Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Messung direkt Transfer-RNA laden Ebenen aus gereinigtem Escherichia coli RNA sowie eine Möglichkeit zum relativen Pegel der Transfer-RNA oder jede andere kurze RNA über verschiedene Proben, die basierend auf den Zusatz von Spike-im Vergleich Zellen mit dem Ausdruck eines Referenz-Gens.

Zusammenfassung

Transfer-RNA (tRNA) ist ein wesentlicher Bestandteil der translationalen Maschinen in jedem Organismus. tRNAs binden und Aminosäuren auf das übersetzen Ribosom übertragen. Die relativen Pegel der verschiedenen tRNAs und das Verhältnis der Aminoacylated tRNA, total tRNA, bekannt als den Ladezustand sind wichtige Faktoren bei der Bestimmung der Genauigkeit und Geschwindigkeit der Übersetzung. Daher sind die Fülle und Ladestation tRNAs wichtige Variablen zu messen, wenn Protein-Synthese, zum Beispiel unter verschiedenen Stressbedingungen zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ernte tRNA und direkte Messung der relativen Fülle und den absoluten Ladezustand des spezifischen tRNA-Arten in Escherichia coli. Die tRNA geerntet wird dergestalt, dass die labile Bindung zwischen der tRNA und der Aminosäure gewahrt bleibt. Die RNA wird dann Gelelektrophorese und Northern Blot, welche Ergebnisse bei Trennung von der geladenen und ungeladenen tRNAs unterzogen. Die Ebenen der spezifische tRNAs in verschiedenen Proben können durch die Zugabe von Spike-in Zellen für die Normalisierung verglichen werden. Vor der Reinigung von RNA fügen wir 5 % der E. Coli -Zellen, die die seltene tRNA^SelC zu jeder Probe zu stossen. Die Menge der tRNA-Arten von Interesse in einer Probe wird dann auf die Höhe der tRNA^SelC in der gleichen Probe normalisiert. Zugabe von Spike-in Zellen vor RNA-Reinigung hat den Vorteil gegenüber Zusatz von gereinigtem Spike-in RNAs, die es auch Unterschiede in der Zelle Lyse Effizienz zwischen Proben ausmacht.

Einleitung

Im folgenden präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung der spezifische tRNAs und Messung ihrer Aufladung von Nordbeflecken Ebenen. Die Methode basiert auf einer Technik, die zuerst von Varshney Et Al. entwickelt ¹. durch Ernten von Zellen in Säure Trichloressigsäure (TCA) und halten die Proben bei 0 ° C während die RNA-Reinigung, die Esterbindung zwischen der tRNA und der Aminosäure ist konservierte^2,3,4. Aminoacylated tRNAs unterschieden werden von ihren Nonacylated Pendants durch Gelelektrophorese und Nordbeflecken, zurückzuführen au....

Protokoll

1. Vorbereitung der Bakterienkulturen.

1. Wachsen alle Kulturen in Erlenmeyerkolben mit einer Kultur/Kolben-Volumen-Verhältnis von höchstens 1/6. In einem typischen Versuchsaufbau zu wachsen, die Kulturen bei 37,0 ° C und schütteln mit 160 u/min in Morpholinepropanesulfonic Säure (MOPS) minimale mittlere ¹⁸ ergänzt durch die bevorzugte Kohlenstoffquelle, z. B. 0,2 % Glukose, für mindestens 10 aufeinander folgenden Generationen vor der RNA Ernte.
2. Am Vortag RNA Ernte verdünnen eine entwachsen Kultur der gewünschten Sorte in MOPS minimaler Medium in einer Weise, die gewünschte OD ₄₃₆ zum gewünschten Zeitpunkt am nächs....

Ergebnisse

Mithilfe des Verfahrens beschrieben hier, die Fülle und Aufladen der drei tRNAs in E. Coli k-12 vor und während der Aminosäure Hunger gemessen wurden.

Die Arginin-Auxotroph Stamm NF915⁴ (Thr Leu seinen ArgH Thi Mtl supE44) wurde zum mindestens zehn Generationen im MOPS minimaler Medium ergänzt mit 0,4 % Glycerin, 50 µg/mL Threonin, Leucin, Arginin und Histidin 5 µg/mL bei 37 ° C Schüttel.......

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie gleichzeitig messen Sie den Ladezustand des spezifischen E. Coli tRNAs und vergleichen Sie die relativen Pegel der tRNAs in verschiedenen Proben. Die kritischen Punkte des Protokolls sind 1) die Proben so zu behandeln, dass die zelluläre tRNA Ladestation Ebenen beibehalten werden, 2) tRNA Mengen so normalisieren, dass relative tRNA-Ebenen in verschiedenen Proben zuverlässig verglichen werden können, und (3) die sp zu gewährleisten, Ecificity der ausgewählten Sonden für die tR.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Harnstoff	Merck	57-13-6	Reinheit >99%
Polyacrylamid	Serva	79-06-7
Bis (N,N'-Methylen-bis-acrylamid)	BIO-RAD	161-0201
Trichloressigsäure (TCA)	Sigma	76-03-9
Phenol	Merck	108-95-2
IPTG
Glukose
Natriumacetat,
EDTA
Ethanol
Tris
, Salzsäure
, Natriumchlorid
NaH2PO4
Natriumcitrat
SDS
Hering Sperma DNA	Sigma	100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidon
Ficoll
P32 & gamma; ATP	Perkin Elmer
DNA-Oligos (Sonden)	TAG Copenhagen
Hybond N+ Membran	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Elektroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Spektralphotometer
Hydridisationsofen
Geiger-Mü Röhrchen
Phosphor-Imager-Sieb	GE Healthcare
Hybridisierungsröhrchen
Kulturflaschen
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen
20 ml Zentrifugenröhrchen
Name	Unternehmen	Katalognummer	<>Kommentare
Software
ImageQuant	GE Gesundheitswesen
Excel	Microsoft

, , , ,