Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Summary

Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Abstract

Glioblastom (GBM) ist die häufigste und tödlichste primäre Gehirntumor bei Erwachsenen verursacht rund 14.000 Todesfälle pro Jahr allein in den USA. Mediane Überlebenszeit nach Diagnosestellung beträgt weniger als 15 Monate mit maximalen chirurgische Resektion, Strahlung und Temozolomid Chemotherapie. Die Herausforderungen bei der Entwicklung effektiver GBM Behandlungen immer deutlicher geworden, und gehören seine unnachgiebige Invasivität, seiner Beständigkeit gegenüber standard-Behandlungen, seine genetische Komplexität und molekulare Anpassungsfähigkeit und Subpopulationen von GBM Zellen mit phänotypischen Ähnlichkeit zu normalen Stammzellen, hierin als Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) bezeichnet. Da die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen für Tumorwachstum und Progression erforderlich sind, stellt Therapie auf der Basis der Differenzierung eine praktikable Behandlungsmethode für diese unheilbaren Tumoren dar.

Das folgende Protokoll beschreibt eine Auflistung von Verfahren, die einen hohen Durchsatz screening-Plattform zur Benennung von kleinen Molekülen, die Förderung der GSC Astroglial Differenzierung zu schaffen. Das Herzstück des Systems ist ein glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Differenzierung Reporter-Konstrukt. Das Protokoll enthält die folgenden allgemeinen Verfahren: (1) Festlegung GSC Differenzierung Reporter; (2) Prüfung/Validierung der Relevanz des Reporters GSC selbst-Erneuerung/klonogenen Kapazität; und (3) Hochleistungs-Durchflusszytometrie Drogen-Screening.

Die Screening-Plattform bietet einen einfache und kostengünstigen Ansatz um kleine Moleküle zu identifizieren, die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen Differenzierung fördern. Darüber hinaus hält Nutzung der Bibliotheken der FDA-zugelassene Medikamente das Potenzial für die Identifizierung der Agents, die schneller verwendet werden können. Außerdem sollen Therapien, die Krebs-Stammzell-Differenzierung fördern synergistisch mit aktuellen "Pflege" Standardtherapien zu arbeiten, die gezeigt worden, um gezielt zu beseitigen in erster Linie mehr differenzierte Krebszellen.

Introduction

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Tumoren eine kleine Population enthalten von Zellen, die Krebs-Stammzellen (CSCs) oder Tumor-initiierenden Zellen bezeichnet sind verantwortlich für die Tumorprogression, Metastasierung und Resistenz gegen Chemo - und Radio-Therapien ^{1, 2}. das Vorhandensein von Krebs-Stammzellen und ihre differenzierten Stammarten in Tumoren gilt als einen wichtigen Faktor zur Förderung intratumorale Heterogenität und stellt somit eine große Hürde bei der Behandlung von Krebserkrankungen³. Tumor Zelle Hierarchie, bereitgestellt durch die Krebs-Stammzellen-Theorie hat die Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Krebserkrankungen ⁴inspiriert. Ein Ansatz für die Zielgruppenadressierung Krebsstammzellen ist zu identifizieren und hemmen Signalwege, die bekanntermaßen während der embryonalen Entwicklung des betroffenen Organs erforderlich sind. In der Tat haben wir und andere zuvor mehrere Papiere, beschreibt die laufende Anforderung für die neuronale Stammzellen-relevanten Signalwege Sonic Hedgehog und Kerbe in Glioblastom^5,6,7veröffentlicht. Diese Arbeit hat dazu beigetragen, die Verfestigung der Grund für mehrere GBM klinische Studien. Ein zweiter Ansatz für Krebs-Stammzellen-targeting ist ihre Differenzierung zu fördern. Dieser Ansatz hat eine Menge Unterstützung aufgrund der günstigen Ergebnisse von präklinischen und klinischen Studien bei der Behandlung von akuten Promyelocytic Leukämie mit Retinsäuren (ATRA, ein Vitamin-A-Analog) erhalten. Hier fand ATRA, entfernen die Reifung Block zu Krebs Zelle Differenzierung⁸. Piccirillo und Kollegen haben in jüngerer Zeit, elegant gezeigt, dass BMP-4 GSC Differenzierung in Astrozyten mit bedeutenden Anti-GBM-Effekte in Vitro und in Vivo⁹fördert.

Die Gründe für die vorliegende Studie basiert auf einer "Reverse Engineering" Ansatz für die Ausrichtung der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen. Angesichts die große Heterogenität in GBM und schlechte Differenzierung als eines der Markenzeichen von Krebs, fragten wir, ob wir einen günstigeren Phänotyp - Differenzierung in eine Astrozyten-artigen Zustand fördern könnten. Hier haben wir keine Vorkenntnisse in der Signalwege, die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen in einem bestimmten Tumor-Exemplar zu erhalten, sondern eher einen gewünschten Phänotyp (z.B. GFAP Positivität) erreichen wollen.

Dieser Bericht beschreibt die Verfahren zum Herstellen von GSC Differenzierung Reporter-Linien von der Transduktion von GSC-angereicherten Kulturen zum GSC klonale Selektion verwendet. Die Glioblastom Neurosphäre Linien verwendet wurden im Labor von Professor Angelo Vescovi von Patienten mit der Diagnose einer primären Glioblastom am Krankenhaus San Raffaele - Mailand, Italien gegründet. Diese Zeilen wurden in mehreren Publikationen: ^{6,10,11,12,13,14}ausgiebig untersucht. Es wird dringend empfohlen, dass Personen, die bei der Umsetzung dieser Techniken in ihrem Labor interessieren die Relevanz des Reporters zu Krebs Stammzell-Selbsterneuerung Kapazität in den Zellen bestimmen sie studieren möchten (Dies gilt für alle Reporter). Ein detailliertes Protokoll für eines der in-vitro- klonogenen-Assays im Bereich akzeptiert steht zur Verfügung, um diese^15,16zu erreichen. Zu guter Letzt steht ein detailliertes Protokoll beschreibt die Nutzung der Differenzierung Reporter-Linien in einen Drogentest Durchflusszytometrie basiert am Ende zur Verfügung. Der Hinweis haben ähnlich zum Astroglial Differenzierung System hier beschrieben wird, wir erfolgreich etabliert und validiert GSC Reporter Linien einen MAP2:GFP (neuronale Differenzierung) Reporter zu integrieren. Daher beschreiben die Methoden in diesem Papier kann angewendet werden, um zellulare Unterscheidung in verschiedene Linien der Zelle zu studieren.

Einige der Zahlen in diesem Bericht finden Sie in einer kürzlich erschienenen Publikation: "Atracurium Besylate und anderen neuromuskulären Blockern Astroglial Differenzierung fördern und zum Abbau Glioblastom Stammzellen¹⁸."_FITTED

Protocol

Hinweis: Astroglial und neuronale Lentivirus Reporter Systeme wurden als abgepackte, konzentrierte Lentivirale Vorbereitungen gekauft. Grundlegende Kenntnisse der Flow Cytometry Technik ist erforderlich. Auch für eine vollständige Nutzung dieses Protokolls benötigt der Benutzer Zugang zu einem Durchflusszytometer mit hohen Durchsatzleistung (96-Well Platten als Aufnahmequelle akzeptiert).

1. Lentivirale transkriptionelle Reporter System

Hinweis: Alle Fluss durchflusszytometrischen Analyse verwenden Sie elterlichen, nicht ausgestrahlt, Zellen oder Vektor ausgestrahlt (nicht fluoreszierend) für die Festlegung der Baseline Fluoreszenz. Darüber hinaus beachten Sie, dass bei allen Schritten, wo mechanische Zerreibung gefordert ist, sanft. Rauen Verreibung kann töten eine bedeutende Anzahl von den fragilen vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen und Flow Cytometry Ergebnisse beeinflussen.

1. Platte 1 x 10⁶ Zellen in 2 mL vollständig neuronale Stammzellen Wachstumsmedium in einer 6-Multiwell-Platte.
2. Transduzieren Sie Zellen durch Zugabe von Lentivirus Reporter bei einer Vielzahl von Infektionen (Moi) gleich 5.
3. Fügen Sie 2 µL des Polybrene für eine Endkonzentration von 8 µg/mL.
4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂ über Nacht.
5. Ersetzen Sie am nächsten Tag Wachstumsmedium um ungebundene Virus zu entfernen. Die Platte wieder in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ und 24 h inkubieren.
6. 0,5 mL des Gesamtvolumens zu ernten; Spin-down Zellen bei 360 X g für 5 min bei Raumtemperatur in einem 15 mL konische Röhrchen und überstand durch Aspiration entfernen. Die verbleibenden Zellen 0,5 mL frische neurale Stammzellen Wachstumsmedium hinzu und die Platte in den Inkubator für eine weitere Expansion zurück.
7. Fügen Sie 200 µL des Reagenz Dissoziation und 5 min bei 37 ° c inkubieren
8. Sanft auf und ab pipettieren, um Zellen zu distanzieren.
   Hinweis: Harte Verreibung kann erhebliche Tötung der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen, vollständige Dissoziation erfolgt in der Regel nach 20 - 30 Mal.
9. Zur Minimierung von Zellhaftung oder Aggregation fügen Sie 800 µL von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) für ein Endvolumen von 1 mL hinzu.
10. Übertragen Sie 200 µL jeder Zellsuspension auf einen Brunnen einer 96-Multiwell-Platte.
11. Verwenden Sie bei diesem Vorgang ein Benchtop-Durchflusszytometer mit 96-Well-Platte-Funktion ausgestattet, mit einem blauen Laser Erregung und mit der Fähigkeit zur Erkennung von grün fluoreszierendes Protein. Führen Sie durchflusszytometrischen Analyse mit mindestens 10.000 lebensfähige Zellen für jede Akquisition.
12. Bestimmen Sie den Anteil der GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie.

(2) subclone Auswahl, Expansion und Validierung

1. Platte Zellen in 100 µL neurale Stammzellen Medium bei einer Dichte von 0,7 Zellen pro Bohrloch einer 96-Multiwell-Platte.
2. Kultur-Klone für 11 Tage bei 37 ° C und 5 % CO₂. Dieser Schritt ist sehr Zelltyp abhängig und benötigen wahrscheinlich eine Anpassung auf die Zell-Linie verwendet. Eine Kugel Durchmesser ≥ 100 µm ist in der Regel ein guter Indikator für das Vorhandensein der klonogenen vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen in den Neurosphären.
3. Markieren Sie mit einem fluoreszierenden Mikroskop mit einem FITC-Filter ausgestattet, die Brunnen, die eine einzelne Neurosphäre enthalten wo ~ 1-5 % der Zellen GFP-positiv sind.
   Hinweis: Bestimmung den genauen Prozentsatz der GFP-positiven Zellen ist nicht zu kritisch zu diesem Zeitpunkt. Jeder der Subclones wird später durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Dieser Schritt wird durchgeführt, um die Summe zu reduzieren Anzahl der Klone mit Schwerpunkt auf Neurosphären analysiert werden, die durch ihren Ursprung undifferenziert, GFAP-negativ, GSC.
4. Erweitern Sie ausgewählte Reporter Klone bis gibt es eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Analyse von Durchflusszytometrie. Eine Sub-konfluierende gut einer 6-Multiwell-Platte mit ≤ 1.5x10⁵ Zellen/mL sollte eine ausreichende Anzahl von Zellen.
   Hinweis: Ein detailliertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen ist verfügbar ¹⁷.

3. Ermittlung der GFAP:GFP Ausdruck von Durchflusszytometrie

1. Ernten Sie ein Aliquot der Zellen (0,5 mL) von jedem Reporter Klon und nicht ausgestrahlt Kontrollen der genaue Prozentsatz der GFP-positiven Zellen bestimmt. Wenn man bedenkt Reporter Klone, die ~ 1-5 % GFP-positiven Zellen enthalten.
2. Spin-Zellen bei 360 X g für 5 min bei Raumtemperatur und überstand durch Aspiration entfernen.
3. Jedes Pellet 200 µL der Zelle Dissoziation Reagenz hinzugeben und die Rohre in einem Wasserbad, eingestellt auf 37 ° c inkubieren
4. Genannte Zellen vorsichtig, um eine einzelne Zelle Suspension (in der Regel zwischen 20 bis 30 Mal) zu erreichen.
5. Zur Minimierung von Zellhaftung oder Aggregation fügen Sie 800 µL HBSS zu einem Endvolumen von 1 mL hinzu.
6. Übertragen Sie 200 µL pro Bohrloch einer 96-Multiwell-Platte von jedem Zellsuspension.
7. Verwenden Sie bei diesem Vorgang ein Benchtop-Durchflusszytometer mit 96-Well-Platte-Funktion. Führen Sie durchflusszytometrischen Analyse mit mindestens 10.000 lebensfähige Zellen für jede Akquisition.

4. ELDA Selbsterneuerung Assay klonogenen Kapazität bewerten

Hinweis: Für Steuerelemente, sowohl elterlichen, nicht ausgestrahlt, sowie mit dem Ausdruck der GFP Lentivirus ausgestrahlt Zellen, sollte verwendet werden, um festzustellen, das relative klonogenen Potenzial der GSC Differenzierung Reporter Linien auf die ursprünglichen GSC-Kulturen, aus denen sie waren abgeleitet.

1. Differenzierung-Reporter Subclones in einzellige Suspensionen zu distanzieren, wie oben beschrieben.
2. Platte Zellen in 96-Multiwell-Platten in 100 µL kompletten neurale Stammzellen Wachstumsmedien bei Zelldichten zwischen 5 und 500 Zellen pro Bohrloch.
3. 9 bis 11 Tage bei 37 ° C und 5 % CO₂inkubieren Sie Zellen.
4. Ergebnis positive Vertiefungen durch direkte Visualisierung der Neurosphären unter einem Lichtmikroskop. Ein Brunnen sollte betrachtet werden, "positiv", wenn es mindestens einen einzigen großen Neurosphäre enthält.
5. Stecken Sie die Daten: total Brunnen analysiert und die Anzahl der positiven Vertiefungen mit http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html die ELDA Online-Schnittstelle zur Verfügung.

(5) Medikament Bibliothek Verdünnung Vorbereitung

1. Bibliothek-Platten aus dem Speicher bei-80 ° C entfernen, mit Alufolie bedecken (Schutz der lichtempfindlichen Substanzen). Für etwa 30 min bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur auftauen.
2. Verwenden Sie ein 12-Kanal Mehrkanal-Pipette, um die Bibliothek-Verbindungen bis zu 0,2 mM komplette neurale Stammzellen Medium zu verdünnen. Verdünnte DMSO auf 10 % im Wachstumsmedium
   Hinweis: Die Endkonzentration von DMSO sollte 0,1 % bei Zellen hinzugefügt werden. Eine höhere Konzentration von DMSO in der Kultur kann Toxizität führen. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, Sensibilität für DMSO in der Zell-Linie verwendet, vor der Behandlung zu testen.
3. Verwenden Sie DMSO als Fahrzeugkontrolle zur Behandlung von Zellen in der linken und rechten Spalte jeder Platte (Spalten 1 und 12; Brunnen A bis H).
4. Decken Sie die verdünnte Bibliothek-Platten mit Alu-Folie ab und wieder die ursprüngliche Bibliothek Platten-80 ° C Gefrierschrank für die Langzeitspeicherung.

(6) Drogentest

Hinweis: DMSO-behandelten Zellen sollte auf die Grundlinie Fluoreszenz einstellen und anpassen, gating verwendet werden.

1. Platte 5 x 10³ Zellen in einer 96-Multiwell-Platte in 99 µL kompletten neurale Stammzellen Wachstumsmedium.
2. Mit einem 12-Kanal Mehrkanal-Pipette, behandeln Sie Zellen mit verdünnter Bibliothek Verbindungen auf eine Endkonzentration von 2 µM (1 µL 0,2 mM Droge in 99 µL Zellsuspension) oder mit DMSO (Kontrolle). Inkubieren Sie die Platten für 72 h bei 37 ° C und 5 % CO₂.
3. Ein 12-Kanal Mehrkanal-Pipette mit 150 µL Reagenz Zelle Dissoziation in jede Vertiefung hinzufügen und 20 min bei 37 ° c inkubieren
4. Sanft mit einem 12-Kanal Mehrkanal-Pipette verreiben, bis einzelne Zellsuspension (in der Regel zwischen 20 bis 30 Mal) erreicht ist, um Zellen zu distanzieren. Die Zeitspanne, die Neurosphären vollständig distanzieren muss variiert zwischen GSC Linien. Während das empfohlene Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Material) sicher ist und Inkubation für bis zu 45 Minuten keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit in GSC mehrzeilig getestet hatte, überprüfen Sie für jede Zeile der GSC in Screening verwendet werden.
   Hinweis: Das Endvolumen in jedem sollte nun etwa 250 µL (100 µL Zellsuspension + 150 µL Reagenz Zelle Dissoziation).
5. Den Anteil der Zellen mit dem Ausdruck der GFAP:GFP Reporters von Durchflusszytometrie zu bestimmen. Verwenden Sie standard-gating-Strategie. Erstens, streut Handlung nach vorne und seitlich um ein allgemeines Gefühl der Zellengröße und Lebensfähigkeit zu erhalten. Dann legen Sie ein Tor auf die lebensfähige Population der einzelligen. Dies ist die Bevölkerung für die grünen Fluoreszenz (eGFP) bestimmt wird. Jede Verbindung, die Ergebnisse in eine Erhöhung des Anteils der GFP-positiven Zellen um mehr als drei Standardabweichungen Kontrolle (DMSO-behandelt) eine Positive "Hit." gilt als Diese Schwelle sollte je nach Anwendungsfall und die gewünschte Härte eingestellt werden.
   Hinweis: Für den hohen Durchsatz ist Bildschirm mit einem einzigen GSC Reporter Subclone empfohlen. Nach erfolgreichen Identifizierung sollte jeder Treffer gegen zusätzliche Reporter Subclones aus der gleichen Linie GSC überprüft werden. Um das Vertrauen für wahre Hits zu erhöhen ist auch empfehlen Tests Verbindungen gegen Reporter Subclones isoliert aus verschiedenen GSC Neurosphären Linien.

Results

Drei unabhängige Patienten abgeleitet Neurosphären Linien wurden mit dem Lentivirus Astroglial Reporter Codierung für eine grün-fluoreszierende Protein (GFP) verschmolzen in-Frame mit einer Zeocin Widerstand Kassette ausgestrahlt und angetrieben durch das menschliche GFAP-Promotor-Element ( Abbildung 1). Nächsten einzelnen Klone wurden durch Ausplattieren 0,7 Zellen pro Bohrloch in einer 96-well-Platte (Abbildung 2) isoliert, es ...

Discussion

Während die meisten der bisherigen Studien der vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen konzentriert sich hauptsächlich auf die Markierungen, die sie definieren, in dieser Studie haben wir beschlossen das umgekehrte Vorgehen. Wir konzentrieren uns in erster Linie auf die differenzierten Stammarten erzeugt durch die vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen (z. B. Zellen, die mit dem Ausdruck Astroglial und neuronale Marker). Hier zeigen wir Ihnen die Nutzung von zellbasierten Hochdurchsatz-Drogen-screening-Syste...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Sigma Aldrich	H6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml steriles Einwegreagenz Reservoirs	Corning	4870
6-Well-Platte	Thermo Fisher Scientific	130184
96-Well-Platte	Falcon	353072
Biolite T25 cm² Thermo Fisher	Scientific	130189
Biolite T75 cm²	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml Zentrifugenröhrchen	Celltreat	229411
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation Mehrkanalpipette, 12 Kanäle, 0,5 - 20 μl	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation Mehrkanalpipette, 12 Kanäle, 5-250 μl	VistaLab Technologies	1060-0250
Multi-12-Kanal-Pipettenspitzen 25 μ l	VistaLab Technologies	4060-1002
Multi-12-Kanal-Pipettenspitzen 250 μm l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Tisch-Durchflusszytometer	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 und 2 Small Molecule Libraries	Evotec
Name	>Company	Katalognummer	Comments
Zur Herstellung von neuralen Stammzellmedien (500 mL)			Endkonzentration
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Heparin-Natriumsalz	Sigma Aldrich	H3149	0,0002
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5,4 mM
Insulin-Transferrin-Selen (ITS-G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14,5 mM
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progesteron	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescin	Sigma Aldrich	P5780	4.8 & Mikro; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Zur Filterung von sterilisierten Medien