Method Article

Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

DOI:

10.3791/56187

⸱

October 27th, 2017

 ,  , 
1Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

Abstract

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Die Analyse der Veränderungen der globalen Genexpression ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung von neuartige Wege beobachteten Phänotypen zugrunde liegen. Der Zebrabärbling ist ein hervorragendes Modell für schnelle Beurteilung der ganze Transkriptom vom ganzen Tier oder einzelne Zellpopulationen wegen der Leichtigkeit der Isolierung der RNA aus große Zahl von Tieren. Hier ist ein Protokoll für globale gen Expressionsanalyse in den Zebrafish Embryos mit RNA Sequenzierung (RNASeq) vorgestellt. Wir beschreiben Vorbereitung der RNA aus ganzen Embryonen oder Zell-Populationen mit Zelle Sortierung bei transgenen Tieren erzielt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Analyse von RNASeq Daten, angereicherte Wege und Gene Ontology (gehen Sie) Begriffe im globalen gen Ausdruck Datensätze zu identifizieren. Zu guter Letzt bieten wir ein Protokoll für die Validierung von Veränderungen der Genexpression mit quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR). Diese Protokolle können für die vergleichende Analyse der Steuerung und experimentellen Gruppen von Zebrafisch verwendet werden, um Veränderungen der neuartigen Genexpression zu identifizieren und molekulare Einblick in Phänotypen von Interesse.

Introduction

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Vergleichende Analyse der globalen Genexpression ist ein wertvolles Werkzeug, neuartige Gene zur beobachteten Phänotypen zu identifizieren. Solche Analysen in der Regel verlassen sich auf quantitative Bewertung der Abschrift Fülle im Vergleich zwischen experimentellen und Kontrollproben. Gezielte Ansätze, wie z. B. qRT-PCR sind relativ schnelle und genaue Untersuchung der Veränderungen der einzelnen Genexpression. RNA-Sequenzierung (RNASeq) bietet einen breiten, Hypothese-freie Ansatz um wesentliche Änderungen in der Genexpression zwischen Proben, so dass es nun den Standard für solche Untersuchungen über experimentelle Systeme zu identifizieren.

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Protocol

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alle tierischen Protokolle, die unten beschrieben sind in Übereinstimmung mit und genehmigt von der University of Maryland institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC).

1. Embryo Vorbereitung

  1. Generierung von Embryonen durch natürliche Paarung
    1. Kultur Embryonen bis 3 Monate alt, reproduktive Reife 5 , 8 .
    2. Erwachsenen männlichen und weiblichen Fische aus die gewünschte Belastung in geteilten Paarung Panzern am Vorabend Embryo Sammlung zu trennen, und jeder Tank 2 Rüden und 3 Hündinnen hinzu.
      Hinweis: Verwendung der t....

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Results

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Sortierung der differenziell ausgedrückt Gene:

Wir gezielte Ermittlung differentiell exprimierten Gene im Larvenstadium von Zebrafisch-Modellen von Alström-Syndrom und Bardet-Bardet-Syndrom (BBS), entweder alms1 oder bbs1 Abschriften durch die Injektion von zuvor validiert Spleiß-blocking MOs in Wildtyp Zebrafish Embryos16,17. 5 Tage nach Befruchtung (Dpf).......

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Discussion

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In diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Strategie für Transkriptom-Level-Analyse der ganze Tiere oder bestimmte sortierte Zellpopulationen. Der Zebrabärbling bietet eine vorteilhafte Modell für diese Art der Studie wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit beim generieren großer Mengen an Material, die einfache Implementierung von genetischen oder experimentelle Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit eines großen ab Spektrum an transgenen Reporter Linien zur Isolation von Z.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) und T32DK098107 (T.L.H. und J.E.N).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Commercial Reagenzien
TriZolThermo Scientific15596026Lysereagenz
TrypLEGibco12604013Dissoziationspuffer 1
FACSMaxGenlantisT200100Dissoziationspuffer 2
DEPC-behandeltes WasserSigma95284
FirstStrand cDNA-UmwandlungThermo ScientificK1621cDNA-Umwandlungskit
2X SYBR Green Master MixRoche4707516001qRT-PCR Master Mix
FACSPuffer Fisher Scientific50-105-9042
ChloroformSigma Aldrich288306
NatriumacetatSigma AldrichS2889
NameFirmaKatalognummerKommentare
Zebrafish Stämme
TuebingenZIRCZL57
ins2a:mCherryZIRCZL1483
Name< strong>CompanyKatalognummerKommentare
Ausrüstung
40 Mikron ZellsiebSigmaCLS431750
FACS TubeBD Falcon352063
HämozytometerSigmaZ359629
PräpariermikroskopZeiss
Inverses MikroskopZeiss
NanodropThermo Scientific
Illumina HiSeq Illumina
LightCycler 480Roche
Gegentanks 1,0 l Kreuzungstank-SetAquaneeringZHCT100 FACS-Tube
5 mL Polypropylen-SchlauchBD Falcon352063
NameCompanyKatalognummer<strong>Kommentare
>Software
ExcelMicrosoft
Konsensus Pfad DBhttp://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Anreicherungsanalysehttp://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

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Tags

Zebrafish RNASeqGene Expression AnalysisRNA IsolationCell SortingqRT PCR ValidationPathway EnrichmentGO Term AnalysisDifferential ExpressionTranscriptome ProfilingEmbryo Staging

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