Antibiotika-Therapie Behandlung und bakterielle Genexpression in Infektion/Kolonisation6, 7. zahlreiche Pathogene Bakterien gemeldet wurden, äußern, die LuxCDABE -Operon, deren Infektion Zyklus und/oder Gen-Ausdruck in Infektion zu untersuchen. Diese Bakterien, einschließlich adhärent E. Coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. Coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella Typhimurium16, Listeria Monocytogenes17, Yersinia Enterocolitica18,19, und Vibrio Cholerae20, dokumentiert wurden.
Einige experimentelle Modelle wurden entwickelt, um die Studie von EHEC Kolonisation in Vitro und in Vivo21,22,23zu erleichtern. Allerdings gibt es einen Mangel an geeigneten Tiermodellen, die EHEC Kolonisation in Vivozu studieren, und damit einen daraus resultierenden Mangel an Details. Um die Studie des EHEC Kolonisation Mechanismus in Vivozu erleichtern, ist es wertvoll, Tiermodellen zu beobachten und quantifizieren EHEC Besiedlung mit lebenden Tieren in eine nicht-invasive Methode zu bauen.
Dieses Manuskript beschreibt ein Maus-EHEC-Kolonisation-Modell, das eine Biolumineszenz mit dem Ausdruck ihrer System verwendet, um EHEC Kolonisation im Laufe der Zeit unter lebenden-Hosts zu überwachen. Mäuse sind intragastrically mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft und die biolumineszente Signal bei Mäusen mit einem nicht-invasive in Vivo imaging System13erkannt wird. Mäuse mit Biolumineszenz-Label EHEC zeigten signifikante Biolumineszenz Signale in ihrem Darm, nach 2 Tagen-Infektion, die vorgeschlagen Post, dass diese Bakterien im Darm Host kolonisiert, nach 2 Tagen-Infektion Post infiziert. Ex-Vivo Bilddaten zeigte, dass diese Kolonisierung speziell in den Blinddarm und Dickdarm von Mäusen. Mithilfe dieses Maus-EHEC-Modell kann die biolumineszente EHEC Kolonisierung erkannt werden im Leben Wirt durch ein in-Vivo imaging-System, um die detaillierten Mechanismen der magensaftresistenten Bakterien Kolonisation, zu untersuchen, die in weiteren Verständnis fördern kann EHEC-induzierte physiologische und pathologische Veränderungen.

<table><tbody><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>Bakterien-Inkubation&nbsp;</td></tr><tr><td>Orbital-Schüttel-Inkubator</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>für Bakterien-Inkubation&nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>Quelle des nptII-Gens</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>Quelle des luxCDABE Operons</td></tr><tr><td>T& Ein Klonierungskit</td><td>Hefe Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>zur Verwendung für die TA-Klonierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Nsi I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>für die Klonierung von Plasmiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>zur Verwendung für die Klonierung von Plasmiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Spe I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>zur Verwendung für die Klonierung von Plasmiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Sma I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>wird für die Klonierung von Plasmiden verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>zur Verwendung für die Klonierung von Plasmiden&nbsp;</td></tr><tr><td>Ex</td><td>Taq TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>zur Verwendung für die PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Puffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>zur Verwendung für die PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>dNTP Mischung&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Verwendung für PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>PCR-Maschine</td><td>angewendet Biosystem&nbsp;</td><td>2720 Thermocycler&nbsp;</td><td>&nbsp; für die PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>Verwendung für Bakterien Strumpflösung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>Chemikalie zur Herstellung von LB-Medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>Chemikalie zur Herstellung von LB-Medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Hefeextrakt-Pulver</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>Chemikalie zur Herstellung von LB-Medium, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>Chemikalie zur Herstellung von LB Agar</td></tr><tr><td>Kanamycin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>Antibiotika, zur Selektion von</td></tr><tr><td>Streptomycin verwenden&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>Antibiotika, eliminieren die Mikrobiota in Mäusen</td></tr><tr><td>EDL933 kompetente Zelle</td><td>Hausgemachte</td><td></td><td>Methode ist auf ergänzendem Dokument&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>für</td></tr><tr><td>die Elektroporation Elektroporationsküvetten</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>für die Elektroporation</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>Verwendung zum Zentrifugieren von Bakterien&nbsp;</td></tr><tr><td>Festwinkelrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>für die Zentrifugation von Bakterien&nbsp;</td></tr><tr><td>Festwinkelrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>zum Zentrifugieren von Bakterien&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>zum Zentrifugieren von Bakterien verwenden&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>zur Zentrifugation von Bakterien&nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometer Plus&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>zur Messung des OD600-Wertes von Bakterien</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäusen&nbsp;</td>Laborkittel <td>des Labortierzentrums der NCKU</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Handschuhe</td><td></td><td></td><td>zum Schutz des Personals&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran&nbsp;</td><td>Panion & BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>für die Anästhesie von Mäusen,</td></tr><tr><td>1 ml Spritze in pharmazeutischer Qualität&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Verwendung für die orale Sonde von</td></tr><tr><td>Mäusen Wiederverwendbare 22 G Kugel-Fütterungsnadel</td><td></td><td>&phi; 0,9 mm x L 50 mm</td><td>Verwendung für die orale Sonde von Mäusen</td></tr> chirurgisch&<tr><td>nbsp; Schere&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Verwendung für Mäuseexperiment</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200 Bildgebungssystem</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS-Spektrum</td><td>Verwendung für biolumineszierende Bildaufnahme&nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 4.1</td><td>zur Quantifizierung der Bilddaten</td></tr></tbody></table>

erkennung von enterohemorrhagic escherichia coli besiedlung in murinen host durch nicht-invasive in vivo biolumineszenz-system

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) O157: H7, das ist ein durch Lebensmittel übertragene Erreger, Causesdiarrhea, hämorrhagische Kolitis (HS) und Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), um den Darm-Trakt des Menschen besiedeln. Um detaillierte Mechanismus der EHEC Kolonisation in vivo Studie unbedingt Tiermodellen zu überwachen und zu quantifizieren, EHEC Besiedlung haben. Wir zeigen hier ein Maus-EHEC Kolonisation Modell durch die Umwandlung der biolumineszenten mit dem Ausdruck ihrer Plasmids, EHEC zu überwachen und zu quantifizieren EHEC Kolonisation in lebenden Gastgeber. Tiere mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft zeigen intensive Biolumineszenz Signale bei Mäusen durch Erkennung mit einem nicht-invasive in Vivo imaging-System. Nach 1 bis 2 Tage-Infektion Post, konnte Biolumineszenz Signale noch bei infizierten Tieren nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass EHEC besiedeln in Gastgeber für mindestens 2 Tage. Wir zeigen auch, dass diese Biolumineszenz EHEC suchen, Maus Darm, speziell in den Blinddarm und Dickdarm, von Ex-Vivo -Bilder. Dieses Maus-EHEC Kolonisation Modell kann als ein Werkzeug, um das aktuelle Wissen des EHEC Kolonisation Mechanismus voraus dienen.

Wir mit der Bezeichnung der Biolumineszenz EHEC verabreicht (~ 109 Bakterienzellen), 6 - Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen durch orale Magensonde. Nach der mündlichen Inokulation von EHEC Mäusen innerhalb von 1 h wurden die Tiere auf Biolumineszenz Signal durch die in-Vivo imaging-System wie in Abbildung 7dargestellt untersucht. Die Ergebnisse zeigten ein starkes Signal der biolumineszentes Magensonde Mäuse mit EHEC Biolumineszenz bez...

Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Besiedlung durch enterohämorrhagische E.coli bei Mäusen mithilfe eines nichtinvasiven In-vivo-Bildgebungssystems nachzuweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Pathogenität enterohämorrhagischer E.coli, wie beispielsweise die Besiedlung, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die EHEC-Besiedlung bei lebenden Tieren ohne deren Tötung detektiert werden kann.Zunächst wird eine negative 80 Grad Celsius-Stammsorte von E. coli O157:H7 EDL933-Bakterien, die ein Luciferase-Plasmid enthält, auf eine LB-Agar-Platte mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin ausgestrichen. Die Bakterien werden 16 bis 18 Stunden bei 37 Grad Celsius kultiviert. Anschließend wird eine einzelne Kolonie von der Overnight-Platte entnommen und zur Inokulation von drei Milliliter LB-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin verwendet.Anschießend die Kultur bei 37 °C und 220 rpm für 16 bis 18 Stunden inkubieren. Am nächsten Tag zwei Milliliter einer 1:100-Verdünnung der Übernachtkultur herstellen und in 200 Milliliter LB mit Kanamycin überimpfen. Die Kultur bei 37 °C und 200 rpm für 2,5 bis drei Stunden oder bis zur Erreichung einer optischen Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,9 und 1,0 inkubieren.Anschließend die Rekultur der Bakterien bei 8000 × g und vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren. Das Überstandmedium abgießen, ohne den Pellet zu stören, und die Bakterien durch vorsichtiges Schütteln mit 100 Milliliter 0,9 % steriler Kochsalzlösung waschen. Nach der Wäsche die Bakterienkultur erneut zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.Verwenden Sie dann 0,9 % sterile Kochsalzlösung, um den Pellet 100-fach zu konzentrieren. Nach der 24-stündigen Behandlung der Mäuse mit Streptomycin-haltigem Wasser gemäß dem Textprotokoll, füllen Sie eine Spritze mit 100 Mikrolitern EHEC-Bakterien. Heben Sie das Tier vorsichtig an und setzen Sie es behutsam auf den Käfigboden.Dann greifen Sie vorsichtig die Maus am Schwanz, sodass das Tier sich mit den Vorderpfoten am Käfiggitter festhält und versucht, wegzukommen. Halten Sie die Maus sanft fest, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger die lose Haut am Nacken und Rücken des Tieres ergreifen, um Kopfbewegungen zu verhindern. Danach halten Sie die Maus in vertikaler Position und stellen sicher, dass der Kopf der Maus in dieser Position immobilisiert bleibt.Führen Sie die Gavage-Kanüle in den Mund des Tieres ein, entlang des Gaumens, und bewegen Sie sie nach unten in die Speiseröhre in Richtung Magen. Wenn die eingeführte Kanüle zur Hälfte oder zu zwei Dritteln in die Maus eingedrungen ist, injizieren Sie die 100 Mikroliter EHEC-Bakterien, die etwa 10 hoch neun KBE pro Zelle enthalten. Nachdem Sie die biolumineszenten Zellen gemäß dem Textprotokoll visualisiert haben, öffnen Sie das Erfassungssteuerungsfeld der Software.Wählen Sie lumineszierend, fotografieren und Überlagerung aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch und danach den Binning auf mittel ein.Stellen Sie die Blende auf eins für Lumineszenz und auf acht für die Fotografie ein. Die Blende steuert die Menge an Licht, die vom CCD-Detektor empfangen wird. Sobald die Mäuseproben zur Bildaufnahme bereit sind, klicken Sie auf „Acquire“, um die Bildaufnahme zu starten.Öffnen Sie die aufgenommenen Bilddaten und anschließend das Werkzeugpalettenfenster. Wählen Sie ROI-Werkzeuge wie den Kreis aus, um den biolumineszenten Bereich auf den Bildern zu definieren. Klicken Sie danach mit dem Stiftsymbol auf „ROI messen“, um die Intensität der Oberflächenbiolumineszenz zu bestimmen.Das Panel zur ROI-Messung und die Quantifizierungswerte werden angezeigt. Anschließend verwenden Sie in der linken Ecke des ROI-Messpanels die Option „Konfigurieren der Messung“, um die benötigten Werte/Informationen auszuwählen. Alternativ klicken Sie auf „Exportieren“, um diese Datentabelle zu exportieren und als CSV-Datei zu speichern.Verwenden Sie abschließend die Werte der Spalte „total flux p/s“ als Quantifizierung der Biolumineszenzintensität in der CSV-Datei. Wie in diesem Bild gezeigt, war ein starker Biolumineszenzsignal bei Mäusen zu beobachten, die einer oropharyngealen Gavage mit biolumineszenzmarkierter EHEC-Inokulation ausgesetzt wurden. In dieser Abbildung zeigten Mäuse, die mit biolumineszenzmarkiertem wildtypischen EHEC EDL933 infiziert wurden, bereits zwei Tage nach der Infektion intensive biolumineszente Signale, was darauf hindeutet, dass sich EHEC innerhalb von zwei Tagen in den Wirtsorganismen angesiedelt hatte.Mäuse, die mit einem mutierten E. coli mit Defekten in Lipopolysacchariden infiziert wurden, zeigen jedoch keine Biolumineszenz, was darauf hindeutet, dass eine verminderte Anzahl oder keine Bakterien diese Mäuse besiedelt haben. Um die Biolumineszenz-markierten Bakterien zu lokalisieren, wurden die Därme geopferter Tiere ex vivo abgebildet. Die Organe von Mäusen, die mit Biolumineszenz-markierten EHEC infiziert waren, zeigten ein signifikantes Biolumineszenzsignal im Blinddarm und im Colon, was auf eine Besiedlung dieser Organe hinweist.Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, die mit einem LPS-Mutanten infiziert wurden, eine verminderte Biolumineszenz im Darmgewebe, was mit dem In-vivo-Bild übereinstimmt. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Experiment mithilfe des IV-Systems durchführt, um die EHEC-Besiedlung in Mäusen zu überwachen.

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Methoden für die Biolumineszenz-Bildgebung von bakteriellen Infektionen in lebenden Tieren beschrieben. Krankheitserreger werden geändert, um auszudrücken Luciferase ermöglicht optische Ganzkörperbildgebungssysteme von Infektionen in lebenden Tieren. Tiermodelle können mit Luciferase exprimierenden Krankheitserreger infiziert werden und die daraus resultierende Verlauf der Erkrankung visualisiert in Echtzeit durch Biolumineszenz-Bildgebung.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung...

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Quelle: Valentine, M. E., et al. Generierung von In-Frame-Gendeletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Test auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Verwendung von Biolumineszenz, um das in vivo-Verhalten von virulenten und abgeschwächten Bakterienstämmen bei Mäusen zu visualisieren und zu vergleichen. Es beschreibt die Herstellung von biolumineszierenden Bakteriensuspensionen und deren intraperitoneale...

Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Quelle: Kuo, C., et al. Nachweis der besiedlung durch enterohämorrhagische Escherichia coli im murinen Wirt durch nicht-invasives In vivo Biolumineszenzsystem. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Herstellung einer Luciferase-exprimierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli-Suspension aus gefrorenem Bestand zur Verwendung als orales Inokulum in Tiermodellen. Dies ermöglicht die biolumineszierende Echtzeit-Verfolgung der Darmbesiedlung während in vivo Infektionsstudien.

Zubereitung des biolumineszierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli Inokulums

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung...

Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Quelle: Seman, B. G. et al. Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)Das Video demonstriert ein neonatales Mausmodell zur Untersuchung systemischer Infektionen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien. Neugeborene Welpen werden mit hoch- oder niedrigdosierten bakteriellen Suspensionen injiziert und zur Nachsorge zu ihrer Mutter zurückgegeben. Die gekapselten Bakterien entgehen der frühen Immundetektion, breiten sich systemisch aus und werden...

Modellierung von Infektionen bei neonatalen Mäusen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Quelle: Luyts, N., et al. Longitudinale Nachbeobachtung von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2021).Dieses Video demonstriert die Induktion und Verfolgung einer Harnwegsinfektion in einem Mausmodell unter Verwendung biolumineszenter E. coli, die in die Blase injiziert wird, wo bakterielle Adhäsion, Invasion und intrazelluläre Replikation stattfinden. Das vom biolumineszente Operon ausgesendetes Licht dient als Echtzeit-Marker für...

Visualisierung der Harnwegsinfektion in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Multi-Bildgebung ist ein wertvoller Ansatz zur Untersuchung bakterieller Besiedlung in kleinen Tiermodellen. Dieses Protokoll beschreibt Infektion von Mäusen mit...

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung  von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Lernen Sie die nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung zur Detektion von Enterohemorrhagic Escherichia coli in lebenden Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Erforschung von EHEC-Kolonisation ohne Tieropfer.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

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