Summary
الحركة المعقدة في بيئات طبيعي تتطلب التنسيق الدقيق لأطرافه تشمل مناطق القشرة الجدارية. وصف بروتوكول التالية استخدام عكسها التعطيل الناجم عن التبريد لإثبات دور المنطقة الجدارية 5 في تجنب عقبة تسترشد الذاكرة في القط سيرا على الأقدام.
Abstract
على التضاريس المعقدة، وطبيعي، يمكن استخدام المعلومات الحسية عن عقبة بيئية لضبط سرعة الحركات الحركي للإبطال. على سبيل المثال، في اتفاقية مناهضة التعذيب، يمكن أن تعدل المعلومات المرئية عن عقبة وشيكة الخطو للإبطال. يمكن أن يحدث التكيف الحركي أيضا مستقلة عن الرؤية، كما يمكن تعديل المدخلات عن طريق اللمس المفاجئ في الساق بعقبة المتوقعة يخطو كل أربعة أرجل للإبطال. هذا التنسيق الحركي معقدة تنطوي على هياكل سوبراسبينال، مثل القشرة الجدارية. ويصف هذا البروتوكول استخدام التعطيل القشرية عكسها، الناجم عن التبريد لتقييم مساهمات القشرة الجدارية للحركة الموجهة بالذاكرة عقبة في القط. وتتشكل الحلقات التبريد الصغيرة، المعروفة باسم كريولوبس، خصيصا لإلغاء تنشيط مناطق منفصلة من الاهتمام تقييم مساهماتهم إلى سلوك علني. وقد استخدمت هذه الأساليب توضيح دور المنطقة الجدارية 5 في تجنب عقبة تسترشد الذاكرة في القط.
Introduction
على طبيعي، تفاوت التضاريس، تعديل المعلومات الحسية عن عقبة، التي يمكن الحصول عليها عن طريق الرؤية أو اللمس، سرعة الحركة للإبطال. ويشمل هذا التنسيق الدقيق لحركات التنقل متعددة المناطق القشرية1،2. على سبيل المثال، قد تورط مناطق القشرة الحركية3،4 والقشرة الجدارية5،،من67 خلال المهام الحركية المعقدة مثل تجنب عقبة. الحيوانات كوادروبيدال، الخطوة التحويرات اللازمة لتجنب عقبة يجب أن يمتد إلى اليدين و hindlegs على السواء. إذا تم تأجيل الحركة إلى الأمام بين إزالة عقبة قوله وهيندليج (التي يمكن أن تنشأ كحيوان معالجته بعناية عن طريق فريسة المطاردة بيئة المعقدة، وطبيعي)، يتم استخدام المعلومات حول العقبة التي تحتفظ في الذاكرة لتوجيه هيندليج تخطي عقبة مرة السير الذاتية.
يمكن استخدام تقنيات تجريبية تهدف إلى تنشيط المناطق القشرية منفصلة لدراسة المساهمات القشرية للحركة عقبة الموجهة بالذاكرة. الناجم عن التبريد التعطيل القشرية يوفر طريقة موثوقة، واستنساخه بعكسها، لتقييم مساهمات القشرية ل سلوك علني8. كريولوبس مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب تتشكل محددة إلى المنطقة القشرية للفائدة، ضمان التعطيل انتقائية للغاية ومنفصلة من المكاني. مجرد مزروع، الميثانول مبردة يتم ضخه من خلال التجويف كريولوب يبرد منطقة اللحاء مباشرة أسفل الحلقة إلى < 20 درجة مئوية. أدناه هذا درجة الحرارة الحرجة، تحول دون انتقال متشابك في منطقة القشرة مباشرة أسفل الحلقة. يمكن عكس هذا التعطيل ببساطة عن طريق وقف تدفق الميثانول. وقد استخدم هذا الأسلوب لدراسة المساهمات القشرية لمعالجة حسية والسلوكيات9،10،11،،من1213،،من1415 , 16 , 17، فضلا عن التحكم في المحركات ل حركات العين ساككاديك18 وتسترشد الذاكرة عقبة الحركة19.
والغرض من هذا البروتوكول استخدام عكسها ديكتيفيشنز الناجم عن التبريد لتقييم مشاركة المناطق القشرية الجدارية للتنسيق الحركي في القط. على وجه التحديد، تم فحص الحركة عقبة تسترشد الذاكرة مع أو بدون نشاط القشرة الجدارية. وقد استخدمت هذه الأساليب بنجاح تثبت دور المنطقة الجدارية 5 في تجنب عقبة تسترشد الذاكرة في القط المشي19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات امتثالا للدليل "مجلس البحوث الوطني" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة؛ 2011) والمجلس الكندي لرعاية الحيوان دليل لرعاية واستخدام الحيوانات التجريبية (1993)، وكانت ووافقت جامعة ويسترن أونتاريو الحيوان استخدام اللجنة الفرعية "مجلس الجامعة" في "رعاية الحيوان".
يمكن تطبيق الإجراء التالي إلى تجارب دراسة المساهمات القشرية للتحكم الحركي في القط سيرا على الأقدام.
1-جهاز
- بناء جهاز يستخدم لتقييم الذاكرة عقبة.
ملاحظة: الجهاز يتألف من 2.43 م طويلة، 29 سم واسعة ممر محاطة بجدران واضحة اﻷكريليك عالية 18 سم (الشكل 1). فتحه ضيقة في منتصف الطريق على طول الجهاز يسمح 25.8 سم x واسعة 3 مم سميكة عقبة المثارة إلى أو إزالتها من الممشى استخدام رافعة التي شنت تحت السطح سيرا على الأقدام. - لضمان المحافظة على انتباه الحيوان في الأكل، تجنب استخدام اليد لرفع أو خفض في العقبة. بدلاً من ذلك، العقبة يمكن رفع أو خفض استخدام المحطة المجرب لتحريك الذراع تحت الممشى، مما يسمح المجرب لمواصلة إطعام الحيوانات.
- صحيح الحفاظ على نظام رافعة لضمان أن العقبة التي يمكن رفع أو خفض سوندليسلي.
- استخدام منصة صغيرة مرتفعة (23 سم طويلة × 23 سم x 16 واسعة سم ارتفاع) على الأغذية اللينة التي وضعت، لتوجيه حركات الحيوان.
- تسجيل جميع المحاكمات باستخدام كاميرا شبكة إيثرنت (54 إطارات/ثانية) التي شنت على ترايبود 1.85 م بعيداً عن خط الوسط للممشى.
2-تدريب الإجراءات
ملاحظة: للحصول على البيانات الناجحة، فترة التدريب السابقة لاختبار سلوكية يضمن أن كل الحيوانات هو تأقلم بشكل صحيح إلى غرفة الاختبار والأجهزة. التعرض المتكرر لبيئة رواية سيساعد في الحد من السلوكيات المجهدة مذهلة أو غيرها. التأقلم قد تختلف بين الحيوانات، وقد يتطلب 1-2 أشهر تدريب. قد تكون دورات التأقلم الأولية تصل إلى 5 دقائق في طول اعتماداً على التركيز والحافز للحيوان لتناول الطعام. ينبغي أن تهدف الدورات اللاحقة لزيادة مدة الزمن أن الحيوان الدافع للعمل (عادة حوالي 20-25 دقيقة).
- اكتساب ناضجة (> 6 أشهر من العمر) القطط المنزلي الشعر القصير من مربي مختبرات تجارية أي وزن أو الجنس.
ملاحظة: الدافع للعمل من أجل الغذاء والتصرف في تعاونية تشمل معايير الاختيار عندما تفكر في الحيوانات التي ينبغي أن تدرج في الدراسة. - يتأقلم كل الحيوانات إلى ارتداء تسخير التي يتم إرفاق مقود م 1 طويلة. مرساة المقود إلى رف فوق الممشى حول نقطة الوسط للممشى.
ملاحظة: يسمح هذا الحيوان على المشي على طول الجزء المركزي من الجهاز دون أي توتر، وبالتالي تشجيع الحيوان بالبقاء داخل هذا الجزء من الجهاز. إقامة مثل هذه الحدود مفيدة للتعامل مع موضوع اختبار الانتقال. - مكان الحيوان على الممشى، يسمح له بأكل من النظام الأساسي الذي يتم وضع الأغذية الناعمة.
ملاحظة: واحد والهدف من هذا التدريب الأولى هو التأكد من أن هذا الحيوان يتبع سهولة المنهاج الغذائي عندما تحركت إلى الأمام، ويمكن السير بشكل مريح مع تسخير والمقود. استخدام الأغذية لينة كالتعزيز الإيجابي تشجع الحيوان أن تظل مركزة خلال كل دورة التدريب أو الاختبار، ويعزز بيئة عمل مريحة. - التأكد من أن الحيوان مريحة مع معالجة، بما في ذلك الحالات حيث يجب أن يتم نقل الحيوانات إلى منطقة الممشى ابدأ.
3-السلوكية تدريب واختبار البروتوكول
ملاحظة: يتم تقييم الذاكرة عقبة في نماذج اثنين: مهمة ذاكرة بصريا تعتمد على عقبة، وتعتمد على اللمس عقبة مهمة ذاكرة. وينبغي استخدام كلا النماذج خلال التدريب الأولى والتجارب اللاحقة.
-
الذاكرة البصرية عقبة
- لتقييم الذاكرة البصرية عقبة، رفع العقبة على الممشى (الشكل 2A). وضع منهاج العمل على الجانب الآخر من العقبة. ضع الحيوان في منطقة الممشى ابدأ.
- السماح للحيوان لتناول الغذاء وتخطي العقبة مع فقط اليدين من أجل تناول الطعام من المنصة.
- كما تواصل هذا الحيوان أكل، انخفاض العقبة مثل أن يصبح تدفق مع الممشى لمنع أي مدخلات أخرى بصرية أو عن طريق اللمس.
- وبعد فترة تأخير متغير، نقل يرسل الغذاء مرة أخرى لتشجيع الحيوان استئناف المشي؛ وهذا التأخير يمكن أن يكون أقل من 1 ثانية إلى ما يزيد عن 2 دقيقة.
- الأهم من ذلك، إجراء المحاكمات حيث أن العقبة غائبة من أجل منع عملية تعود إلى العقبة وتطوير استجابة الأبطال المستفادة. في هذه البصرية عقبة في غياب المحاكمات، ضمان أن العقبة التي لم تثر على الممشى قبل وضع الحيوان في منطقة الممشى ابدأ.
- مراقبة هيندليج الخطو في العقبة إلى الوقت الحاضر وعقبة في غياب المحاكمات للتحقق من السلوكيات النمطية الحركية والذاكرة عقبة البصرية سليمة قبل التبريد. التأكد من أن الحيوان يمكن أن يزيل عقبة دون اتصال، وأن يخطو كل أربعة أرجل مرتفعة إلى حد كبير في الوقت الحاضر عقبة المحاكمات.
ملاحظة: مشاهدة أشرطة فيديو للتدريب محاكمات يمكن أن تساعد في هذا التحقق.
-
الذاكرة العقبة عن طريق اللمس
- لتقييم الذاكرة العقبة عن طريق اللمس، ضمان أن العقبة التي لم تثر على الممشى قبل وضع الحيوان في مجال بدء الممشى (الشكل 2).
- السماح للحيوان السير نحو منصة الغذائية على الجانب الآخر من الفتحة عقبة.
- كما يأكل الحيوان، رفع العقبة على الممشى تحت طبق الغذاء، منع أي مدخلات بصرية من العقبة.
- كما يتم نقل المواد الغذائية إلى الأمام، لاحظ أن الحيوان ينبغي الاتصال العقبة مع تلك اليدين قبل التنقل أكثر من ذلك.
- السماح للحيوان لمواصلة تناول الطعام في حين المتداخلة في العقبة بين الصدارة-و hindlegs. وخلال هذا الوقت، أقل العقبة حتى يصبح تدفق مع الممشى لمنع أي مدخلات أخرى بصرية أو عن طريق اللمس.
- بعد فترة تأخير متغير، نقل التوجيه الغذائي مرة أخرى لتشجيع الحيوان استئناف المشي.
- الأهم من ذلك، إجراء المحاكمات حيث أن العقبة غائبة ويحدث أي اتصال قوله لمنع عملية تعود إلى العقبة وتطوير استجابة الأبطال المستفادة.
- في هذه عن طريق اللمس عقبة في غياب المحاكمات، نهج الحيوان وأكل من منصة الغذاء، كما هو موضح في الخطوة 3.2.1. ومع ذلك، رفع وخفض العقبة (الخطوة 3.2.2) قبل أن ينتقل الطعام إلى الأمام في خطوة 3.2.3. التأكد من أن فترة تأخير مماثل حيث يسمح الحيوان أن تواصل أكل (الخطوة 3.2.4) تسبق النهائي استمرار الحركة (الخطوة 3.2.5).
- مراقبة هيندليج الخطو في المحاكمات التي تجري حاليا عقبة وعقبة في غياب التحقق من السلوك الحركي العادي والذاكرة عقبة البصرية سليمة قبل التبريد.
4-الفيديو تحليلات
ملاحظة: تشمل التحليلات خلال التدريب الأولى والتجارب اللاحقة بعد التبريد غرس حلقة لتقييم الذاكرة عقبة، التحديد الكمي لذروة الارتفاع خطوة وخطوة إزالة المسافة الأفقية بين إصبع القدم وعقبة في ذروة كل خطوة نماذج visual واللمس على حد سواء (الشكل 2).
- تحليل أشرطة الفيديو باستخدام البرامج النصية المكتوبة المخصصة.
- لكل محاكمة، وتعقب كل قدم بمناسبة وضع إصبع القدم الأقرب إلى الكاميرا في جميع أنحاء كل خطوة.
- قياس ارتفاع الخطوة الذروة كالمسافة العمودية بين إصبع القدم والسطح للممشى في أعلى نقطة في كل مسار الخطوة (الشكل 2).
- في المحاكمات، وعقبة-الوقت الحاضر قياس إزالة الخطوة كارتفاع خطوة مباشرة فوق فتحه عقبة مطروح قبل قمة العقبة.
- بالإضافة إلى ذلك، قياس المسافة الأفقية بين إصبع القدم والعقبة في ذروة كل خطوة في المحاكمات التي تجري في الوقت الحاضر عقبة.
- التأكد من أن قدرات الذاكرة عقبة سليمة قبل غرس حلقة التبريد بالتحقق من أن ارتفاع الخطوة ذروة مرتفعة في المحاكمات عقبة إلى الوقت الحاضر بالمقارنة مع الخطو في العقبة في غياب المحاكمات.
5-تبريد غرس حلقة (كريولوب)
- زرع كريولوبس ثنائيا على مناطق 5 و 7 وفقا للإجراءات الجراحية سبق الإبلاغ عنها8 (الشكل 3).
- وباختصار، لكل نصف الكرة الأرضية، إجراء اوديما ودوروتومي من هورسلي-كلارك الإحداثيات20 A15 إلى A25 لفضح ملتقى سولسي أنساتي والجانبية.
- موقف الفردية التبريد الحلقات التي تتشكل من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ 23-قياس هيبوديرميك مع الحلقة على اتصال مباشر بسطح منطقة الجدارية 5 أو 7 القشرية.
- تأمين القاعدة لكل كريولوب في الجمجمة مع اﻷكريليك الأسنان مرتبط بمسامير الفولاذ المقاوم للصدأ.
- إغلاق كرانيوتوميس مع اﻷكريليك الأسنان إضافية؛ إعداد هوامش الجلد تصل إلى حواف اﻷكريليك وخياطة معا.
6-القشرية بروتوكول التبريد
-
الإعداد التجريبية
ملاحظة: قبل أن يصل الحيوان إلى غرفة الاختبار، هو إعداد واختبار دارة التبريد. دائرة التبريد ويتكون من خزان الميثانول مع أنبوب مدخول (3.2 mm نقلت، 1.6 ملم معرف) وضرار مكبس المضخة وحمام الثلج الجاف متصلة عبر الأنابيب تترافلوروايثيلين (1.6 ملم نقلت، 0.5 مم الهوية؛ الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة إلى مقياس حرارة رقمي.- إضافة الثلج الجاف cc 500 إلى 200 مل ميثانول في حمام الثلج. نهايات الأنابيب تناسب شكل مريح على مدخل ومخرج من كريولوب وهمية لإكمال الدائرة التبريد.
- إرفاق التوصيل الحرارية لمقياس حرارة رقمي لرصد استخدام كابل يتألف من اثنين الحرارية الذكور الموصلات وأسلاك الحرارية درجات الحرارة المستمر. تأكد من أن طول هذا الكبل كافية للوصول إلى رأس الحيوان عند نهاية واحد موصول الحرارة.
- قم بتشغيل مضخة المكبس باستخدام رمز التبديل.
ملاحظة: ينبغي استخلاص الميثانول من الخزان، مرت المضخة إلى حمام الثلج الجاف حيث سيتم تبريد الميثانول تتدفق في الأنبوب إلى-75 درجة مئوية. ثم إنهاء حمام الثلج الميثانول مبردة وتشغيلها من خلال كريولوب المرفقة قبل العودة إلى خزان الميثانول. - التأكد من أن وضع مضخة وطول الأنابيب داخل حمام الثلج، وطول الأنابيب من حمام الثلج للحلقات دمية الأمثل أن درجة الحرارة كريولوب وهمية ويمكن الوصول إلى حالة مستقرة حوالي-5.00 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه درجات الحرارة التي تحققت خلال هذا الإعداد الأولى غالباً كافية لتحقيق درجة حرارة الاختبار من 3.0 ± 1.0 درجة مئوية عندما يتم استخدام نفس النظام لتبريد كريولوب مزروع. صعوبة في بلوغ تبريد كافية يمكن أن تحل عن طريق ضبط سرعة المضخة، زيادة طول الأنابيب المغمورة داخل الحمام الجليد، و/أو تقليل طول الأنابيب من حمام الثلج كريولوب. - إذا لزم الأمر، إطالة قسم من الأنابيب بخيوط نهاية الأنبوب من خلال مناسب نهاية أنبوب والحافة نهاية الأنبوب مع أداة التشفيه. إرفاق أنابيب بطول المطلوب مع نهاية المثل ذات حواف باستخدام موصل.
- تحقق من أن كافة الاتصالات دافئ وأي تسرب موجودة. مرة واحدة راضية عن الإعداد الأولية، إيقاف تشغيل المضخة، وإزالة كريولوب وهمية؛ الحلبة مستعدة الآن لحيوان اختبار.
-
اختبار سلوكية
- مكان الحيوان على جهاز الاختبار. الشريحة تسخير على رأسه وتأمين سنججلي حزام حول الحيوان. إرفاق المقود.
- قم بإزالة غطاء الحماية من كريولوب مزروع لفضح هذه الأنابيب مدخل ومخرج. تناسب الأنابيب ينتهي شكل مريح عبر الأنابيب مدخل ومخرج من كريولوب. قم بتوصيل القابس الحرارية للحرارة الرقمية.
- بدء جلسة الاختبار مع البصرية (الخطوة 3.1) أو عن طريق اللمس (الخطوة 3.2) عقبة الذاكرة للمحاكمة. اتبع مع محاكمات إضافية من جميع الأنواع الأربعة (البصرية عقبة إلى الوقت الحاضر، البصرية عقبة الغائبين، وعن طريق اللمس عقبة حتى الآن، وعن طريق اللمس عقبة-تغيب) بطريقة عشوائية.
ملاحظة: جلسة اختبار نموذجي يتكون من كتلة 'الحارة' المحاكمات، حيث يلاحظ تجنب عقبة تسترشد الذاكرة في غياب التبريد لوضع تدابير لخط الأساس. - التبديل على مضخة المكبس، وانتظر كريولوب للوصول إلى درجة حرارة ± 3.0 1.0 درجة مئوية (1-2 دقيقة). ثم قم بتشغيل كتلة 'بارد' المحاكمات بعد أن تم تبديل مضخة المكبس. خلال هذه الكتلة من المحاكمات، إذا لزم الأمر، تقييم مساهمات منطقة تبريد للاسترشاد في الذاكرة. ضمان المحافظة على درجة حرارة كريولوب في 3.0 ± 1.0 درجة مئوية في جميع أنحاء كتلة كاملة.
ملاحظة: جميع أربعة أنواع للمحاكمة يجب أن يكون عشوائياً تتخلل الكتلة. - تشغيل كتلة 'ريوارم' نهائي من المحاكمات بعد إيقاف تشغيل مضخة المكبس، وكريولوب قد عاد إلى درجة الحرارة الأصلية.
ملاحظة: السلوك يخطو خط الأساس إعادة تأسيس خلال هذه الكتلة. مرة أخرى، يجب أن تتخلل جميع أربعة أنواع للمحاكمة عشوائياً في جميع أنحاء الكتلة.
-
تنظيف
- عند الانتهاء من اختبار سلوكية إزالة الأنبوب من أنابيب مدخل ومخرج. تكون واعية من الميثانول المتبقية التي قد التنقيط من نهايات الأنابيب وقد تهيج الحيوان.
- تأكد من أن يتم استبدال غطاء الحماية. إزالة المقود وتسخير قبل أن يعود الحيوان إلى المستعمرة. تقليم نهايات الأنابيب (3-4 مم) باستخدام قاطع أنابيب لمنع اتصالات راشح في يوم الاختبار التالي.
7-التحقق من مدى التبريد
- في نهاية اختبار سلوكية، تأكيد أن مدى التعطيل يقتصر على المنطقة القشرة مباشرة أسفل كل كريولوب باستخدام تقنيات سبق الإبلاغ عنها8.
ملاحظة: يمكن التحقق من ذلك مع الهبوط الحراري تعيين12 أو حرارية تصوير كاميرا13،،من1419.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول قد استخدمت بنجاح لدراسة المساهمات القشرة الجدارية للذاكرة عقبة في القط المشي19. في هذه الدراسة، تم كريولوبس مزروع على الصعيد الثنائي عبر المناطق الجدارية 5 و 7 في الثلاثة الكبار (> 6 أشهر من العمر) القطط الإناث (الشكل 5A). وجرى تقييم الحيوانات في نموذج الذاكرة عقبة اللمس في غياب التبريد (الحارة، حالة عنصر التحكم)، أو عندما كانت المنطقة 5 أو 7 المعطلة على الصعيد الثنائي.
نتائج تمثيلية من تلك الدراسة تبين أن عند منطقة 5 كان ثنائيا تبريده، هيندليج داس كان يخفف إلى حد كبير في المحاكمات عقبة إلى الوقت الحاضر (الشكل 5، الأزرق). في حالة دافئة، كان ذروة الذروة يعني خطوة للبادئة والزائدة hindlegs 9.5 ±2.2 سم و 8.0 ±2.1 سم، على التوالي. ANOVA متعدد المتغيرات ذات اتجاه واحد وكشف أنه عندما تم تبريد المنطقة 5، ارتفاع ذروة خطوة للبادئة والزائدة hindlegs انخفضت انخفاضا كبيرا إلى 4.3 ±2.2 سم (ف < 0.0001) و 3.4 ±1.4 سم (ف < 0.0001)، على التوالي. لا تأثر ارتفاع الخطوة الذروة لليدين في المحاكمات التي تجري في الوقت الحاضر عقبة أو من أي الساق في المحاكمات عقبة في غياب التعطيل المنطقة 5. وبالمثل، ذروة الارتفاع خطوة لأي الساق في المحاكمات أما العقبة إلى الوقت الحاضر أو عدم وجود عقبة لم تختلف عن الشرط الحارة عندما أبطل مفعول المنطقة 7.
وعلاوة على ذلك، تأثر إزالة الخطوة هيندليج وبالمثل عندما أبطل مفعول المنطقة 5. في الشروط المقارنة للحارة والمنطقة 7 تبريد، وإزالة الخطوة خفضت إلى 4.7 سم ±2.2 في الخطوة هيندليج الرائدة (ف < 0.0001؛ الشكل 5) و −5.6 ±1.4 سم في الخطوة هيندليج زائدة (ف < 0.0001). بالإضافة إلى ذلك، تأثر مسار الخطوة هيندليج زائدة بالتعطيل المنطقة 5، كما حدث الذروة قبل العقبة، خلافا للخطو في الحارة والمنطقة ظروف تبريد 7 (الشكل 5).
تماما، أوضحت هذه التغييرات في ذروة الارتفاع خطوة وإزالة خطوة خطوة مسار العجز عقبة عميقة في الذاكرة عندما تم إلغاء تنشيط المنطقة 5. الأهم من ذلك، تعطيل المنطقة 5 فقط تغيير خصائص هيندليج الخطو في الوقت الحاضر عقبة المحاكمات ولا تنتقص من قدرة على جعل حركات التنقل، تعكس هذه التغييرات الملحوظة في الحركة الذاكرة، عجز لا السيارات. وعلاوة على ذلك، التصوير الحراري التي يؤديها في ختام اختبار سلوكية أكدت أن تبريد مقصورة على منطقة 5 أو 7 عندما كان تبريد كل حلقة على حدة لكل نصف الكرة الأرضية (الشكل 6). وهكذا عموما، تثبت هذه النتائج إسهامات المنطقة الجدارية 5 إلى الحركة الموجهة بالذاكرة عقبة في القط.
رقم 1: رسم بياني يصور الكاميرا، ومعدات التبريد، والمشي الأجهزة المستخدمة لتقييم الذاكرة عقبة في القط 2.43 م طويلة، 29 سم واسعة الممشى محاطة بجدران زجاجي واضحة عالية 18 سم. في منتصف الطريق على طول الممشى، عقبة سميكة 25.8 سم 3 مم على نطاق واسع يمكن أن ترفع في الممشى من خلال فتحه ضيقة باستخدام رافعة التي شنت تحت الممشى. لكل محاكمة، يوضع الحيوان بضع خطوات من العقبة في منطقة انطلاق للممشى. يتم وضع الغذاء على منصة مرتفعة صغيرة (23 سم طويلة × 23 سم x 16 واسعة سم ارتفاع) على الجانب الآخر من فتحه عقبة مقابل ابتداء من المنطقة. وتسجل جميع المحاكمات عبر كاميرا إيثرنت التي شنت على رأس ترايبود وحفظها على جهاز كمبيوتر محمول. وقد تم تعديل هذا الرقم من وونغ et al. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: رسم تخطيطي يصور مهام الذاكرة عقبة البصري وعن طريق اللمس والخطوة القياسات المستخدمة لتقييم الذاكرة عقبة في القط المشي (A) لتقييم الذاكرة البصرية عقبة، العقبة التي أثيرت على الممشى الحيوان مع اقتراب برنامج الأغذية. بعد تخطي العقبة مع فقط اليدين، يسمح الحيوان أكل من منهاج العمل، كما خفضت العقبة سراً أن يصبح تدفق مع سطح الممشى. بعد فترة تأخير متغير، يتم نقل الأغذية إلى الأمام لتشجيع الحيوان استئناف المشي. (ب) تقييم الذاكرة العقبة عن طريق اللمس، والعقبة التي لم تثر على الممشى الحيوان مع اقتراب برنامج الأغذية. كما يأكل الحيوان، يتم رفع العقبة التي بصمت على الممشى تحت منصة الغذاء مباشرة. يتم نقل الأغذية إلى الأمام مما تسبب اليدين الحيوان الاتصال في العقبة قبل التنقل أكثر من ذلك. مسموح بالحيوانات الاستمرار في تناول الطعام من برنامج الغذاء في حين المتداخلة في العقبة بين اليدين و hindlegs. خلال هذا الوقت، هو تخفيض العقبة سراً الممرات. الطعام يتم نقل إلى الأمام مرة أخرى إلى تشجيع الحيوان استئناف المشي. يتم قياس الخطوات هيندليج لتقييم الذاكرة عقبة. (ج) زيادة تقدر في كلا نماذج الذاكرة عقبة البصري وعن طريق اللمس بقياس ارتفاع ذروة خطوة وخطوة إزالة المسافة الأفقية بين ذروة كل خطوة والعقبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التخطيطي كريولوب- كريولوب يتكون من قبعة واقية، الذي يناسب عبر الأنابيب مدخل ومخرج. تشغيل من خلال وظيفة خيوط هذه الأنابيب ويشكل الحلقة التي يجلس على اتصال مباشر بسطح القشرية على منطقة الفائدة. ميكروثيرموكوبلي ملحوم في اتحاد حلقة لقياس درجة الحرارة كريولوب. تشغيل مرة أخرى من خلال الأنبوب انكماش (الذي يلتف أيضا الفولاذ المقاوم للصدأ الأنابيب) أسلاك وإرفاقها بموصل. يتم تأمين التجميع بأكمله في الجمجمة مع اﻷكريليك الأسنان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الدائرة التبريد. وتتألف الدائرة التبريد خزان الميثانول وضرار مكبس المضخة، وحمام الثلج، والحرارة، وكريولوب. بارد، وتوجه المضخة الميثانول من الخزان من خلال أنبوب المدخول (1.6 ملم معرف). الميثانول مخارج المضخة عن طريق أنابيب تترافلوروايثيلين (0.5 مم الهوية) ويتم ضخها عن طريق إلى حمام الثلج الجاف، حيث يتم تبريد الميثانول تتدفق في الأنبوب إلى-75 درجة مئوية. ثم الميثانول مبردة مخارج حمام الثلج ويخترق كريولوب المرفقة قبل العودة إلى خزان الميثانول. هذا كريولوب قد تكون حلقة وهمية (غير مزروع) المستخدمة أثناء الإعداد الأولى، أو قد يكون كريولوب مزروع في حيوان اختبار. كريولوب يرتبط أيضا بمقياس حرارة رقمي لتسجيل حلقة درجة الحرارة في جميع أنحاء اختبار سلوكية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: عكسها، ينتج التعطيل الناجم عن التبريد للمنطقة الجدارية 5 عقبة ذاكرة العجز. (أ) الأفقي عرض نصف الكرة الأيمن من المخ القط عرض كريولوبس مزروع مباشرة عبر المناطق الجدارية 5 (أزرق) و 7 (الأخضر) درست في وونغ et al. 19 d: الظهرية، ج: الأمامي. (ب–ه) بار المؤامرات التي تصور يعني خطوة الارتفاع ± SD العقبة-الوقت الحاضر (د ب، ) وعقبة في غياب المحاكمات (ه ج، ) لليدين (ج ب، ) و hindlegs (، د ه) للمجال (أحمر)، الحارة 5 تبريد (الأزرق)، و (شروط تبريد 7 منطقة الأخضر). خطوة الارتفاع انخفضت انخفاضا كبيرا في hindlegs الرائدة وزائدة في المحاكمات التي تجري في الوقت الحاضر عقبة عندما أبطل مفعول المنطقة 5. (و) بار المؤامرة التي تصور هيندليج يعني خطوة إزالة ± SD لكل شرط التبريد. المنطقة 5 التعطيل أسفرت عن إزالة مخفضة السواء البادئة والزائدة الخطوات هيندليج. (ز) بار المؤامرة التي تصور يعني المسافة الأفقية بين ذروة كل خطوة والعقبة لكل شرط التبريد. عندما تم تبريد المنطقة 5، مسارات خطوة أكثر تقلباً ويختلف اختلافاً كبيرا عن الحارة والمنطقة ظروف تبريد 7. ف < 0.005، * *ف < 0.0001، نوفاسكوتيا: ليس كبيرا. وقد تم تعديل هذا الرقم من وونغ et al. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: التصوير الحراري المستخدمة لتأكيد التعطيل المقيد للمنطقة 5 أو 7 أثناء التبريد. (أ) صورة فوتوغرافية تصور كريولوبس على اتصال بالمناطق الجدارية 5 و 7 من نصف الكرة الغربي الصحيح. أعلى الظهرية، هو حق الأمامي. خط متقطع يمثل الحدود بين المناطق الجدارية 5 و 7. (ب–ج) صورت الصور الحرارية للسطح القشرية الجدارية عند كريولوب على مساحة 5 (ب) أو منطقة 7 (ج) تم تبريده إلى 3 درجات مئوية. وقد تم تعديل هذا الرقم من وونغ et al. 19 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يستخدم نموذج وصف المستحثة بتبريد ديكتيفيشنز من المناطق القشرية منفصلة باستخدام كريولوب بغية دراسة الحركة الموجهة بالذاكرة عقبة في القط. نماذج الذاكرة عقبة اللمسية والبصرية بسيطة إلى حد كبير للحيوانات لتنفيذ كما أنها تستغل طبيعي السلوكيات الحركية التي تحدث مع الحد الأدنى من الجهد عند حيوان الدافع لتتبع مصدر متحرك لغذاء. وهكذا معظم فترة التدريب مكرس للتأقلم الحيوان اختبار الغرفة ومعدات التبريد. تتطلب معظم الحيوانات التعرض المتكرر لارتداء تسخير ويجري المربوطة عن طريق المقود قبل المشي بشكل مريح وطبيعي على الجهاز. بالإضافة إلى ذلك، أثناء الاختبار، صوت مضخة المكبس قد يصرف أو باغت الحيوان. إكمال الدائرة التبريد مع كريولوب وهمية وتشغيل المضخة أثناء التدريب الأولى السماح للحيوان يتأقلم على صوت المضخة. وعلى الرغم من الحصول على التدريب الكافي قبل الاختبار، سيكون هناك يرجح أن فترة زمنية محدودة للاختبار قبل أن يصبح الحيوان لا يهدأ. ولذلك، يكرس وقتاً كافياً لضمان الإعداد السليم واستكشاف الأخطاء وإصلاحها قبل إدخال الحيوان في غرفة الاختبار سيتم تحسين جمع البيانات اللاحقة.
صعوبة تحقيق تبريد كافية يمكن أن تعالج عن طريق ضبط سرعة المضخة. ومع ذلك، ينبغي إيلاء الاهتمام الضغوط المتزايدة التي قد تؤدي مع الأنبوب إجبارهم قبالة أنابيب مدخل أو مخرج من كريولوب. وبدلاً من ذلك، يمكن زيادة طول الأنابيب المغمورة في حمام الثلج لتمكين المزيد من الوقت للبرد وتدفق الميثانول داخل الأنابيب. بالإضافة إلى ذلك، سيتم التأكد من أن طول الأنابيب من نقطة إلى نقطة الخروج من حمام الثلج كريولوب قصيرة قدر الإمكان تقليل الخسائر في التبريد. ومع ذلك، هذه المسافة يجب أيضا طويلة بما يكفي للسماح لمجموعة كافية من الحركة لنموذج سلوكية معينة. قد عزل الأنابيب مع التفاف الرغوية المرنة لتحسين كفاءة التبريد. يمكن أيضا أن تمنع هذه التفاف قطرات تكثيف التي تشكل حول الأنبوب من السقوط على الحيوان، والتي قد تثير غضب أو باغت الحيوان. أثناء الاختبار، وضمان دافئ تناسب الأنابيب عبر المدخل ومنفذ أنابيب كريولوب يمكن أن تجعل الاتصال كريولوب صعبة. يرتدي من النتريل أو قفاز مطاط يمكن أن توفر أفضل قبضة الأنابيب. ضمان أن الحيوان مريحة والمريض حين تعلق المجرب الأنبوب أمر ضروري. يمكن استخدام الغذاء للحفاظ على الحيوان ثابتة والمحتوى.
ويمكن تبريد كريولوبس بشكل روتيني الغلة استنساخه بشدة التغيرات في السلوك عند إلغاء تنشيط منطقة معينة. بتقييم نفس المهمة في وجود وغياب التعطيل القشرية داخل الحيوان نفسه، يجوز تخفيض العدد الإجمالي للحيوانات المستخدمة. وعلاوة على ذلك، قد تكون معالجته مدى التبريد لمواصلة تحديد المساهمات القشرية لسلوك معين. على سبيل المثال، يمكن أن يتم ديكتيفيشنز الأحادية والثنائية على حد سواء في الحيوان نفسه لدراسة الآثار lateralization الممكنة للسلوك. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف درجة التبريد لدراسة المساهمات الصفحي. بتبريد كريولوبس في السطح القشرية لتيار 3.0 درجة مئوية، يتم تبريد كل ست طبقات من اللحاء مباشرة أسفل كل حلقة إلى < 20 درجة مئوية، ويعوق نشاط الخلايا العصبية التشويك22. وبدلاً من ذلك، يمكن تبريد كريولوبس إلى 8.0 تيار درجة مئوية، الذي يبرد بشكل انتقائي فقط الطبقات القشرية سوبراجرانولار أدناه هذا درجة الحرارة الحرجة من 20 درجة مئوية. قد تسمح بتقييم السلوكيات مع مثل هذا التعطيل القشرية السطحية، فضلا عن التعطيل الكامل القشرية ديسوسييشنز ترانسلامينار القشرية الدالة21.
وعلى الرغم من هذا التنوع، وينبغي النظر في القيود التالية أثناء التصميم التجريبي. بينما التبريد نهج ممتازة لإلغاء تنشيط كافة أنواع الخلايا في منطقة القشرية، فإنه لا يمكن أن توفر وسيلة للتعطيل مع خصوصية الخلوية التي قد تتحقق مع تقنيات التعطيل أوبتوجينيتيك. وعلاوة على ذلك، التبريد يتطلب حدا أدنى 45 ثانية قبل استقرار درجات الحرارة كريولوب عند درجة الحرارة الحرجة لتيار 3.0 درجة مئوية للتعطيل الوظيفي. وهكذا، ينبغي إدراج الاعتبارات المتعلقة الفترة الزمنية اللازمة لتحقيق التعطيل الوظيفي في البروتوكول التجريبي للاختيار.
وعموما، نظام التبريد تتطلب الحد الأدنى من الصيانة. يجب فحص الأنابيب والموصلات من دارة التبريد بانتظام لتسرب. ينبغي الاستعاضة عن الميثانول داخل الخزان أسبوعيا ضمان خلو من الجسيمات الميثانول. كريولوبس مزروع أيضا تتطلب الحد الأدنى من الصيانة. يتم تنظيف الهوامش بشكل دوري بمحلول بيروكسيد الهيدروجين 3% تليها حل فرك جراحية. مع الاستخدام السليم والرعاية، ويمكن تبريد كريولوبس مزروع بشكل روتيني لسنوات عديدة. يمكن تكييفها مع هذه الإجراءات التبريد القشرية الأخرى النماذج السلوكية10،،من1112 أو تسجيل الكهربية الاستعدادات13،14 في نماذج حيوانية بديلة 1517،،،من1822.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونعترف مع الامتنان الدعم من المعاهد الكندية للبحوث الصحية، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة)، والمؤسسة الكندية للابتكار. وأيد C.W. بالكسندر غراهام بيل كندا الدراسات العليا المنح الدراسية (مقدمة).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | IDS Imaging Development Systems GmbH | Model: UI-5240CP-C-HQ | |
| Intake tubing | Restek | 25306 | Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump |
| Pump | Fluid Metering, Inc. | Model: QG 150 | |
| Nalgene Dewar vacuum flask | Sigma-Aldrich | F9401 | |
| Teflon tubing | Ezkem | A051754 | |
| Microprobe thermometer | Physitemp | Model: BAT-12 | |
| Flanged tube end fittings | Valco Instruments Co. Inc. | CF-1BK | Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings |
| Washers | Valco Instruments Co. Inc. | CF-W1 | Extra washers |
| Flanging kit | Pro Liquid GmbH | 201553 | |
| Tubing connector | Restek | 25323 | |
| Tubing cutter | Restek | 25069 | |
| Male thermocouple connector | Omega | SMPW-T-M | Used to make cable connection to thermometer |
| Thermocouple wire | Omega | PP-T-24S | Used to make cable connection to thermometer |
| MATLAB | MathWorks | n/a |
References
- Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
- Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
- Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
- McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
- Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
- Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
- Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
- Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
- Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
- Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
- Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
- Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
- Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
- Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53 (2011).
- Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19 (2015).
- Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
- Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
- Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
- Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
- Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
- Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).
