Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.
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Methodenartikel
Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Innerhalb des angeborenen Immunsystems spielen Effektor-Lymphozyten, die sogenannten natürlichen killer (NK)-Zellen eine wesentliche Rolle in der Wirt Verteidigung gegen anomale Zellen, insbesondere Beseitigung Tumor und viral infizierte Zellen. Ca. 30 bekannten monogenen Defekte, zusammen mit einer Vielzahl von anderen pathologischen Zuständen verursachen entweder funktionelle oder klassische NK Zelle Mangel, manifestiert sich in reduziert oder fehlend zytotoxische Aktivität. In der Vergangenheit wurde Zytotoxizität mit radioaktiven Methoden untersucht die mühsam, teuer und potenziell gefährlich sind. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte, klinisch einsetzbaren Flow Cytometry basierende Methode um zytotoxische NK-Zell-Aktivität zu quantifizieren. In diesem Test sind peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) oder gereinigte NK Zelle Vorbereitungen Co inkubierten bei unterschiedlichen Verhältnissen eine Ziel-Tumor-Zell-Linie bekannt, empfindlich gegen NK zellvermittelte Zytotoxizität (NKCC) sein. Die Zielzellen sind bereits beschriftet mit einem Fluoreszenzfarbstoff ermöglicht ihre Diskriminierung aus den Effektorzellen (NK-Zellen). Nach der Inkubationszeit sind getöteten Zielzellen durch eine Nukleinsäure-Fleck, identifiziert, die speziell die abgestorbenen Zellen durchdringt. Diese Methode ist geeignet, um sowohl Diagnose- und Anwendungen in der Forschung und, Dank an die Multiparameter-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie, hat den zusätzlichen Vorteil der potenziell ermöglicht eine tiefere Analyse der NK Zelle Phänotyp und Funktion.
Einleitung
Natürliche killer (NK)-Zellen sind eine anspruchsvolle Teilmenge der menschlichen angeborenen Lymphozyten kritisch beteiligt bei der Beseitigung von viral infizierte Zellen, transformierten Zellen und anderen pathogenen Bedrohungen 1,2. NK-Zellen lytische Granulat Haus zytotoxische Proteine, wie Perforin und Granzyme. Nach der Aktivierung NK-Zellen bilden ein komplexes Zusammenspiel mit ihren Zielen bekannt als immunologische Synapse, wobei diese Zytolyse Moleküle lokal freigesetzt werden, was direkte Ziel Zelle Lysis und Apoptose, zusammen mit Freisetzung von Zytokinen und Chemokin und letztlich in der Indukt....
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Protokoll
Die Proben wurden gemäß den ethischen Richtlinien des UCLA Human Research Protection Program entnommen und vom IRB genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Reagenzien vor der Verwendung bei Raumtemperatur äquilibriert werden. Alle Reagenzien müssen steril bleiben.
- Bereiten Sie eine 2x Arbeitslösung von Tween-20 (d. h. 0,2%) vor, indem Sie 10 μl Tween-20-Lösung zu 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium mit einer p20-Pipette hinzufügen.
- Angesichts der hohen Viskosität von Tween-20 sollten Sie die folgende....
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Ergebnisse
Vor der Inbetriebnahme der Assay empfiehlt es sehr, dass NK Zellinhalt in der Effektor Bevölkerung Wahl beurteilt werden. Abbildung 1 zeigt eine typische CD56 Färbung vor (hellblau) und nach (rot) NK Zelle Bereicherung. NK-Zellen sollte bestehen aus bis zu 15 % der PBMCs und mindestens 80 % rein nach der Bereicherung.
Durchflusszytometrischen Analyse in diesem Assay umfasst Erkennung von zwei Parame.......
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Diskussion
Die hier beschriebene Methode bietet eine einfache und kostengünstige Alternative zu den traditionellen 51Cr Release Assay zytotoxische NK-Zell-Aktivität zu bewerten. Diese Methode ist empfindlich, reproduzierbare und weniger zeitaufwändig als die bisherigen Standardmethoden wie CRA, und eignet sich für beide klinischen und Forschung Anwendungen.
Während des Tests mit insgesamt PBMCs und angereicherte NK-Zellen arbeitet, ist die Option PBMCs Zellpopulationen zu reinigen ohne die Not.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Wir möchten Jill Narciso, UCLA Immungenetik Center, danke für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Handschrift.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x, ohne Ca2+ und Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stammlösung bei 10.000 U/ml |
| IL-2 | R& D Systems | 202-IL-050 | Lyophilisiert aus einem 0,2 μ; m filtrierte Lösung in Acetonitril und TFA mit BSA als Trägerprotein. Rekonstituieren mit 500 ul bei 100 μ g/ml in steriler 100 mM Essigsäure mit mindestens 0,1 % Rinderserumalbumin (2,1 x 10E6 I.E./ml) |
| K562 Zellen | ATCC | CCL-243 | Krebszelllinie |
| T-75 Zellkulturflaschen | Corning | 431464 | |
| Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Rekonstituieren Sie das I-Fläschchen mit 18 μl DMSO zur Herstellung einer 5 mM-Stammlösung. Nicht einfrieren/auftauen. | |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stammlösung wird zu 5 μ bereitgestellt M in 1 mL DMSO. Die DMSO-Lösung kann mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen werden, ohne dass das Reagenz abgebaut wird. |
| Natrium/Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen | BD | 02-687-95 | |
| 96-Well-Platte mit U-Boden | Corning | CLS3897 | |
| Serologische Pipetten | BD Falcon | ||
| Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (5 ml) | BD Falcon | 14959-5 | |
| konisches Röhrchen aus Polypropylen 50 | mL BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL Konisches Röhrchen aus Polypropylen | BD Falcon | 352097 | |
| Reagenzreservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Cocktail zur Anreicherung menschlicher NK-Zellen | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Referenzen
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
