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Methodenartikel

Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen

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DOI:

10.3791/56200

⸱

1. September 2017

 , 
1Department of Craniofacial Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Zusammenfassung

Mutierte Zebrafisch Phänotypen sind oft unvollständig penetrant, nur in einigen Mutanten manifestiert. Interessante Phänotypen, die uneinheitlich erscheinen können schwierig sein, zu studieren und zu verwirrende Ergebnisse führen können. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfache Zucht Paradigma zu erhöhen und verringern Penetranz in tödliche Zebrafisch Skelett Mutanten. Da letale Mutanten können nicht direkt gezielt gezüchtet werden, ist die klassischen Auslesezüchtung Strategie der Nachkommenschaft Tests eingesetzt. Diese Methode beinhaltet auch Protokolle für Kompetitive Allel spezifische PCR (KASP) Genotypisierung Zebrafisch und Färbung Larven Zebrafisch Knorpel und Knochen. Anwendung der hier beschriebenen Strategie zur Tierhaltung kann die Penetranz der eine interessante skelettalen Phänotyp ermöglicht mehr reproduzierbare Ergebnisse in downstream-Anwendungen erhöhen. Darüber hinaus kann verringern die mutierten Penetranz durch diese selektive Zuchtstrategie Entwicklungsprozesse offenbaren, die am wichtigsten ist die Funktion des mutierten Gens erfordern. Während das Skelett speziell hier betrachtet wird, schlagen wir vor, dass diese Methode für alle mutierten Zebrafisch-Linien nützlich sein wird.

Einleitung

Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modell für das Verständnis der Skelettbildung. Mit mutierten Zebrafisch Stämmen können Biologen Genfunktion während Skeletogenese entschlüsseln. Jedoch können Skelett mutierten Zebrafisch Phänotypen mit variabler Penetranz1,2,3,4 präsentieren die Entwicklungs- und genetische Analysen behindern können. Der Zweck dieser Methode ist dreifach. Zunächst ermöglicht Zebrafisch mutierten Linien erzeugen immer wieder schwere Phänotypen erzeugen nachgelagerte Studien wie Zeitrafferaufnahme5 und Transplantation6. Diese Art von Studien können gelähmt werden, indem er versucht, die Phänotypen zu studieren, die nur uneinheitlich manifestieren. Zweitens kann die Inzucht Zebrafisch Stämme genetischen Hintergrund Variation, also Förderung experimenteller Konsistenz und Reproduzierbarkeit verringern. Zum Beispiel alle in Situ können Hybridisierung Analysen auf eine selektiv Inzucht Belastung reduzieren verwirrende Variabilität und Schlussfolgerungen zu stärken. Drittens: Generierung von schweren und leichten Belastungen die gesamte phänotypischen Serie zeigen, die durch eine bestimmte Mutation entstehen können.

Selektive Zucht von letale Mutanten scheint auf den ersten Blick unmöglich. Wie kann eine Rasse für Penetranz, wenn die Tiere, die für die Auswahl erzielte sind tot sind? Glücklicherweise haben Methoden für die selektive Zucht von Familie Auswahl, speziell Nachkommen testen, Wirksamkeit bei der Viehzucht Programme für viele Jahre7,8gezeigt. Diese Programme dienen hauptsächlich für die selektive Zucht für Züge, die nur in einem Geschlecht, wie Milchleistung bei Kühen oder Ei-Produktion bei Hennen vorhanden sind. Die Männchen dieser Arten können nicht direkt, erzielte aber ihre Nachkommen werden ausgewertet und ein Wert wird dann an die Eltern zugewiesen. In Anlehnung an diese Strategie, beinhaltet das Protokoll hier vorgestellten erzielte die festen und gefärbten mutierten Nachkommen aus einem Paar von Zebrafisch, die heterozygot für eine Mutation von Interesse sind. Die Penetranz des Phänotyps bei den homozygoten tödlichen mutierten Nachkommen erhält die Eltern bei der Entscheidung, welche Individuen wird die nächste Generation in der Zeile zu produzieren. Wir finden, dass diese Methode ein wirksames Mittel zur Verlagerung Penetranz im Zebrafisch letale Skelett Mutanten1.

Ähnlich wie bei anderen Studien, nimmt dieses selektive Zucht-Protokoll unter Berücksichtigung Kriterien wie normale Entwicklung der Embryonen und Geschlechterverhältnis9, Gelegegrösse, Überleben der Nachkommen. Jedoch sind alle diese Faktoren im Zusammenhang mit einem mutierten Hintergrund mit dem Ziel der Verschiebung der mutierten Penetranz berücksichtigt. Daher reicht dieses Protokoll vorherigen Auslesezüchtung Paradigmen bieten eine Methode, um Stärken Entwicklungsstörungen mutierte Analysen sowie Hintergrund Homogenität zu erhöhen.

Dieses Protokoll erfordert umfangreiche Genotypisierung, deshalb es wichtig ist auf eine zuverlässige und schnelle Genotypisierung-Protokoll zu entwickeln. Es gibt viele Genotypisierung Protokolle verfügbar10,11, jedoch finden wir die KASP Genotypisierung12,13,14 ist schneller, kostengünstiger, effizienter und zuverlässiger als Methoden basierend auf Restriktionsenzym Spaltung der amplifizierten Sequenzen10. Daher sind wir ein KASP Protokoll in dieser Arbeit. Darüber hinaus wir zielen auf Skelett mutierte Phänotypen in diesem Protokoll und ein Verfahren für Alcian blau/Alizarin rote Färbung veränderte aus früheren Protokollen15umfassen.

Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Strategie zum tödlichen mutierten Penetranz verschieben, nach oben oder unten. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf Skelett mutierte Phänotypen, glauben wir, dass es eine sinnvolle Strategie für Tierhaltung aller mutierten Zebrafisch Linien sein wird. In der Tat hinausgeht die Nützlichkeit dieser Zuchtstrategie wahrscheinlich Zebrafisch. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll geändert werden kann, um Penetranz in einer Vielzahl von Organismen zu verlagern. Verschiebung tödliche Penetranz um Nachkommen testen kann dazu beitragen, den Fortschritt der Entwicklungsstörungen Genetiker voranzutreiben.

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Protokoll

alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden in gemäß und in Übereinstimmung mit der University of Colorado und der University of Oregon institutionelle Animal Care and Use Ausschüsse (IACUC) abgeschlossen.

1. Vorbereitung der nicht ausgewählte Start bestand

  1. identifizieren heterozygote Träger des mutierten Allels des Interesses von Fin clip 11 und Genotypisierung einen Bestand von voll-Geschwister Tiere durch die Methode der Wahl, wie KASP 12 , 13 , 14. Dieses Protokoll wurde mit dem Zebrafisch-mef2ca b1086-Stamm durchgeführt.
  2. KASP Genotypisierung
    Hinweis: Allel spezifische Primer für KASP sind von der Firma entworfen, die die Reagenzien bietet (siehe Tabelle der Materialien). Um zu erhalten die entsprechenden 6-Carboxylgruppen-X-Rhodamin (ROX) Farbstoff Konzentration für die Echtzeit-PCR-Maschine besuchen die Website des Unternehmens.
    1. Ort der Zebrafisch Schweif Gewebe in 50 µL Lyse-Puffer (10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3 % nichtionische Tenside, 0,3 % Octylphenyl-Polyethylenglykol). Fügen Sie 10 µL von 10 mg/mL Proteinase K pro Bohrloch einer 96-Well-PCR-Platte und verdauen in einem Thermocycler bei 55 ° C für 2 bis 5 h, gefolgt von einem 20 min. 94 ° C Inaktivierung Schritt hinzu. Kühlen Sie die Lyse Produkt nach Verdauung.
      Hinweis: Lyse Produkte können erfolgreich für mehrere Monate nach der Zubereitung verwendet werden. Wenn Gewebe mit 50 mM NaOH lysiert wurde, blieben KASP Reaktionen erfolglos. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NaOH-Methode der genomischen DNA-Vorbereitung nicht kompatibel mit KASP.
    2. Quantifizieren die genomische DNA mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die genomische DNA-Vorlage mit Molekularbiologie Grade Wasser, so dass jede Reaktion ca. 20-30 ng enthält.
      Hinweis: Quantifizieren Sie 4 oder 5 Proben zu, bündeln sie, dann bereiten Sie Verdünnungen für alle Proben, die basierend auf dem Durchschnitt. Bei Verwendung dieses Protokolls für Erwachsene Schweif Gewebe ist eine 1: 100 Verdünnung oft ausreichend. Die genaue Quantifizierung der DNA-Konzentration ist nicht erforderlich.
    3. Add 0,14 µL KASP Grundierung mischen und 5 µL des KASP Master pro Probe auf Eis in eine 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen vor kurz Zentrifugieren, um Inhalt an der Unterseite des Rohres sammeln, mischen.
      Hinweis: KASP master-Mix ist Wärme und Licht empfindlich, lagern auf dem Eis und vermeiden Sie direktes Licht.
    4. Pipettieren 5 µL Grundierung/Master mix Lösung in die Vertiefungen einer 96-Well optische PCR-Platte für die Echtzeit-PCR-Maschine verwendet wird.
    5. Pipettieren 5 µL verdünnt (ca. 5-7 ng/µL) DNA-Vorlage Proben in jedem gut und mit einer Pipette mischen Aspirieren.
    6. Hinzufügen 5 µL Nuklease-freies Wasser, 3 Brunnen dienen als keine-Vorlagensteuerelemente (NTC) und fügen Sie 5 µL verdünnter bestätigten homozygoter Wildtyp, heterozygot und homozygot mutierten DNA Schablone für Positivkontrollen.
    7. Silikondichtung eine optisch klare Folie über der Platte um sicherzustellen, dass der Film vollständig auf jedes gut versiegelt ist.
    8. Kurz Zentrifugieren die Platte 600 X g, der Inhalt an der Unterseite zu sammeln und um Luftblasen zu entfernen, aus dem Mix.
      Hinweis: Bewahren Sie die Platte auf Eis und Schild aus Licht bis bereit zu gehen.
    9. Verwenden Sie das Radfahren Programm in Tabelle 1 dargestellt, die Hauptreaktion KASP durchzuführen.
    10. Zeigen die resultierenden Streudiagramm von Analyse-Computer produziert. Eine erfolgreiche Reaktion zeigen 4 verschiedene Gruppierungen der Punkte auf dem Grundstück ( Abbildung 3): drei probieren Gruppierungen, Genotyp und eine Gruppierung von NTCs nahe dem Ursprung entspricht. Die Positivkontrollen sollten mit der entsprechenden Probe Gruppierung trennen.
    11. Wenn das Computerprogramm nicht die Handlung, die Gruppierungen erkennt als spezifische Genotypen, zusätzliche Radfahren Sets entspricht möglicherweise erforderlich (Tabelle 2). Das Zusatzprogramm zu wiederholen, bis der Computer enge Gruppierungen vom Genotyp erkennt.
    12. Die Genotypisierung Ergebnisse in einer Tabellenkalkulationsdatei für eine einfachere Nutzung und Analyse exportieren.
  3. Der identifizierten heterozygote Tiere zusammen auf dem Hauptsystem Wasser.

2. die erste Runde der Nachkommenschaft Scoring

    1. , nachdem die Tiere aus dem Fin-Clip erholen paarweise kreuzen Geschwister heterozygoten richten Sie paarweise Intercrosses. Teiler verwenden, um sicherzustellen, dass Embryonen sind synchrone 16.
    2. Sammeln die Embryonen und halten Sie die elterlichen Paare isoliert in der Zucht Käfige.
    3. Isolierte Erwachsene überwachen, so dass aggressive Fische können getrennt oder mit Abdeckung versehen (zerkleinerten Fisch Netze arbeiten schön). Fisch sollte gefüttert werden und ihr Wasser verändert nach IACUC Richtlinien in statische Wasser.
  2. Embryo Aufzucht
    1. Bühne und erhöhen die Zebrafisch-Embryonen, Larven unter Standardbedingungen 17.
    2. Sammeln phänotypisch Wildtyp Tiere mit einer Glaspipette am Tag 5 oder 6, wenn die Schwimmblase in 75 % der Kupplung aufgeblasen ist. Phänotypische Wildtypen zu platzieren, in den Kindergarten, die Aufnahme, welche Eltern ihnen ergab.
      Hinweis: Mit mutierten Allele, die rezessiv tödlich, die für viele Skelett Mutanten gilt, nicht reinerbige Mutanten Form Schwimmblase 18 , 19. Daher phänotypischen Wildtypen von mutierten Geschwister basierend auf aufgeblasenen Schwimmblase leicht erkannt werden können.
  3. Alcian blau/Alizarin rot Knorpel und Knochen Färbung
    1. Larven, die ihre Schwimmblase mit 0,17 g/L Tricaine-Pumpen nicht auf zu betäuben-S im Embryo Medien. Sammeln Sie Tiere in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einem weiten Bohrung Glas Pasteur pipettieren. Fügen Sie nicht mehr als 100 Larven pro Röhre.
    2. Embryo Wasser aus jeder Schlauch entfernen und Tiere in 1 mL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS pro Röhre beheben.
      Vorsicht: Wässrige PFA ist brennbar und schwere Haut- und Augenreizungen verursachen. Geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und waschen Sie gründlich die Hände nach Gebrauch.
    3. Rock für 1 h; längere Fixierung beeinträchtigt Knochen zu beflecken. Überprüfen Sie die Schläuche regelmäßig während dieser und alle nachfolgenden rockende Schritte, keine Larven haben klebte an der Seite oder in den Boden des Röhrchens verklumpt.
    4. Das Fixiermittel aus Rohren mit einer Glaspipette zu entfernen, fügen Sie 1 mL 50 % Ethanol, und Rock für 10 min.
    5. Bereiten frische Färbelösung durch Zugabe von 20 µL 0,5 % Alizarin Red pro 1 mL Alcian premix (0,04 % Alcian blau/10 mM MgCl 2 / 80 % Ethanol). Entfernen Sie 50 % Ethanol zu, fügen Sie 1 mL Färbelösung zu jedem Rohr und Rock über Nacht. Larven können bis zu 5 Tage in den Fleck bleiben.
    6. Entfernen Sie die Fleck-Lösung aus den Rohren und jedes Rohr 1 mL 80 % Ethanol/10 mm MgCl 2 Lösung hinzufügen. Rocken Sie die Rohre für mindestens 1 h; über Nacht Spülen einen klarer Alcian blau Fleck produzieren kann.
    7. Entfernen Sie die 80 % Ethanol/10 mM MgCl 2 Lösung aus den Rohren und 1 mL 50 % igem Ethanol zugeben; rock für 5 min.
    8. Entfernen Sie die 50 %-Ethanol-Lösung aus den Rohren und 1 mL 25 % Ethanol und Rock für 5 min.
    9. Die 50 % ige Ethanol-Lösung aus den Rohren zu entfernen und fügen Sie 1 mL frisch zubereitete 3 % H 2 O 2 /0.5% KOH Bleichbad. Lassen Sie die Kappen öffnen und lassen Sie die Rohre stehen in einem Micro-Tube Rack für ca. 10 Minuten oder bis eine schwache braune Färbung im oberen Teil der Lösung gesehen werden kann.
      Hinweis: Eine Schicht Bläschen Form auf die Lösung. Sorgfältige Timing ist bei diesem Schritt über bleichen führt zu einer armen doppelte Fleck.
    10. Bleichbad zu entfernen und fügen Sie 1 mL 25 % glycerol/0.1% KOH; rock für 10 min bis 1 h.
    11. 25 %-glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen, Hinzufügen jedes Rohr, Rock für 10 min über Nacht 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung 1 mL.
    12. 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung aus den Rohren zu entfernen und wieder hinzufügen 50 % glycerol/0.1%-KOH-Lösung für jedes Rohr. Rocken hilft über Nacht Luftblasen zu entfernen, die sich im Inneren Larven anreichern können. Store gebeizt Skelette Vorbereitungen bei 4 ° C, wenn nicht verwendet wird.
  4. Phänotyp erzielte
    1. Score gebeizt mutierte Nachkommen für die Penetranz des ausgewählten Phänotyps. In Nichols Et al. 1 durch Mutation entstehende Variationen für jedes Auftreten von ektopische Knochen erzielt wurden.
      Hinweis: Da der Zebrafisch-Eltern in statische Wasser sind und der Alizarin roten Fleck kann mit der Zeit verblassen, es ist wichtig, Skelette innerhalb weniger Tage der Vollendung der skelettartigen Vorbereitung Punkten.
    2. Penetranz ist der Anteil der ein Genotyp, der einen Phänotyp hat. Die prozentuale Penetranz nach folgender Formel zu berechnen:
      % Penetranz = (Mutanten mit Phänotyp) / (Gesamtanzahl der Mutanten) × 100

3. Auswahl der

  1. Wählen Sie zwei hohe Penetranz und zwei geringe Penetranz Familien für die nächste Generation. Neben Penetranz ist es wichtig, Fruchtbarkeit und Vitalität zu berücksichtigen bei der Auswahl der Familien zu propagieren; Nähere Einzelheiten dazu finden Sie unter Diskussion.
  2. Geben jedes elterlichen paar eine Sub-Lager-ID: Familie.01,.02, etc.
  3. Haus elterlichen Paare auf dem Hauptsystem mit mehreren gemischten Sex ' Begleiter ' Fisch. Begleiter-Fische können jede Zebrafisch-Zeile mit permanenten, offensichtlich Unterscheidungsmerkmale, wie z. B. veränderte Pigmentierung oder Fin-Struktur werden.
    Hinweis: Während viele Forscher erfolgreich nur Brutpaare in einem Tank halten, sind positive Ergebnisse durch die Unterbringung von Paaren mit mehrere Begleiter Fische gesehen. Diese optionale Schritt ermöglicht Brutpaare von Tieren in größeren Schulen gehalten werden und leicht abgerufen werden, so dass sie immer wieder überquert werden können, je nach Bedarf. Elterliche Paare können wiederholt überschritten werden, um voll-Geschwister Großfamilien zu generieren; warten Sie mindestens eine Woche vor der Wiederholung überqueren das gleiche elterliche paar.
  4. Cull die Larven Familien aus Schritt 2.2.2. nicht für die nächste Generation ausgewählt wurden.
  5. Beschriften Sie die Behälter mit den Wildtyp Geschwister Larven aus ausgewählten Familien mit Penetranz von mutierten Geschwister und bis zum Erwachsenenalter als normal erhöhen.
  6. Die nächste Generation müssen mindestens vier volle Geschwister Familien, zwei für die Linie nach oben und nach unten gerichtete Linie.
  7. Bei Larven geschlechtsreif, wiederholen Sie das Protokoll beginnend bei Schritt eins mit der neuen Generation.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll ist eine langfristige Haltung Technik nützlich für Verständnis Zebrafisch Skelett Mutanten (Abbildung 1). Selektiver Zucht von Nachkommen testen sollte eine Verschiebung im allgemeinen Penetranz nach unten und nach oben in ein paar Generationen (Abbildung 2) ergeben. In unserer bisherigen Arbeit fuhren zwei Runden der Zuchtauslese die durchschnittliche Penetranz nach unten von 17 % auf 3 %1

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Diskussion

Selektiver Zucht stellt Feinheiten der Genfunktion

Shifting mutierte Phänotypen um mehr oder weniger stark durch selektive Zucht ist eine einfache Möglichkeit, neue Einblicke in Genfunktion. Im Vergleich zu standard-Methoden der nicht ausgewählte Zucht kann das Protokoll hier vorgestellten ein viel umfassenderes Verständnis der mutierten Phänotypen ergeben. Insbesondere kann durch die Generierung von Stämmen, die schwere, die volle Bandbreite der mutierten Phänotypen aufgedeck...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten Chuck Kimmel für Führung, John Dowd um Hilfe bei der Entwicklung dieser Zuchtstrategie, Macie Walker für ihre Arbeit in den skelettartigen Fleck zu perfektionieren und Charline Walker und Bonnie Ullmann für hilfreiche Zebrafisch Beratung danken. Diese Arbeit wurde von K99/R00 DE024190, JTN unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Paraformaldehyd, pelletiert, festTed Pella Co.18501Pelletiertes PFA ist eine sicherere Alternative zu pulverförmigem PFA
Magnesiumchlorid, fest,Acros Organics223210010
10x PBS, wässrigesFisherBP3994
190 Proof Ethanol
Alcian Blue, festAnatech Ltd.867Muss von Anatech
Alizarin Red, festSigmaA5533-25G
Glycerin, flüssigFisherBP229 1
Wasserstoffperoxid, flüssigFisherBP263500
Kaliumhydroxid sein,   festFisherP250 500
StepOnePlus Echtzeit-PCR-MaschineAngewandte Biosysteme
MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode (0,1 mL)Applied Biosystems4346906
Microseal 'B' SiegelBioRadMSB1001
KASP Master Mix, High ROXLGCKBS-1016-022https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer MixLGCKBS-2100-100
Tris HCl, festFisherBP153 500
Kaliumchlorid, festFisherBP366 500
Tween-20, flüssigFisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
Tricain-SWestern Chemicals
Proteinase KFisherBP1700 100
T100 ThermocyclerBioRad1861096
Kontrollierter Tropfen Pasteur PipetsFisher13-678-30
NanodropThermoFisherfür die DNA-Quantifizierung
, , ,

Referenzen

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Penetranz von Zebrafisch MutantenStrategie zur Nachkommenpr fungKASP GenotypisierungsprotokollAlcianblau F rbungletale Skelettmutantenselektive Z chtungsmethodeKnorpel und KnochenanalyseVerst ndnis ph notypischer ReihenSt mme mit hoher und niedriger PenetranzErhaltung von Zebrafischlinien
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