Probenvorbereitung und Analyse der RNASeq-basierte Genexpressionsdaten von Zebrafisch

Summary

Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die ganze Transkriptom-Analyse von Zebrafisch-Embryonen, Larven, oder Zellen sortiert. Wir gehören Isolierung von RNA, Pathway-Analyse von RNASeq Daten und qRT-PCR-basierte Validierung von Veränderungen der Genexpression.

Abstract

Die Analyse der Veränderungen der globalen Genexpression ist ein wertvolles Instrument zur Identifizierung von neuartige Wege beobachteten Phänotypen zugrunde liegen. Der Zebrabärbling ist ein hervorragendes Modell für schnelle Beurteilung der ganze Transkriptom vom ganzen Tier oder einzelne Zellpopulationen wegen der Leichtigkeit der Isolierung der RNA aus große Zahl von Tieren. Hier ist ein Protokoll für globale gen Expressionsanalyse in den Zebrafish Embryos mit RNA Sequenzierung (RNASeq) vorgestellt. Wir beschreiben Vorbereitung der RNA aus ganzen Embryonen oder Zell-Populationen mit Zelle Sortierung bei transgenen Tieren erzielt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Analyse von RNASeq Daten, angereicherte Wege und Gene Ontology (gehen Sie) Begriffe im globalen gen Ausdruck Datensätze zu identifizieren. Zu guter Letzt bieten wir ein Protokoll für die Validierung von Veränderungen der Genexpression mit quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR). Diese Protokolle können für die vergleichende Analyse der Steuerung und experimentellen Gruppen von Zebrafisch verwendet werden, um Veränderungen der neuartigen Genexpression zu identifizieren und molekulare Einblick in Phänotypen von Interesse.

Introduction

Vergleichende Analyse der globalen Genexpression ist ein wertvolles Werkzeug, neuartige Gene zur beobachteten Phänotypen zu identifizieren. Solche Analysen in der Regel verlassen sich auf quantitative Bewertung der Abschrift Fülle im Vergleich zwischen experimentellen und Kontrollproben. Gezielte Ansätze, wie z. B. qRT-PCR sind relativ schnelle und genaue Untersuchung der Veränderungen der einzelnen Genexpression. RNA-Sequenzierung (RNASeq) bietet einen breiten, Hypothese-freie Ansatz um wesentliche Änderungen in der Genexpression zwischen Proben, so dass es nun den Standard für solche Untersuchungen über experimentelle Systeme zu identifizieren.

Zebrafisch entstanden als prominente Modell in vielen Bereichen der Krankheit. Ursprünglich entwickelt für ihre Nützlichkeit in Entwicklungsbiologie Studien aufgrund ihrer hohen Fruchtbarkeit und relativ geringen Kosten für Wartung, experimentellen Einsatz von Zebrafisch entwickelt hat, um umfassen eine Vielzahl von Phänotypen aus embryonalen bis adulten Stadien als auch als ein Vielzahl von molekularen Tests^1,2,3. In der Tat, diese Vorteile machen die molekularen mechanistische Studien schnelle und kostengünstige wegen der Leichtigkeit des Erwerbs von großen Mengen an Material kombiniert mit der Leichtigkeit des genetischen und umweltbedingten Manipulation in allen Phasen des Lebens. Darüber hinaus die transparente Art der Zebrafisch-Embryonen und Larven machen es ideal für die Erzeugung von Zell- und gewebespezifische transgenen Reporter Linien in Vivo Visualisierung von diskreten Zelle Bevölkerungen⁴ermöglicht. Ausbeutung von solchen Linien ermöglicht globale gen Expressionsanalyse in bestimmten isolierten Zelle Arten basierend auf Reporter-gen-Expression.

Hier präsentieren wir Ihnen ein umfassendes Protokoll für globale Genanalyse Ausdruck mit RNASeq nach der Kultur der Zebrafisch-Embryonen. Genetischen experimentelle Manipulationen, einschließlich Morpholino (MO)-aufgrund vorübergehender gen-Knockdown oder CRISPR-vermittelten Genom-Bearbeitung, wurden präsentiert an anderer Stelle^5,6,7. Wir daher konzentrieren sich auf ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus ganzen Embryonen oder transgene Reporter exprimierenden Zellen, gefolgt von einfachen numerischen Analyse der RNASeq Ergebnisse mit Weg-Tools und gen Ontology (gehen Sie) Begriffe sortiert. Zu guter Letzt haben wir eine Strategie für die Validierung von Veränderungen der Genexpression durch quantitative Reverse Transkriptase PCR (qRT-PCR) aufgenommen. Diese Protokolle sind für Zebrafisch-Embryonen, die eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen, auch im Vergleich der genetische Mutanten oder Umweltbedingungen ausgesetzt.

Protocol

alle tierischen Protokolle, die unten beschrieben sind in Übereinstimmung mit und genehmigt von der University of Maryland institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC).

1. Embryo Vorbereitung

1. Generierung von Embryonen durch natürliche Paarung
   1. Kultur Embryonen bis 3 Monate alt, reproduktive Reife ^{5 , 8} .
   2. Erwachsenen männlichen und weiblichen Fische aus die gewünschte Belastung in geteilten Paarung Panzern am Vorabend Embryo Sammlung zu trennen, und jeder Tank 2 Rüden und 3 Hündinnen hinzu.
      Hinweis: Verwendung der transgenen Insulin2a:mCherry fluoreszierenden Reporter Belastung erlaubt die Analyse der β-Zellen der Bauchspeicheldrüse.
   3. Transfer Fisch, dass die Paarung tank mit frischem Wasser und die Trennwand zu entfernen, sofort nachdem die Lichter am nächsten Morgen kommen.
   4. Ermöglichen die Fische natürlich Paaren bis Embryonen im Bodentank eingehalten werden. Sammeln Sie Embryonen im 30 min Takt, bis die gewünschte Menge gesammelt werden. Jeweils Markt gesammelt Zeitpunkt in separaten Petrischalen im Embryo Media bei 28,5 ° c
   5. Mikroinjektion der Erbsubstanz oder Platzierung in experimentellen Nährmedien ⁶, durchführen, falls gewünscht, und Kultur der Embryonen in frischen Hank ' s Embryo mittlere ⁸ in 10 cm Petrischalen bei 28,5 ° C.
      Hinweis: gen Expressionsanalyse in Morpholino (MO) injiziert oder mutierte Tiere, beachten Sie, dass jede Manipulation auf die Genexpression Nebenkosten auswirken kann. Mutanten ausstellen können genetische Entschädigung auf der Ebene der Transkription, die nicht durch MO-basierte Gene targeting- ⁹ beobachtet wird.
2. Embryonen
   1. Kultur der Embryonen in Gruppen von 50 – 75 Embryonen pro 10 cm Petrischale, konsequente Entwicklung Timing aller Embryonen zu fördern.
   2. Überwachen die Entwicklung Morphologie sezierenden Mikroskop in Blastomere, Epiboly und Somiten Stadien Entwicklung Fortschreiten ¹⁰ sicherzustellen.
      Hinweis: Entfernen Sie alle sterben oder missgebildeten Embryonen um Entwicklungsverzögerung in der Schale zu verhindern.
   3. Trennen die Embryonen basierend auf dem Entwicklungsalter. Messen der Embryo Alter Somiten Anzahl nach Segmentierung (Post-Gastrulation 10,33 h Post Düngung (hpf)) mit bis zu ca. 24 hpf. Stufe der Embryonen und Larven mit Körperlänge nach 24 hpf.
      Hinweis: Die Somiten sind die Chevron-förmigen mesodermalen Gewebes auf der dorsalen Teil des Embryos vorhanden.
   4. Legen Sie die sortierten Embryonen in einem Brutkasten 28,5 ° C und erlauben die Entwicklung kommen, um das gewünschte Alter.

2. Einzelne Zelle Dissoziation: Gesamte Embryo und sortiert Zellpopulationen

1. gesamte Embryo Dissoziation
   1. einschläfern der Zebrafisch-Embryonen zum gewünschten Zeitpunkt durch die Platzierung der Petrischale für 5-15 min auf Eis, bis keine Bewegung festgestellt wird .
   2. Transfer einen Pool von 20 Embryonen zu einem beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Entfernen Sie alle überschüssige Embryonen Medien vom Microcentrifuge Schlauch.
   3. Fügen Sie 200 µL Lyse-Reagenz (siehe Tabelle der Materialien), die Röhrchen mit Embryonen. Die Embryonen in Lyse-Reagenz mechanisch mit einem Stößel zu homogenisieren. Fügen Sie 800 µL-Lyse-Reagenz, das Gesamtvolumen zu 1 mL zu bringen. Shop bei-80 ° C bis RNA Extraktion.
2. Flow sortiert Zelle isoliert ¹¹
   1. Transfer der Embryonen aus der Petrischale zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und entfernen so viel Embryo Mittel wie möglich.
      Hinweis: Je nach Alter Embryo mechanische Dissoziation bei diesem Schritt möglicherweise erforderlich. Mit Embryonen > 48 hpf, empfehlen wir die Verwendung von einem Stößel, Embryo Integrität, bevor Sie fortfahren zu stören.
   2. Brüten die Embryonen mit 1 mL der Dissoziation Puffer 1 (siehe Tabelle der Materialien) in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. 15-30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Genannte Lösung durch Pipettieren sanft nach oben und unten mit einer P1000 Spitze, um alle 3 bis 4 Minuten während der Inkubationsschritt zu mischen. TUN nicht VORTEX.
   3. Sammeln die Embryonen durch Zentrifugation für 3 min bei 300 X g und den Überstand zu entfernen. Wieder aussetzen der Embryonen in 1 mL Dissoziation Puffer 2 (siehe Tabelle der Materialien). 15-30 min bei Raumtemperatur mit regelmäßigen Pipettieren Verreibung inkubieren.
   4. Bewerten die Verdauung durch eine Verdünnung von 1-2 µL der Aussetzung in Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Puffer unter Mikroskop.
      Hinweis: Komplette Verdauung stattgefunden hat, wenn die untersuchten aliquoten Einzelzellen mit minimalen Zellcluster und Stücke von embryonalem Gewebe zeigt.
   5. Sammeln die Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min. entfernen überstand. Neu suspendieren die Zellen in 1 mL FACS-Puffer und Schwerkraft Filter durch ein 40 µm Zelle Sieb unverdaute Gewebe aus der Probe entfernen.
   6. Zählen die Zellen mit einem Hemocytometer und mit FACS Puffer auf ca. 1 x 10 ⁶ Zellen/mL in ein FACS-Rohr verdünnen.
      Hinweis: Für Zelltypen mit einer relativ kleinen Anzahl pro Embryo (weniger als 5 % der Gesamtmenge), wie z. B. β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, verwenden Sie ein Minimum von 1.000 Bühne abgestimmt Embryonen.
   7. Bieten die FACS Sortieranlage mit FACS-Röhrchen mit 1 mL der Suspension Zellproben sowie FACS-Röhrchen mit nur Lyse-Reagenz oder FACS-Puffer. Tor der FACS Fluss-Sorter nur einzelne Zellen zu sammeln, die die fluoreszierende Reporter zum Ausdruck bringen.
   8. Die FACS-Fluss-Sortierung durchführen, bis die gewünschte Zelle Zahlen gesammelt wurden.
      Hinweis: Um RNASeq durchzuführen, ist eine Gesamt-RNS erforderliche Minimum. Wir haben festgestellt, dass 3.000-5.000 Zellen ausreichen, um qualitativ hochwertige, hoher Konzentration RNA isoliert sind.
   9. Speichern Sie die erfassten Zellen auf Eis und gehen Sie sofort zu RNA Vorbereitung.

3. RNA-Vorbereitung

1. RNA extrahieren
   1. die gesammelten Probe (aus Schritt 2) mit Lyse-Reagenz für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Add 0,2 mL Chloroform für je 1,0 mL Lyse-Reagenz verwendet und die Rohre per hand für 15 S. Inkubation für 2-3 min bei Raumtemperatur zu invertieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 ° c
   3. Getrennte, wässrige Phase zu einem frischen Schlauch übertragen und 0,5 mL Isopropanol für je 1,0 mL Lyse-Reagenz verwendet. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° c
   4. Waschen mit 75 % Ethanol und Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.500 x g für 5 min bei 4 ° c den Überstand vollständig zu entfernen und an der Luft bei Raumtemperatur trocknen lassen. Wieder aussetzen die RNA in 15-30 µL Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser.
2. Purify qualitativ hochwertige RNA
   1. kombinieren die RNA-Aufhängung mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,5) und 1 Volumen von Isopropanol. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren und Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.500 x g für 10 Minuten bei 4 ° c
   2. Das Pellet mit eiskalten 70 % Ethanol in DEPC-behandeltem Wasser waschen und Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Repeat einmal der Waschschritt.
   3. Entfernen den Überstand und bei Raumtemperatur trocknen lassen. Neu in DEPC-behandeltem Wasser auszusetzen.
   4. Assay die extrahierte RNA für die Konzentration (ng/µL) und Reinheit (260/230 Verhältnis) mit einem Aufnahme-Spektrometer. Sicherzustellen, dass die 260/230 Wert ~ 2.0 bevor mit RNASeq. Bis uns bei-80 ° C lagerne (bis zu 6 Monate).
   5. Senden die RNA-Proben an einen Kreditor oder Kern für RNASeq und Genexpression Analyse anhand der Quantifizierung der Sequenzierung liest ändern. Vom Anbieter zurückgegebenen Ergebnisse sind in der Regel als eine Liste von Genen ausstellenden Falte Veränderung in Abschrift liest zwischen Proben zur Verfügung gestellt.
      Hinweis: Eine Spalte kann verwendet werden, wenn die oben beschriebene Methode schlechter Qualität RNA ergibt. Menge, Konzentration und RNA Integrität Anzahl (RIN) für RNA-Proben sollten mit dem Verkäufer oder Kern bestätigt werden. Der Lieferant oder der Kern wird in der Regel auch RIN bewerten.

4. Weg und gehen Begriff Analyse

Hinweis: siehe Abbildung 1 für repräsentative Ausgabe der gen Ausdruck Analyse nach RNASeq seitens der Kern oder Kreditor.

1. 1. 1. Offenen Vergleich einer einzigen Versuchsbedingung versus Kontrolle Sortierung differenziell ausgedrückt Gene Daten (Ergebnisse) in einer Tabellenkalkulation-Management-Software (siehe Tabelle der Materialien ).
      2. Wählen Sie den Dropdown Pfeil neben dem ' Art ' und wählen Sie " Custom Art " in der Tabelle mit den differentiell exprimierten Genen in der experimentellen versus Kontrollbedingung.
      3. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen unter ' Spalte ' in das Fenster, das erscheint oben und wählen Sie sortieren nach die ' LFC ' Spalte. Stellen Sie sicher ' Werte ' im ausgewählt ist die ' Art auf ' Spalte. Wählen Sie zum Sortieren von ' größten zum kleinsten ' in der ' Ordnung ' Spalte und klicken Sie auf " OK ".
         Hinweis: Dies wird die differentiell exprimierten Gene so sortieren, dass diejenigen mit erhöhten Ausdruck (positive LFC) am oberen Rand der Liste angezeigt werden, während diejenigen mit verringerter Ausdruck (negative LFC) am unteren Rand der Liste angezeigt werden.
   2. Mehreren experimentellen Bedingungen für ein einzelnes Steuerelement wie folgt zu vergleichen.
      1. Wählen Sie die erste Zelle in einer leeren Spalte auf dem experimentellen 1 versus Kontrolle Tabellenkalkulation differentiell bestimmen ausgedrückt Gene in zwei Versuchsbedingungen gefunden. Geben Sie die folgende Formel in die Zelle:
         
         Hinweis: diese Gleichung ist eine Kombination aus der IF ISERROR, und Spiel-Funktionen. (i) die Funktion MATCH, MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), wird der Wert in A1 suchen (die ENSEMBL-ID) in die A-Säule (A:A) der Tabelle namens Experimental2_vs_Control (Experimental2_vs_Control!). Die " 0 " gibt an, dass um nach einer genauen Übereinstimmung zu suchen, und wenn eine exakte Übereinstimmung gefunden wird, kehrt die Funktion einen Wert von " 1 ", wenn keine Übereinstimmung gefunden wird, wird die Funktion einen Fehler zurück " N/A ". (Ii) das Ergebnis des MATCH-Funktion ist dann Eingang in die ISERROR Funktion, ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), wo, wenn der Eingang " 1 " zeigt eine Übereinstimmung gefunden wurde, kehrt " falsche ", und wenn die Eingabe ist " N/A " zeigt eine Übereinstimmung nicht gefunden wurde, kehrt " wahr ". (Iii) die " wahre " oder " falsche " ergibt dann Eingang in die IF-Funktion, wenn (ISERROR (MATCH (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), " ", " doppelte "), wo, wenn die Eingabe ist " wahr " zeigt eine Übereinstimmung nicht gefunden wurde, wird den Wert zwischen den ersten Satz von Anführungszeichen zurückgegeben (" ") die leer ist, und daher die Zelle leer. Wenn der Eingang " falsche " zeigt eine Übereinstimmung gefunden wurde, wird den Wert zwischen der zweite Satz von Anführungszeichen zurückgegeben (" doppelte "), und die Zelle wird sagen " duplizieren ".
      2. Presse " Enter " oder " zurück " die Gleichung ausgeführt. Wählen Sie die Zelle mit der Formel und klicken Sie auf das Feld in der rechten unteren Ecke der Zelle. Halten Sie die Maustaste geklickt und ziehen Sie den ausgewählten Bereich ganz nach unten in der Spalte bis zum letzten ' Feature-ID ', um die Gleichung in jede Zelle in der Spalte kopieren.
      3. Select " Custom Art " wieder, fügen Sie eine zweite Ebene der sortieren durch Klicken auf die " + "-Symbol in der linken unteren Ecke. In der ersten Ebene " sortieren, ", unter Spalte auswählen " duplizieren ", unter Art auf Select ' Werte ', und unter Bestellung auswählen ' Z bis A '. In der zweiten Ebene " dann nach ", unter Spalte auswählen ' LFC ', unter Art auf Select ' Werte ', und unter Bestellung auswählen ' größten zum kleinsten ' und wählen Sie " "OK" ".
         Hinweis: Dies wird die Liste von Genen in 4 Gruppen je nach Ausrichtung des Ausdrucks ändern sortieren. Es ist wichtig, die Gene gefunden in beiden experimentellen Bedingungen zu gewährleisten, dass die Änderung im Ausdruck in die gleiche Richtung in beiden oder in entgegengesetzte Richtungen überprüfen.
      4. Klammern aus der gen-Symbole-Spalte entfernen, bevor Sie fortfahren oder die Ergebnisse nicht in der Datenbank gefunden werden. Wählen Sie die gesamte Spalte, gen-Symbole enthält. Wählen Sie " bearbeiten " dann " ersetzen " in der Dropdown-Liste ' Datei ' Menü. Typ " (*) " in der " was zu finden: " Bar des ersetzen-Fenster und lassen die " ersetzen durch: " bar leer. Wählen Sie ' ersetzen alle ', alle Instanzen der Klammern zu entfernen.
         Hinweis: Die * steht für beliebig viele Zeichen, indem man dieses Zeichen zwischen zwei Klammern, die das Programm aufgefordert wird, jede Instanz in den markierten Zellen zu finden und eine Instanz der Klammern mit dem nichts, so entfernen sie ersetzt werden.
2. Bestimmung angereichert Wege
   1. Kopie der gen-Symbole des Satzes für die man will die angereicherten Pfade in die Zwischenablage zu bestimmen. Gehen Sie zu ConsensusPathDB ¹². Wählen Sie " gen set Analyse " in der linken Seitenleiste der Webseite, gefolgt von " Überrepräsentation Analyse ".
   2. Fügen Sie die Liste von Genen in der " eine Liste von gen/Protein-IDs einfügen " Feld. Wählen Sie gen-Symbol in der " gen/Protein-ID Typ " box und klicken Sie auf " weiter ". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben dem " Wege definiert durch Weg Datenbanken " unter dem Pfad-basierte setzt Abschnitt.
      Hinweis: Eine Reihe von Optionen für die Analyse wird angezeigt, einschließlich der Liste der verfügbaren Datenbanken zu suchen. Es wird empfohlen, de-Auswahl alle Datenbanken mit Ausnahme der Kegg und Reactome Datenbanken sind etablierte und umfassend. Die minimale Überlappung mit Liste und p-Wert cutoff Eingabeeinstellungen kann auch je nach Bedarf angepasst werden. Wir empfehlen, diese Einstellungen auf die Standard 2 gen minimale Überlappung und ein 0,01 p-Wert Cutoff.
   3. Select " finden angereicherten " erhalten die Liste der Pfade mit Genen in der Eingabeliste.
      Hinweis: Die Ausgabe werden im Tabellenformat, einschließlich des Namens des jeder Pfad gefolgt von " Größe " (d. h. die Anzahl der insgesamt Gene im Weg), " Kandidaten enthalten " (d. h. die Anzahl der Gene in der Eingabeliste, die in diesem Pfad ), sowie der p-Wert und Q-Wert (FDR) und der Datenbank, aus denen der Pfad identifiziert wurde.
3. Generation Weg Netze
   1. angereicherten Wege zu bestimmen, wie oben beschrieben.
   2. Wählen Sie alle der angereicherten Bahnen in einem Weg-Netzwerk zu visualisieren, indem entweder jedes Kontrollkästchen neben den Pfad-Namen angezeigt werden oder auf " alle " unter " wählen Sie " in der Spaltenüberschrift über die Auswahlfelder wählen Sie dann " Visualisieren Sie Auswahlmengen ".
      Hinweis: Wir empfehlen, alle Wege zu visualisieren, gibt es weniger als 30; gibt es mehr als 30 Wege empfehlen wir die Top 30 am meisten bereichert Wege zu wählen (solche mit der größten Anzahl von Genen aus der Eingabeliste).
   3. Anpassen der " relative Überlappung " und " geteilt Kandidaten " Filter, wenn entweder das Kontrollkästchen oben in der Mitte der Seite und Eingabe desirEd Prozent relative überlappen oder Anzahl der gemeinsamen Kandidaten zu strenger um mehr zu machen sein Überschneidungen innerhalb der Netze der Weg klarer, und wählen Sie " gelten ".
      Hinweis: Wir empfehlen eine minimale relative Überschneidung von 0,2, Angabe einer 20 % gen Überlappung zwischen 2 Wege, sie zu verbinden und ein Minimum von 2 gemeinsamen Kandidaten. Die Diagramm-Legende kann gesehen werden, indem Sie auf das Diagramm-Legende im linken oberen Bereich der Seite.
4. Bestimmung der angereicherten GO Begriffe
   1. Kopieren der gen-Symbole der Gruppe wofür man die angereicherten gen Ontologien in die Zwischenablage zu bestimmen will. Gehen Sie auf die ' GO Anreicherung Analyse-Tool ' Gene Ontology Konsortium ¹³. Fügen Sie die Liste der gen-Symbole in der Box auf der linken Seite der Seite unter " hier Ihre gen IDs … "
   2. Wählen Sie welches Set GO Begriffe zu verwenden, unter Feld gen IDs aufgeführt: biologischer Prozess, molekulare Funktion oder zellulären Komponenten. Auswählen (empfohlen) ' biologischen Prozess '. Wählen Sie ' Danio Rerio ' unter dem Sprung Begriffe box und klicken Sie auf " senden ".
      Hinweis: Wir empfehlen die Verwendung des Standard-p-Wert-Grenzwertes 0,05.

5. Überprüfung durch qRT-PCR

Hinweis: einzelne Gene identifiziert, die mit Veränderungen der bedeutenden Genexpression in RNASeq durch gezielte qRT-PCR in wiederholte Experimente überprüft werden.

1. cDNA Synthese
   1. Auszug die RNA aus Embryonen, die mit der in Abschnitt 3.1 beschriebenen Methode. RNA-Extraktion.
   2. Konvertieren 1 µg RNA in cDNA cDNA Konvertierung kit (siehe Tabelle der Materialien). Kombinieren Sie RNA, dNTPs und Enzym Reverse Transkriptase. Führen Sie die Thermocycler Reaktion nach Angaben des Herstellers ' s Spezifikationen.
   3. Verdünnen cDNA 1:3 in DEPC-behandeltem Wasser. Shop bei 4 ° C bis zu 1-2 Monate.
2. qRT-PCR-Nachweis
   1. Wählen Sie Gene, durch qRT-PCR aus RNA Sequenzierung Ergebnissen zu überzeugen. Gene zu identifizieren, mit hohen Falte Änderungen im Ausdruck. Bestimmen welche diese Gene auch hohe lesen Sie zählt, enthalten, da dies reichlich Ausdruck angibt.
   2. Wählen Sie 10-12 Ziele aus der hohen Falte Veränderung, hohe lesen Sie Zählliste Gene. Design-Primer an die Zielgene zu verstärken, die mindestens 1 Intron-Exon-Grenzen erstrecken.
   3. Geben Sie das Gen oder die gezielte Region des Gens in qPCR Primer Design Seite ¹⁴. Wählen Sie die " design 2 qPCR Primer " und fordert die Website Grundierung erstellen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die interne Kontrolle Primer, wie β-Aktin, einschließen, um Vergleiche zwischen den Proben zu normalisieren. Die β-Aktin-Primer sind F: 5 ' - TCGAGCTGTCTTCCCATCCA - 3 ' und R: 5 ' - TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG - 3 '.
   4. Verbinden die cDNA, forward Primer, rückwärts-Primer und Polymerase. Führen Sie qRT-PCR-Amplifikation um festzustellen, die relative Expression von Genen ¹⁵.
   5. Analysieren die relative mRNA Expression von Genen des Interesses durch relative Quantifizierung Entschlossenheit ¹⁵.
   6. Vergleichen die qRT-PCR zu RNASeq Ergebnissen zu gewährleisten, dass die Direktionalität differentielle Expression entspricht.

Results

Sortierung der differenziell ausgedrückt Gene:

Wir gezielte Ermittlung differentiell exprimierten Gene im Larvenstadium von Zebrafisch-Modellen von Alström-Syndrom und Bardet-Bardet-Syndrom (BBS), entweder alms1 oder bbs1 Abschriften durch die Injektion von zuvor validiert Spleiß-blocking MOs in Wildtyp Zebrafish Embryos^16,17. 5 Tage nach Befruchtung (Dpf)...

Discussion

In diesem Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine relativ schnelle und kostengünstige Strategie für Transkriptom-Level-Analyse der ganze Tiere oder bestimmte sortierte Zellpopulationen. Der Zebrabärbling bietet eine vorteilhafte Modell für diese Art der Studie wegen der Leichtigkeit und Schnelligkeit beim generieren großer Mengen an Material, die einfache Implementierung von genetischen oder experimentelle Umweltbedingungen und die Verfügbarkeit eines großen ab Spektrum an transgenen Reporter Linien zur Isolation von Z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial Reagenzien
TriZol	Thermo Scientific	15596026	Lysereagenz
TrypLE	Gibco	12604013	Dissoziationspuffer 1
FACSMax	Genlantis	T200100	Dissoziationspuffer 2
DEPC-behandeltes Wasser	Sigma	95284
FirstStrand cDNA-Umwandlung	Thermo Scientific	K1621	cDNA-Umwandlungskit
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	qRT-PCR Master Mix
FACS	Puffer Fisher Scientific	50-105-9042
Chloroform	Sigma Aldrich	288306
Natriumacetat	Sigma Aldrich	S2889
Name	Firma	Katalognummer	Kommentare
Zebrafish Stämme
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Name	< strong>Company	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstung
40 Mikron Zellsieb	Sigma	CLS431750
FACS Tube	BD Falcon	352063
Hämozytometer	Sigma	Z359629
Präpariermikroskop	Zeiss
Inverses Mikroskop	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq Illumina
LightCycler 480	Roche
Gegentanks 1,0 l Kreuzungstank-Set	Aquaneering	ZHCT100 FACS-Tube
5 mL Polypropylen-Schlauch	BD Falcon	352063
Name	Company	Katalognummer<	strong>Kommentare
>Software
Excel	Microsoft
Konsensus Pfad DB	http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO Anreicherungsanalyse	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis