Schaffung einer dichten Transposon Insertion Bibliothek verwenden bakterielle Konjugation in Enterobacterial Stämme wie Escherichia Coli oder Shigella flexneri

Summary

Präsentiert hier ist eine einfache Methode zum Erstellen einer High-Density Transposon Einfügung Bibliothek in Escherichia coli oder Shigella Flexneri mit bakteriellen Konjugation. Dieses Protokoll ermöglicht die Erstellung einer Sammlung von Hunderten von Tausenden von einzigartigen Mutanten in Bakterien durch die zufällige genomische Einfügung ein Transposon.

Abstract

Transposon Mutagenese ist eine Methode, die gen Störung über die zufällige genomische Einfügung eines Stückes DNA genannt ein Transposon ermöglicht. Das folgende Protokoll beschreibt eine Methode zur Übertragung hoher Wirkungsgrad zwischen Bakterienstämme ein Plasmid beherbergen ein Transposon, enthält eine Kanamycin-Resistenz-Markierung. Plasmid-borne Transposase wird durch ein variant Tnp -Gen kodiert, die das Transposon in das Genom der Empfänger Sorte mit sehr niedrigen insertional Bias einfügt. Diese Methode ermöglicht die Erstellung von großen mutierten Bibliotheken, in denen Transposons in einzigartige genomische Positionen in einem Empfänger entweder Escherichia coli oder Shigella Flexneri Bakterienstamm eingefügt wurden. Mithilfe von bakterielle Konjugation, im Gegensatz zu anderen Methoden wie Elektroporation oder chemische Umwandlung können große Bibliotheken mit Hunderttausenden von einzigartigen Klone erstellt werden. Dies ergibt High-Density-Einfügung Bibliotheken mit Einfügungen auftreten so häufig wie alle 4-6 Basenpaare in unwesentliche Gene. Diese Methode ist besser als andere Methoden, da es eine kostengünstig, einfach zu bedienen und hohe Effizienz-Methode für die Erstellung einer dichten Transposon-einfügen-Bibliothek ermöglicht. Die Transposon-Bibliothek verwendet werden, in downstream-Anwendungen wie z. B. Transposon Sequenzierung (Tn-Seq), genetische Interaktion Netze ableiten oder einfacher, in seiner (nach vorne genetische) Bildschirme.

Introduction

Die Erstellung von Transposon Mutagenese Bibliotheken in Bakterien eignet sich für eine Vielzahl von Anwendungen, von Entdeckungen der Virulenz Gene in bakteriellen Krankheitserregern^1,2, bis hin zu Studien von wesentlichen Gene^{3, 4 , 5 , 6}, zur Identifizierung der genetischen Interaktion Netze^7,8,9. Entscheidend für diese Studien ist die Fähigkeit, eine große Bibliothek von Mutanten zu erstellen. Die Verwendung von Transposons (kurze Abschnitte der DNA, die nach dem Zufallsprinzip in einem Genom einfügen) ist ein einfaches Mittel der Genfunktion, stören, wie das Einfügen von einem Transposon innerhalb der offenen Leserahmen oder regulatorischen Region eines Gens oft die Funktion oder der Ausdruck stören des Gens.

Hier ist eine Methode für die Erstellung einer Transposon-Bibliothek in E. Coli oder S. Flexneri durch bakterielle Konjugation mit dem Plasmid pJA1¹⁰. Es gibt zwei wesentliche Vorteile bei der Verwendung dieses Plasmid. Der erste Vorteil ist, dass die Variante der Tn10 Transposase von pJA1 Plasmid ausgedrückt induzierbaren und tief inserierender Bias^{11,12 hat}, was bedeutet, dass das Transposon wird nach dem Zufallsprinzip in das Genom zu integrieren wenn Isopropyl Β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) wird den Medien hinzugefügt. Das Transposon enthält einen Kanamycin Widerstand Marker, so dass für die Auswahl von Mutanten mit den Transposon-Einsätzen in das Chromosom des Empfängers Stamm. Der zweite Vorteil des Plasmids pJA1 ist, dass es einen R6K mutierte Ursprung der Replikation enthält. Die R6K mutierte Herkunft der Replikation erfordert das Lambda- Pir -gen in Reihenfolge für die Aufrechterhaltung der Plasmid-¹³. Wie das Plasmid in Pir - Stämmen nicht replizieren kann, wird es in der Empfänger-Belastung (Abbildung 1) verloren. Dies sorgt dafür, dass Tn10 Transposase aus der Zelle entfernt wird und nicht mehr aktiv ist, reduzieren weitere Mutationen nach der ersten Umsetzung Veranstaltung.

Die Verwendung der bakteriellen Konjugation, pJA1-Plasmid aus dem Spender-Stamm der Empfänger Dehnung zu bewegen ist aus mehreren Gründen vorteilhaft. Konjugation ist einfach und kostengünstig durchführen und benötigt keine spezielle Ausrüstung wie ein Electroporator. Die hohe Effizienz der bakteriellen Konjugation ermöglicht darüber hinaus eine sehr große Bibliothek (> 2 x 10⁵ einzigartige Insertionen) mit nur wenige Milliliter (mL) über Nacht Bakterienkultur⁶erreicht werden. Der Vorgang dauert ca. zwei Stunden Handhabungszeit zusammen mit Zeit für die Inkubation und das Wachstum der Bakterien. Langridge Et al. ¹⁴ berichtet 130 Electroporations durchführen, erstellen Sie eine Transposon Mutagenese Bibliothek eine Größe ähnlich der hier beschriebenen⁸, die mit einem einzigen Konjugation erreicht wird. Die Verwendung von 130 Electroporations erfordert Arbeit intensive und zeitaufwendige Vorbereitung der Electrocompetent Zellen und die Verwendung von vielen teuren Materialien (z.B. Elektroporation Küvetten), zu einem Preis von mehr als 1.000 US-Dollar in Verbrauchsmaterialien allein. Andere Studien¹⁰ habe ähnliche Methoden, aber mit verschiedenen Bakterienstämmen und erreicht weit kleinere Bibliothek Größen (5 x 10⁴ Kolonie bildende Einheiten) als hier berichtet.

Notizen auf dem Spender-Stamm: die hier verwendete Spender-Stamm ist der E. Coli -Stamm BW20767¹⁵ mit pJA1 Transposon Plasmid¹⁶. Stamm BW20767 kann zu anderen Stämmen Konjugat die Überweisung des Plasmids pJA1 höchst effizient. Auch wichtig ist, ist BW20767 Lambda Pir +. Wie bereits erwähnt, kann das Plasmid pJA1 nur in Stämmen mit der Lambda- Pir -gen einzuhalten. Diese Sorte ist Kanamycin und Ampicillin resistent. Das pJA1-Plasmid enthält die Ampicillin-Resistenz-Markierung, und eine Kanamycin-Resistenz-Markierung befindet sich innerhalb der Transposon. Diese Sorte wächst mit Auswahl auf dem Plasmid mit Ampicillin bei 100 µg/mL. Es ist auch erwähnenswert, dass andere Stämme beherbergen konstitutiv ausgedrückt Transposase Gene bekannt sind zu instabil, und während die Transposase verwendet hier unter induzierbaren steuern, besteht ein geringes Risiko einer undichten Ausdruck. Aus diesem Grund wird vorgeschlagen, dass im Laufe dieser Sorte minimiert werden und eine frische Streifen aus einer gefrorenen Kultur für jedes neue Bibliothek Vorbereitung getroffen werden. Die hier verwendete Spender-Stamm ist von unserem Labor auf Anfrage zur Verfügung.

Notizen auf dem Empfänger-Stamm: die Empfänger Belastung kann eine Belastung der Wahl, z. B. Labor K12-abgeleitete Stämme von E. Coli oder Stämme von S.flexneri (siehe auch Diskussion). Die Empfänger Belastung muss eine zusätzliche Antibiotikaresistenz Symbol, das sich nicht Kanamycin-Resistenz haben, so dass gegen die Spender-Belastung ausgewählt werden kann. Für die Empfänger Belastung dient hier eine E. Coli -MG1655-Stamm mit einem eingeführten spontane Nalidixic Säure-Mutation. Die spontane Nalidixic Säure-Mutante wurde durch Plattieren, 2 mL der Nacht Kultur in 200 µL-Aliquots auf Teller mit Nalidixic Säure 30 µg/ml ausgewählt. Ein einziger Klon des MG1655 wurde ausgewählt, die resistent gegen Nalidixic Säure zu den Empfänger Belastung geworden war. Darüber hinaus muss die Empfänger Belastung Lambda Pir negativ sein, wie oben beschrieben.

Übersicht: Sobald bakterielle Konjugation stattgefunden hat und das Plasmid pJA1 hat der Empfänger Stamm aus dem Spender-Stamm bezog, wird die Zugabe von IPTG an die Medien die Expression des Gens Tnp , induzieren, die unter Kontrolle des IPTG-induzierbaren ist LacIq/Ptac Förderer (Abbildung 1). Die Tnp -gen auf pJA1 ist eine mutierte Transposase hat eine geringere Häufigkeit von einfügen bei Hot-Spots^6,10,11. Bei der Addition und Induktion mit IPTG ist das Transposon aktiviert und nach dem Zufallsprinzip eingefügt in das Genom. Das Plasmid kann in der Lambda-Pir-Empfänger Belastung nicht gepflegt werden und geht verloren.

Protocol

Vorsicht: Wenn S. Flexneri als ein Empfänger Stamm, Bitte beachten Sie, dass S. Flexneri ist ein menschlicher Erreger, die Magen-Darm-Krankheiten verursachen können. Experimente mit S. Flexneri müssen mit geeigneten biologischen Vorsichtsmaßnahmen (BSL-2 in Europa und USA oder PC2 in Neuseeland bezeichnet) durchgeführt werden. Alle Experimente, die im Zusammenhang mit diesem Protokoll Video fertig waren mit der gut-gekennzeichneten Empfänger Stamm von nicht-pathogenen E. Coli MG1655 inmitten der PC1. Arbeit mit Shigella Flexneri wurde zuvor in einem Labor BSL-2 am Biozentrum in Basel durchgeführt, wie beschrieben in ⁶.

Hinweis: das folgende Experiment ist doppelt wirksam gemacht. Der erste Teil (Schritt 1.1 - Schritt 4.5) wird durchgeführt, um die besten Verdünnung für Beschichtung der Bibliothek, herauszufinden, wo das Ziel ist einer Verdünnung der Konjugation die vielen einzelnen Kolonien pro Platte, aber nicht so viele, die gibt eine Rasen-Formen zu finden. Dies soll Wettbewerb zwischen Mutanten mit deutlich reduzierten Fitness und solche mit robuster Fitness zu reduzieren. Der zweite Teil (Schritte 5.1-7,4) ist die Erstellung der endgültigen Bibliothek, wo viele Platten sind der entsprechende Verdünnung der Bibliothek verteilt.

1., bereiten Sie ein Tag vor dem Experiment

1. Impfung, aus einem gefrorenen bestand, die Spender-Belastung in 2 mL LB Brühe, Millers Rezept (NaCl bei 10 g/L) Medien mit Ampicillin bei 100 µg/mL. Die hier verwendete Spender-Stamm ist der E. Coli-Stamm BW20767 ¹⁵ pJA1 Plasmid ¹¹ beherbergen. Die Verwendung von Ampicillin behält Auswahl für das Plasmid pJA1.
2. Impfung, eine einzige Kolonie oder gefrorenen Lager, der Empfänger Stamm in 2 mL LB Medien mit einem Widerstand Marker als Ampicillin oder Kanamycin. Die hier verwendete Empfänger Stamm ist E. Coli " Wildtyp " Stamm MG1655 ^{17 , 18} mit einem spontanen Widerstand Mutante zu Nalidixic Säure. Er wächst in 30 µg/mL Nalidixic Säure.
3. Bereiten 20 Luria Brühe mit 1,5 % Agar-Platten (in 90 mM Petrischalen, ca. 12,5 mL). Agarplatten fehlt Antibiotikum können mehrere Monate bis zur Verwendung bei 4 ° C gelagert werden.
4. Bereiten 20 Luria Brühe mit 1,5 % Agar-Platten (in 90 mM Petrischalen, ca. 12,5 mL) enthält sowohl Nalidixic Säure 30 µg/ml und Kanamycin 50 µg/ml (LBA Nal30 Kan50). Agarplatten mit Antibiotika können mehrere Monate bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden.
5. Bereiten Sie 200 mL sterile LB Medien. LB Medien können für mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
6. 1 mL 100 mM steril bestand von IPTG, laut Hersteller bereiten ' Anweisungen s.

2. Bakterielle Paarung oder Konjugation

1. Zentrifuge 1 mL der Nacht Kultur der Spender Belastung für 1 Minute bei 14.000 x g bei Raumtemperatur. Wachstumsmedium zu verwerfen. Dieser Schritt ist getan, um alle Wachstumsmedien Antibiotika-haltigem entfernen.
2. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 110 µL LB (nicht mit Antibiotika), damit die Konzentration der Kulturkreis.
3. Mit steriler Pinzette, positionieren Sie einen sterilen Nitrozellulose-Filter (alternativ ein steriles Stück Löschpapier kann verwendet werden, finden Sie unter Materialien Liste) auf die Mitte eines LBA-Platte (nicht mit Antibiotika). Beschriften Sie die Platte " Negativkontrolle: Spender ".
4. Mit einer Pipette 50 µL der konzentrierten Spender Kultur auf den Filter fallen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-4 für den Empfänger Sorte, Kennzeichnung der Plattenrandes " Negativkontrolle: Empfänger. "
6. Für die Bibliothek fallen 50 µL der Spender (ab Schritt 2.2) und 50 µL der Empfänger Belastung (aus Schritt 2.5) auf einem einzigen Sterilfilter für eine LBA-Platte (diese Platten sollten keine Antibiotika enthalten). Beschriften Sie diese Platte " Bibliothek. " Paarung tritt auf, weil der Spender und der Empfänger in engen Körperkontakt auf dem Filter werden.
7. Legen Sie die Agarplatten mit Filter bei 37 ° C für 6 h.

3. Aktivierung des pJA1 Transposon durch IPTG Induktion von der Transposase

1. bereiten drei 15 mL konische Ampullen mit 2 mL LB mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM (d. h. 20 µL 100 mM Lager von IPTG). Beschriften Sie jeden: Spender Control Empfänger Kontroll- und Bibliothek.
2. Die Platten entfernen aus dem Inkubator nach 6 h Wachstum bei 37 ° C (aus Schritt 2.4). Einige Bakterienwachstum auf dem Filter sichtbar sein soll.
3. Mit steriler Pinzette, die Spender über das Filterpapier herausgenommen und legen Sie sie in der 15 mL konische Durchstechflasche Spender Kontrolle (aus Schritt 3.1) beschriftet. Machen Sie dasselbe für die Empfänger Kontrolle und Bibliothek.
4. Tippen Sie auf die Rohre um das Filterpapier an der Unterseite des konischen 15 mL Fläschchen und sicherzustellen, dass es vollständig in lb untergetaucht ist
5. Röhren Vortex für mindestens eine volle Minute hoch, die Bakterien aus der Nitrozellulose-Filter zu distanzieren. Die LB sollte trüb mit Bakterienzellen ( Abbildung 2).
6. Platte mit sterilen Glasperlen oder einer sterilen Streuer 200 µL der verwirbelt Bakterien Suspension aus dem Spender-Steuerelement auf LBA Nal30 Kan50 Teller mit der Bezeichnung " Spender Kontrolle, 200 µL ".
7. Wiederholen Sie die Schritte oben (3.6) für das Empfänger-Steuerelement Beschriftung der Platten " Empfänger Kontrolle, 200 µL ".
8. Wiederholen Sie die Schritte oben (3.7) für die Bibliothek, Kennzeichnung der Platten " Bibliothek, 200 µL ".
9. Stellen weitere Verdünnungen (d.h., 1:5, 01:10 und 1: 100 Verdünnung mit LB nicht mit Antibiotika als ein Verdünnungsmittel) der Bibliothek. Platte 200 µl unverdünnte Bibliothek und weitere Verdünnungen auf passend bezeichnet LBA Nal30 Kan50 Platten.
10. Ort-Platten in der 37 ° C Inkubator für 18 h Klone mit Transposons eingefügt in einem gen, das einen großen Verlust der Fitness verursacht kann länger dauern, zu wachsen und auf der Platte erscheinen. Es sollte eine Vielzahl von Kolonie Größen ( Abbildung 3). Spender und Empfänger Stamm Platten sollten keine Kolonien auf sie haben.

4. Wählen Sie die entsprechende Verdünnung der Bibliothek für die endgültige Mutant-Bibliothek verwendet werden

1. bestimmen, die eine Verdünnung der Bibliothek von Schritt-3.9, die vielen Kolonien in verschiedenen Größen, die Erträge sind ausreichend Abstand. Ziel ist es, möglichst viele Kolonien wie möglich auf einer Platte, aber nicht so viele bekommen, dass die Kolonien ineinander und um Ressourcen konkurrieren. Diese Zahl sollte ca. 500-2.000 Kolonien pro Platte. Ein Beispiel für entsprechende Kolonie dichten auf einem Teller ist in Abbildung 3.
2. Erfassen die Anzahl der Kolonien auf den Platten.
3. Berechnen Sie die Frequenz der Konjugation (die Anzahl der Conjugants pro Empfängerzelle). Dies sollte im Bereich von 1 x 10 ^-4 bis 1 x 10 ^{-6 19}.
4. Bestimmen die Anzahl der Mutanten, die in der endgültigen Bibliothek basierend auf nachgelagerte Anwendungen gewünscht. Viele Anwender benötigen lediglich eine Bibliothek mit möglichst viele Mutanten wie möglich. Um möglichst viele Transposon Einschübe als theoretisch möglich zu erzeugen (eine Einfügung jedes Basenpaar), ungefähre anstrebenLy die gleiche Anzahl von Kolonien als Basenpaare im Genom (d.h., ~4.5 X 10 ⁶ für E. Coli) das Genom vollständig mit allen möglichen Transposon Einfügungen zu sättigen. Es ist wichtig zu beachten, viele Mutanten beherbergen Einfügungen in ätherischen oder funktionell wichtige Gene werden möglicherweise nicht wiederhergestellt werden, da diese Mutationen an den Empfänger tödlich sein werden.
5. Berechnen, wie viel Volumen der ursprünglichen Bibliothek benötigt wird, um eine Bibliothek der gewünschten Größe zu erstellen. Beispielsweise ist die gewünschte Bibliotheksgröße 5 x 10 ⁴ Mutanten. Die Verdünnung mit dem besten Abstand der Kolonien von Schritt 3.9 war 200 µL einer 01:10 Verdünnung. Die Anzahl der Kolonien auf diese Platte wird voraussichtlich etwa 2.000 Kolonien. 5 x 10 ⁴ Mutanten werden benötigt und jede Platte hat 2.000 Kolonien, dann 25 Platten benötigt werden, bei dieser Verdünnung.

5. Erstellung der endgültigen Mutant Bibliothek

1. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3.8, Anpassung der Anzahl der Platten bei Schritt 1.4 nach Bedarf (siehe Schritt 4,4).
2. Bei Schritt 3,9, Platte die Verdünnung in Schritt 4.1 auf so viele Platten wie notwendig, um die Bibliothek der gewünschten Größe erstellen ausgewählt (siehe Punkt 4.4).

6. Bibliothek-Dichte zu schätzen

1. zählen, wie viele Kolonien gibt pro Platte und erhalten dabei eine grobe Schätzung, wie dicht die Bibliothek ist. Zum Beispiel: insgesamt 2 x 10 ⁵ Kolonien sind vergoldet. Das E. Coli MG1655 Genom ist etwa 4,5 x 10 ⁶ Basenpaaren. Daher, eine Bibliothek mit ca. 2 x 10 ⁵ bedeutet, dass es eine Einlage im Durchschnitt fügt jeder 22 Basenpaaren und, dass jedes Gen etwa 45 mal mutiert werden sollen, gegeben, dass ein Gen ist ca. 1 x 10 ³ Basenpaare. Einfügungen in wesentlichen Gene dürften in dieser Bibliothek sehr unterrepräsentiert sein, und somit die Dichte in unwesentliche Gene ist größer als diese sein. Diese Art der Berechnung liefert eine breite Schätzung der Transposon Dichte.

7. Bündelung von Transposon-Bibliothek und Lagerung

1. nach Auszählung Kolonien, hinzufügen 1 mL LB (oder mehr, je nach Bedarf) die Bibliothek-Platte und eine sterile Streuer abkratzen Bakterien von der Platte. Entfernen Sie die Bakteriensuspension zu und in ein 50 mL oder 15 mL konische Fläschchen. Wiederholen Sie für alle Platten.
2. Vortex die zusammengefassten Bakterien Aufhängung für eine volle Minute um die Aussetzung zu homogenisieren.
3. Eine Endkonzentration von 20 % sterile Glycerin hinzufügen.
   1. Einfach nachwachsen 100 x 20 µL Aliquots in 0,25 mL Tuben vorbereiten.
   2. Bereiten Sie mindestens zwei oder mehr 1 mL aliquoten in Cryovials.
4. Speichern alle Aliquote bei-80 ° C

Results

Nach 18 Stunden des Wachstums sollten Platten enthalten viele Kolonien mit einer Vielzahl von Größen der Kolonie (Abbildung 3). Verschiedenen Kolonie Größen Klone von unterschiedlichem Fitness zeigen, und sind ein gutes Zeichen, die das Protokoll gearbeitet hat. Die Spender und Empfänger Kontrollen sollte kein Wachstum auf dem Teller haben. Unter Verwendung des oben genannten Protokolls sollte weit über 2 x 10⁵ Kolonie bildende Einheiten (KBE) ergeben. Das Protokoll fünf replizieren Konjugationen gleichzeitig skalieren sollte ca. 1 x 10⁶ KBE ergeben. In früheren Arbeiten, Analyse mit der Sequenzierung der nächsten Generation darauf hingewiesen, dass eine skalierte, Bibliothek ergeben sollte > 2 x 10⁵ einzigartige Einfügungen⁶. Bei sehr hohen KBE (d.h., 1 x 10⁶ KBE) dürfte sich die Rate der einzigartigen Einfügungen Plateau, wie alle verfügbare (nicht tödliche) Einfügungen dargestellt werden.

Abbildung 1 : Bakterielle Konjugation und Einfügung von Transposon in das Chromosom schematische. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Bild von Filtern eingetaucht in LB Medien vor und nach dem aufschütteln. Vor vortexen Zellen stecken auf den Filter und die Medien ist klar. Nach dem aufschütteln trübe die Medien, wie Zellen aus dem Filter gekommen und sind in den Medien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : (A) repräsentative Platte Transposon-Bibliothek nach 18 Uhr des Wachstums. (B) Großaufnahme der Kolonie Größen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht den Bau einer dichten einfügen-Bibliothek. Diese Methode ermöglicht die Erstellung einer Transposon-Bibliothek mit mehr als 2 x 10⁵ einzigartige Transposon Mutanten mit unter 5 mL Kultur Band⁶. Es ist relativ einfach durchzuführen, Reagenzien zur Verfügung in den grundlegendsten Mikrobiologie-Labors verwendet, ist skalierbar und erfordert wenig teure Ausrüstung oder Verbrauchsmaterialien wie Electroporation Küvetten.

Ein signifikanten Vorteil dieser Methode ist, dass in der Theorie, der Benutzer breiten Spielraum bei der Wahl der enterobacterial Empfänger Stämme hat. Das Papier, sowie andere¹¹, E. Coli als ein Empfänger Belastung verwenden, aber das pJA1 Plasmid erfolgreich mit anderen enterobacterial Empfänger Arten wie Shigella Flexneri⁶ und Salmonella Enterica verwendet worden ist Serovar Typhimurium Stamm SL1344¹⁰. Theoretisch ermöglicht der γ-Ursprung der Replikation (Ori_R6Kγ) in pJA1 dieses Plasmid gepflegt werden, in eine breite Vielzahl Bereich¹⁹, ermöglicht, dass der Empfänger Stamm ist Pir +. Vor kurzem wurden neue Methoden beschrieben, die für den Bau des Pir + in einer Reihe von enterobacterial Stämmen²⁰, was zusätzliche Flexibilität ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht der300 Basenpaare Mob -Region von RP4 Plasmid in pJA1 konjugative Übertragung dieses Plasmid auf eine Vielzahl von Gram-negativen Bakterienstämme-¹⁹. Einfach ausgedrückt: Diese Methode könnte theoretisch verwendet werden mit einer Vielzahl von Empfänger Stämme, solange mehrere Bedingungen erfüllt sind: der Stamm ist Pir+, und ist mit einer Antibiotika-Resistenz als Kanamycin und als Spender Belastung gekennzeichnet.

Ein entscheidender Schritt im Protokoll liegt bei der Schätzung der richtigen Anzahl von Zellen, die Sie im Schritt 4.1 Platte. Wenn Kolonien zu eng angeordnet sind, sie konkurrieren um Nährstoffe auf den Teller und weniger Fit Mutanten outcompeted. Dies führt zu einem Rückgang der Gesamtzahl der durch Mutation entstehende Variationen. Alternativ wenn Kolonien angeordnet sind zu weit auseinander, es werden zu wenige Kolonien auf der Platte, und die Gesamtzahl der Agarplatten benötigt, um eine große Bibliothek zu erreichen wird beschwerlich. Daher ist es wichtig, die richtige Balance in Bezug auf die Kolonie zahlen pro Platte.

Es ist wichtig, dass die Steuerelemente aufgeführt im Protokoll um sicherzustellen, dass die Schritte wie beschrieben funktionieren. Vor allem, wenn Nalidixic Säure als Counter Auswahl gegen die Spender-Stamm verwenden, ist es wichtig sicherzustellen, dass die negative Spender Steuerplatten Kolonien sind. Dies ist, da es möglicherweise eine niedrige Rate (ca. 1 x 10^-10)²¹ der spontanen Widerstand gegen Nalidixic Säure, wodurch Fehlalarme. Die Rate der Konjugation und Umsetzung ist in der Regel ca. 2 x 10^{-4 19}. Daher ist die Rate der Konjugation und Umsetzung mehrere Größenordnungen größer ist als die Rate der spontanen Widerstand gegen Nalidixic Säure. Daher die Rate falsch positiver Ergebnisse im Vergleich zu echten Umsetzung Veranstaltungen ist sehr gering und unbedeutend erachtet, wenn das Protokoll arbeitet. Jedoch wenn Preise der Konjugation oder Umsetzung deutlich, (aus/niedrige Paarung Effizienz oder fehlender Induktion des Gens Transposase mit IPTG reduziert werden) und das Protokoll hochskaliert zu kompensieren dies, dann die Anzahl der Fehlalarme (Klone, die haben Sie nicht das Transposon eingefügt) kann auch erhöhen.

Einige Änderungen können zu Inkubationszeiten in Schritte 3.2 und 3.10 erfolgen. Schritt 3,2 Staaten, die Konjugation für 6 h auftreten sollte, aber nach unserer Erfahrung dieser Zeitschritt werden kann (d.h., 4-7 h) ohne Änderung der Ergebnisse erheblich variiert. Darüber hinaus kann im Schritt 3.10, die Länge der Zeit, die die Kolonien auf den Agarplatten bebrütet werden auch angepasst werden. Dies kann je nach dem Durchschnitt Verdoppelung Zeit oder Wachstum Rate der Empfänger Belastung variiert werden. Darüber hinaus ergab 18 h in unserer Erfahrung, eine Vielzahl von Größen der Kolonie, zeigt eine Sammlung von diversen Fitness. Jedoch Kolonien mit stark reduzierten Fitness können länger dauern, zu wachsen und somit möglicherweise nicht sichtbar nach 18 Uhr. Wenn diese Methode verwendet wird, um die Klone von extrem reduzierten Fitness zu finden, können längere Inkubationszeiten und weniger Kolonien auf der Platte zu drängen (d. h., 48 h, 50-300 Kolonien) verwendet werden.

Weitere Fallstricke dieser Methode enthalten, die es nicht möglich ist, einen Empfänger Stamm zu verwenden, der bereits Kanamycin resistent ist. Es kann möglich zu tauschen die Kanamycin Resistenz Markierung in das Plasmid pJA1 für eine alternative auswählbaren Marker wie Chloramphenicol Widerstand, diese Hürde zu überwinden sein. Es kann auch erwähnenswert, dass in der Theorie es möglich ist, einen Empfänger Stamm zu verwenden, die Ampicillin resistent sein, als die pJA1 Plasmid enthält die Ampicillin-Resistenz-Markierung verloren kurz nach der Umsetzung.

Die Schaffung einer dichten Transposon-Bibliothek in den genetischen Hintergrund der Wahl ist potenziell vorteilhaft für viele downstream-Anwendungen. Beispielsweise könnte eine Dichte Transposon-Bibliothek verwendet werden, um auxotrophe Mutanten mit Replik Überzug²² zu identifizieren oder um Mutanten zu identifizieren, die bei der Errichtung einer Infektion^1,2defekt sind. Vor kurzem, wie DNA-Sequenzierung Kosten gesunken sind und neue Technologien wie z. B. Sequenzierung der nächsten Generation geworden alltäglich, Transposon-Bibliotheken werden mit tiefen DNA-Sequenzierung Einblick in gen Wesenheit, Genfunktion, und genetische Interaktionen. Einige dieser Methoden werden in ²³ überprüft und beinhalten Methoden wie unter der Regie von Transposon einfügen Website Sequenzierung (TraDIS), Transposon Sequenzierung (Tn-Seq), Hochdurchsatz-Insertion tracking durch tiefe Sequenzierung (HITS) und Sequenzierung () einfügen INSeq). Diese nachgelagerten Methoden beruhen auf den Bau von dichten Transposon Einfügung Bibliotheken. Während andere Vektoren müssen für bestimmte nachgeschaltete Methoden verwendet werden, Überblick das hier beschriebene Protokoll einen die hervorstechenden Verfahrensfragen zu folgen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,45 Mikron Nitrozellulosefilter (steril)	Millipore	HAWP02500	Alternativ kann Löschpapier verwendet werden (siehe unten)
Löschpapier in ~ 1 Zoll Kreise schneiden, dann autoklavieren/in Folie sterilisieren. Es gibt keinen Unterschied in der Effizienz zwischen den Nitrozellulosefiltern und dem Löschpapier	GE life Sciences: Produktklasse 3MM Chr Löschpapier, Bogen, 46 & mal 57 cm	3030-917	Alternativ können Nitrocellose-Filter verwendet werden (siehe oben)
Metallzange, steril	VWR/Global Science New Zealand	MURRE009/01
Petrischale, steril, 90 mm Durchmesser, 68 mL Volumen,   12,5 mL Arbeitsvolumen.	Interlab New Zealand	2303-1090
Sterile Glasspreizer	VWR/Global Science New Zealand	NZNZSPREADER	Alternativ können sterile Glasperlen zum Verteilen von Kulturen auf Platten verwendet werden (siehe unten)
Sterile Glasperlen	VWR/Global Science New Zealand	HERE1080603	Alternativ kann ein steriler Glasstreuer zum Verteilen von Kulturen auf Platten verwendet werden (siehe oben)
Nalidixinsäure (optional)	GoldBio.com	N-015-250
Ampicillin-Natriumsalz BioChemica	VWR/Global Science New Zealand	APLIA0839.0025	gemäß Herstellerempfehlung
herstellen Kanamycinsulfat BioChemica VWR	/Global Science New Zealand	APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid)	Thermofisher New Zealand	FMTR0393
Difco Agar granuliert	Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand	214530
Luria Bouillon Base (Miller's LB Broth Base)	Thermofisher	12795-084
Glycerol bidilled 99,5 %	VWR/Global Science New Zealand	VWRC24388.320
15 ml Polypropylen sterile konische Fläschchen	VWR/Global Science New	Zealand CORN430791
Mikrozentrifugenröhrchen, flacher Deckel, 1,7 ml, ultraklares PP, graduiert, autoklavierbar und gefrierbar	VWR/Global Science New Zealand	AXYGMCT-175-C
50 ml Zentrifugenröhrchen, Falcon, PP, konisch, mit gedruckter Graduierung, mit flachen Schraubverschlüssen, steril	VWR/Global Science New Zealand	BDAA352070
Name	Company	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstung
Inkubator im 37C
Autoklaven zum Sterilisieren von Medien