Methodenartikel

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

DOI:

10.3791/56176

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10. Januar 2018

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1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Zusammenfassung

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Glioblastom (GBM) ist die häufigste und tödlichste primäre Gehirntumor bei Erwachsenen verursacht rund 14.000 Todesfälle pro Jahr allein in den USA. Mediane Überlebenszeit nach Diagnosestellung beträgt weniger als 15 Monate mit maximalen chirurgische Resektion, Strahlung und Temozolomid Chemotherapie. Die Herausforderungen bei der Entwicklung effektiver GBM Behandlungen immer deutlicher geworden, und gehören seine unnachgiebige Invasivität, seiner Beständigkeit gegenüber standard-Behandlungen, seine genetische Komplexität und molekulare Anpassungsfähigkeit und Subpopulationen von GBM Zellen mit phänotypischen Ähnlichkeit zu normalen Stammzellen, hierin als Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) bezeichnet. Da die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen für Tumorwachstum und Progression erforderlich sind, stellt Therapie auf der Basis der Differenzierung eine praktikable Behandlungsmethode für diese unheilbaren Tumoren dar.

Das folgende Protokoll beschreibt eine Auflistung von Verfahren, die einen hohen Durchsatz screening-Plattform zur Benennung von kleinen Molekülen, die Förderung der GSC Astroglial Differenzierung zu schaffen. Das Herzstück des Systems ist ein glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Differenzierung Reporter-Konstrukt. Das Protokoll enthält die folgenden allgemeinen Verfahren: (1) Festlegung GSC Differenzierung Reporter; (2) Prüfung/Validierung der Relevanz des Reporters GSC selbst-Erneuerung/klonogenen Kapazität; und (3) Hochleistungs-Durchflusszytometrie Drogen-Screening.

Die Screening-Plattform bietet einen einfache und kostengünstigen Ansatz um kleine Moleküle zu identifizieren, die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Differenzierung fördern. Darüber hinaus hält Nutzung der Bibliotheken der FDA-zugelassene Medikamente das Potenzial für die Identifizierung der Agents, die schneller verwendet werden können. Außerdem sollen Therapien, die Krebs-Stammzell-Differenzierung fördern synergistisch mit aktuellen "Pflege" Standardtherapien zu arbeiten, die gezeigt worden, um gezielt zu beseitigen in erster Linie mehr differenzierte Krebszellen.

Einleitung

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Jüngste Studien haben gezeigt, dass Tumoren eine kleine Population enthalten von Zellen, die Krebs-Stammzellen (CSCs) oder Tumor-initiierenden Zellen bezeichnet sind verantwortlich für die Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemo - und Radio-Therapien 1, 2. das Vorhandensein von Krebs-Stammzellen und ihre differenzierten Stammarten in Tumoren gilt als einen wichtigen Faktor zur Förderung intratumorale Heterogenität und stellt somit eine große Hürde bei der Behandlung von Krebserkrankungen3. Tumor Zelle Hierarchie, bereitgestellt durch die Krebs-Stammzellen-Theorie hat ....

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Protokoll

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Hinweis: Astroglial und neuronale Lentivirus Reporter Systeme wurden als abgepackte, konzentrierte Lentivirale Vorbereitungen gekauft. Grundlegende Kenntnisse der Flow Cytometry Technik ist erforderlich. Auch für eine vollständige Nutzung dieses Protokolls benötigt der Benutzer Zugang zu einem Durchflusszytometer mit hohen Durchsatzleistung (96-Well Platten als Aufnahmequelle akzeptiert).

1. Lentivirale transkriptionelle Reporter System

Hinweis: Alle Fluss durchflusszytometrischen Analyse verwenden Sie elterlichen, nicht ausgestrahlt, Zellen oder Vektor ausgestrahlt (nicht fluoreszierend) für die Festlegung der Bas....

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Ergebnisse

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Drei unabhängige Patienten abgeleitet Neurosphären Linien wurden mit dem Lentivirus Astroglial Reporter Codierung für eine grün-fluoreszierende Protein (GFP) verschmolzen in-Frame mit einer Zeocin Widerstand Kassette ausgestrahlt und angetrieben durch das menschliche GFAP-Promotor-Element ( Abbildung 1). Nächsten einzelnen Klone wurden durch Ausplattieren 0,7 Zellen pro Bohrloch in einer 96-well-Platte (Abbildung 2) isoliert, es .......

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Diskussion

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Während die meisten der bisherigen Studien der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen konzentriert sich hauptsächlich auf die Markierungen, die sie definieren, in dieser Studie haben wir beschlossen das umgekehrte Vorgehen. Wir konzentrieren uns in erster Linie auf die differenzierten Stammarten erzeugt durch die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen (z. B. Zellen, die mit dem Ausdruck Astroglial und neuronale Marker). Hier zeigen wir Ihnen die Nutzung von zellbasierten Hochdurchsatz-Drogen-screening-Syste.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R01CA187780 unterstützt.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ESGRO Complete AccutaseEMD MilliporeSF006
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma AldrichD2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)Sigma AldrichH6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)SBI (System Biosciences)SR10015VA-1
50 ml steriles Einwegreagenz ReservoirsCorning4870
6-Well-PlatteThermo Fisher Scientific130184
96-Well-PlatteFalcon353072
Biolite T25 cm² Thermo FisherScientific130189
Biolite T75 cm² Thermo Fisher Scientific130190
15 ml ZentrifugenröhrchenCelltreat229411
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenFisher Scientific05-408-129
Ovation Mehrkanalpipette, 12 Kanäle, 0,5 - 20 μlVistaLab Technologies1060-0020
Ovation Mehrkanalpipette, 12 Kanäle, 5-250 μlVistaLab Technologies1060-0250
Multi-12-Kanal-Pipettenspitzen 25 μ lVistaLab Technologies4060-1002
Multi-12-Kanal-Pipettenspitzen 250 μm lVistaLab Technologies4060-9025
Guava easyCyte 5HT Tisch-DurchflusszytometerEMD Millipore0500-4005
NIH Clinical Collections 1 und 2 Small Molecule LibrariesEvotec
Name>CompanyKatalognummerComments
Zur Herstellung von neuralen Stammzellmedien (500 mL)Endkonzentration
BSAGoldBio.comA-421-2500,20%
DMEM/F12 10XCorning90-091-PB1X
Heparin-NatriumsalzSigma AldrichH31490,0002
HEPES 1MSigma AldrichH40365,4 mM
Insulin-Transferrin-Selen (ITS-G) (100X)Life Technologies41400-0451X
NaHCO3Sigma AldrichS-576114,5 mM
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) 100XGibco15140-1221X
ProgesteronSigma AldrichP878316 nM
PutrescinSigma AldrichP57804.8 & Mikro; M
Basic FGF (FGF2), HumanGoldBio1140-02-5010 ng/ml
EGF, HumanGoldBio1150-04-10020 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, IndCorning431160Zur Filterung von sterilisierten Medien
%

Referenzen

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  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-406....

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Schlagwörter

Glioblastoma Stem CellsFlow Cytometry ScreeningGFAP Reporter ConstructSmall Molecule ScreeningCellular Differentiation AssayDrug Repurposing PlatformLentivirus TransductionNeurosphere FormationGFP Positive CellsHigh Throughput Screening

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